海藻糖氧钒对小鼠胃肠道的氧化损伤以及Vc和GSH的抗氧化保护作用

第39卷第6期2018年11月西安交通大学学报(医学版)J o u r n a l o f X i a n J i a o t o n g U n i v e r s i t y(M e d i c a l S c i e n c e s)V o l.39N o.6N o v.2018h t t p://y x x b.x j t u.e d u.c nҖ基础研究Җ海藻糖氧钒对小鼠胃肠道的氧化损伤以及V c和G S H的抗氧化保护作用魏倩,MUH AMMA D Um a r,姜苹哲,李晓丹,刘奇奇,邢曙光,罗文亚,杨星楷,李明刚(南开大学生命科学学院,天津300071)摘要:目的探讨海藻糖氧钒(V T)对小鼠胃肠道的氧化应激损伤㊁G S H/G S T s通路基因表达的影响以及维生素C (V c)和还原型谷胱甘肽(G S H)的保护作用㊂方法30只雄性昆明小鼠随机分组:V T组(B组)㊁V c+V T组(C组)㊁G S H+V T组(D组)㊁V c+G S H+V T组(E组),每天灌服V T(125m g/k g),而正常对照组(A组)灌服等量生理盐水,V c和G S H在V T给药前1h灌服,连续15d㊂取各组小鼠胃和十二指肠,D T N B法测定G S H含量,谷胱甘肽氧化法测定谷胱甘肽过氧化物酶(G S H-P x)活力,实时荧光定量P C R法检测G S H/G S T s通路相关基因G C L C㊁G S S㊁G S R和G S T p i的表达㊂结果 V T组胃㊁十二指肠的G S H含量㊁G S H-P x活性及G C L C㊁G S S㊁G S R和G S T p i的表达均低于A组(P<0.05)㊂C㊁D㊁E组各指标显著提高,但仅E组小鼠胃组织的指标恢复到正常对照组水平㊂C组和D组除十二指肠中G S R表达显著差异外,其余指标差异均无统计学意义㊂结论灌服V T对小鼠胃肠道产生一定的氧化应激损伤,并可影响G S H含量和G S H-P x活性以及G S H/G S T s通路相关基因的正常表达㊂外源补充V c㊁G S H及两者联用有一定的抗氧化保护作用,降低了V T的毒性,且两者联用的效果更优,使胃中的相关指标达到正常水平㊂关键词:海藻糖氧钒(V T);氧化应激;G S H/G S T s;维生素C(V c);还原型谷胱甘肽(G S H)中图分类号:R57文献标志码:AD O I:10.7652/j d y x b201806008V a n a d y l t r e h a l o s e-i n d u c e d o x i d a t i v e s t r e s s i n m o u s e g a s t r o i n t e s t i n a l t r a c ta n d t h e p r o t e c t i v e f u n c t i o n s o f v i t a m i n C a n d r e d u c e d g l u t a t h i o n eW E I Q i a n,MUHAMMA D Um a r,J I A N G P i n g-z h e,L I X i a o-d a n,L I U Q i-q i,X I N G S h u-g u a n g,L U O W e n-y a,Y A N G X i n g-k a i,L I M i n g-g a n g(C o l l e g e o f L i f e S c i e n c e,N a n k a i U n i v e r s i t y,T i a n j i n300071,C h i n a)A B S T R A C T:O b j e c t i v e T o i n v e s t i g a t e t h e e f f e c t s o f v a n a d y l t r e h a l o s e(V T)o n o x i d a t i v e s t r e s s a n d G S H/G S T sp a t h w a y g e n e e x p r e s s i o n i n m o u s e g a s t r o i n t e s t i n a l t r a c t a s w e l l a s t h e p r o t e c t i v e e f f e c t s o f v i t a m i n C a n d r e d u c e d g l u t a t h i o n e(G S H).M e t h o d s T h i r t y m a l e K u n m i n g m i c e w e r e r a n d o m l y d i v i d e d i n t o f i v e g r o u p s:n o r m a l c o n t r o l g r o u p(g r o u p A),V T g r o u p(g r o u p B),V c+V T g r o u p(g r o u p C),G S H+V T g r o u p(g r o u p D),a n d V c+G S H+V T g r o u p(g r o u p E).T h e t r e a t m e n t g r o u p s w e r e f e d w i t h v a n a d y l t r e h a l o s e(125m g/k g)e v e r y d a y,w h i l e t h ec o n t r o l g r o u p w a s g i v e n t h e s a m e a m o u n t o f n o r m a l s a l i n ed a i l y.V c a n d G S H we r e a d m i n i s t e r e d o n e h o u r b ef o r e v a n a d y l t r e h a l o s e t r e a t m e n t v i ag a v a g e.Th e t r e a t m e n t l a s t e d15d a y s.T h e n,a l l mi c e w e r e k i l l e d a n d t h e s t o m a c h a n d d u o d e n u m w e r e i s o l a t e d.T h e c o n t e n t o f r e d u c e d G S H w a s m e a s u r e d b y D T N B m e t h o d,t h e a c t i v i t y o fg l u t a t h i o n e p e r o x i d a s e w a s d e t e r m i n e d b y g l u t a t h i o n e o x i d a s e m e t h o d.R e a l-t i m e f l u o r e s c e n c e q u a n t i t a t i v e P C R w a s u s e d t o d e t e c t t h e e x p r e s s i o n s o f G C L C,G S S,G S R a n d G S T p i i n G S H/G S T s p a t h w a y.R e s u l t s T h e c o n t e n t o fG S H a n d G S H-P x a c t i v i t y a n d t h e e x p r e s s i o n s o f G C L C,G S S,G S R a n d G S T p i i n t h e s t o m a c h a n d d u o d e n u m i nV T-t r e a t e d g r o u p w e r e l o w e r t h a n t h o s e i n g r o u p A(P<0.05).I n g r o u p s C,D a n d E t h e a b o v e i n d i c a t o r s w e r e s i g n i f i c a n t l y i m p r o v e d,b u t t h o s e o n l y i n t h e s t o m a c h i n g r o u p E r e a c h e d t h e l e v e l o f t h e n o r m a l c o n t r o l g r o u p.I n收稿日期:2018-01-08修回日期:2018-05-17基金项目:国家自然科学基金资助项目(N o.31771066)S u p p o r t e d b y t h e N a t i o n a l N a t u r a l S c i e n c e F o u n d a t i o n o f C h i n a(N o.31771066)通信作者:李明刚,教授.E-m a i l:m g l@n a n k a i.e d u.c n.魏倩和MUH AMMA D Um a r为并列第一作者㊂优先出版:h t t p://k n s.c n k i.n e t/k c m s/d e t a i l/61.1399.R.20181015.1513.008.h t m l(2018-10-15)g r o u p s C a n d D,e x c e p t f o r t h e a m o u n t o f G S R e x p r e s s e d i n t h e d u o d e n u m,t h e r e w a s n o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e i n6期魏 倩,M U H A MM A D U m a r ,姜苹哲,等.海藻糖氧钒对小鼠胃肠道的氧化损伤以及V c 和G S H 的抗氧化保护作用h t t p ://y x x b .x jt u .e d u .c n t h e o t h e r i n d e x e s .C o n c l u s i o n V T c a n c a u s e o x i d a t i v e s t r e s s d a m a ge t o t h e g a s t r o i n t e s t i n a l t r a c t of m i c e ,w h i c h a f f e c t s G S H c o n t e n t a n d G S H -P x a c t i v i t y ,a n d i n t e r f e r e s w i t h t h e n o r m a l e x p r e s s i o n s o f G S H /G S T s p a t h w a yr e l a t e d g e n e s .E x o g e n o u s V c a n d G S H a n d t h e c o m b i n a t i o n o f t h e t w o c a n p l a y a ce r t a i n r o l e i n a n t i o x i d a n t p r o t e c t i o n a n d r e d u c e t h e t o x i c i t y of V T .T h e c o m b i n a t i o n o f t h e t w o i s b e t t e r t h a n o n e u s e d a l o n e ,a n d t h e r e l a t e d i n d i c a t o r s i n t h e s t o m a c h c a n r e a c h t h e n o r m a l l e v e l .K E Y W O R D S :v a n a d yl t r e h a l o s e (V T );o x i d a t i v e s t r e s s ;G S H /G S T s ;v i t a m i n C ;r e d u c e d g l u t a t h i o n e (G S H ) 随着近年来人们生活水平的提高,糖尿病的发病率逐年升高[1]㊂糖尿病是一种由胰岛素分泌不足或机体对胰岛素敏感性降低而引发的慢性代谢疾病[2]㊂钒是人体必需的微量元素之一,因其具有 胰岛素样 作用,可在一定程度上调节糖代谢而具有抗糖尿病的功能[3]㊂然而,钒化合物往往也会引发一些毒副作用,主要的是消化道反应,如腹泻㊁脱水㊁体质量减轻等[4]㊂有研究报道,钒的毒副作用机制可能与其引起机体自由基堆积㊁抗氧化酶活性降低㊁氧化损伤增强等有关[5]㊂还原型谷胱甘肽(r e d u c e d g l u t a t h i o n e ,G S H )是体内重要的抗氧化剂,其含量主要通过谷胱甘肽还原酶(G S R )㊁谷胱甘肽合成酶(G S S )㊁谷氨酸半胱氨酸连接酶(γ-G C L )和部分谷胱甘肽S -转移酶(G S T s)进行调节,这些酶共同构成了谷胱甘肽/谷胱甘肽S -转移酶(G S H /G S T s )通路[6]㊂维生素C (v i t a m i n C ,V c)是细胞内外化学反应的还原剂,也是一种水溶性低分子抗氧化物质[7]㊂海藻糖氧钒(v a n a d yl t r e h a l o s e ,V T )最初是由B A R R I O 等[8]合成的一种新型有机钒化合物㊂作者课题组前期采用类似方法合成了V T ,并发现其可以调节糖尿病小鼠的血糖水平,缓解多饮㊁多食㊁多尿和体质量减轻的糖尿病症状[9]㊂进一步研究发现,V T 对昆明小鼠的主要毒性靶器官是胃和十二指肠[10]㊂本研究观察V T 对实验小鼠胃和十二指肠的G S H(抗氧化非酶类)含量以及G S H -P x (抗氧化酶类)活性的影响,并测定G S H /G S T s 通路相关基因表达,以阐明V T 是否通过影响G S H 而发挥其毒性作用,并探索外源添加抗氧化剂V c 和G S H 对其解毒的作用㊂1 材料与方法1.1 实验动物 S P F 级雄性昆明小鼠30只,5周龄,购自中国军事医学科学院中心(动物许可证编号S C X K -2007-005)㊂动物房维持温度(20ʃ2)ħ,湿度(50ʃ5)%,光暗周期为12hʒ12h ,无强烈声光刺激㊂所有动物适应环境饲养1周,期间自由进食正常饲料并自由饮用自来水㊂1.2 主要试剂 硫酸氧钒购自天津阿法埃莎化学有限公司;海藻糖购自天津西马克技术有限公司;无水乙醇购自天津化学试剂供销公司;G S H 购自北京索莱宝公司;V c 购自美国S i g m a 公司;G S H 及G S H -P x 活性测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所;R N A i s o P l u s 购自T a K a R a ;F a s t K i n g cD N A 第一链合成试剂盒和S u p e r R e a l P r e M i x P l u s S Y B R G r e e n 购自北京天根生化科技有限公司;引物全部委托北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成㊂1.3 药物制备 海藻糖氧钒的合成按照B A R R I O 等[8]的方法㊂向10m L 的海藻糖溶液(0.4m o l /L )中,逐滴滴加硫酸氧钒溶液(0.1m o l /L ),然后使用N a O H 溶液(2m o l /L )将混合溶液的p H 值调节至13㊂该棕色混合溶液在室温下密封放置12~24h ,加入无水乙醇,逐渐有固体析出,过滤收集固体并用无水乙醇洗涤㊂产物用N a O H 固体干燥并置于干燥器中保存㊂V T ㊁V c 和G S H 使用时在蒸馏水中溶解并当天配制㊂1.4 实验分组及给药 将30只雄性昆明小鼠随机分为5组,进行如下处理:A 组:等体积生理盐水灌胃;B 组:125m g /(k g ㊃d )V T 灌胃;C 组:150m g /(k g㊃d )V c 灌胃1h 后,再用125m g /(k g㊃d )V T 灌胃;D 组:150m g /(k g ㊃d )G S H 灌胃1h 后,再用125m g /(k g㊃d )V T 灌胃;E 组:150m g /(k g ㊃d )V c +150m g /(k g ㊃d )G S H 灌胃1h 后,再用125m g /(k g㊃d )V T 灌胃;各组连续给药15d㊂1.5 取材及样品制备 末次给药完毕后,各组小鼠禁食不禁水24h ,以颈椎脱臼法处死小鼠,迅速解剖,取胃㊁十二指肠在预冷的生理盐水中漂洗2~3次,用滤纸吸干㊂各样品一式两份,一份装于E P 管中,置于-20ħ冰箱保存备用;另一份装于冻存管中液氮速冻,于-80ħ冰箱保存备用㊂组织匀浆液制备:分别称取保存于-20ħ的胃㊁十二指肠组织(0.2~1g )按1ʒ9(g /m L )加入9倍预冷的匀浆介质(生理盐水)于研钵中,在冰浴条件下制备匀浆,3000r /m i n 低温离心10m i n,取上清液在4ħ冰箱冷藏或-20ħ冰箱冰冻备用㊂1.6 指标测定 G S H 含量采用D T N B 法测定,118西安交通大学学报(医学版)第39卷h t t p ://y x x b .x jt u .e d u .c n G S H -P x 活力采用G S H 氧化法测定㊂以上各指标的测定和计算严格按照试剂盒说明书操作步骤进行㊂1.7 实时荧光定量P C R 检测 参照R N A i s o P l u s 说明书的步骤提取胃㊁十二指肠组织总R N A ㊂通过微量紫外分析仪(N a n o D r o p 2000)检测总R N A 浓度与纯度,琼脂糖凝胶电泳分析R N A 的完整性㊂R N A 提取物-80ħ保存备用㊂各样品总R N A 采用F a s t K i n g cD N A 第一链合成试剂盒逆转录为c D N A ,并以此为模板按照S u pe r R e a l P r e M i x P l u s S Y B R G r e e n 说明书操作,加入相关试剂及引物以最终反应体积为20μL 进行P C R 扩增㊂引物序列见表1㊂反应条件:95ħ预变性15m i n ;95ħ变性10s ,57ħ退火20s ,72ħ延伸20s ,40个循环;72ħ检测信号㊂以C F X 96P C R 热循环仪分析软件,将C t 值按公式2-әәC t计算并用于统计分析㊂表1 R e a l -t i m e P C R 引物序列T a b .1 P r i m e r s s e q u e n c e f o r R e a l -t i m e P C R 基因序列G C L C F :5'-C T A C C A C G C A G T C A A G G A C C -3'R :5'-C C T C C A T T C A G T A A C A A C T G G A C -3'G S S F :5'-A A A G C A G G C C A T A G A C A G G G -3'R :5'-T G A A T G G G G C A T A C G T C A C C -3'G S R F :5'-G C G T G A A T G T T G G A T G T G T A C C -3'R :5'-G T T G C A T A G C C G T G G A T A A T T T C -3'G S T p i F :5'-A T G C C A C C A T A C A C C A T T G T C -3'R :5'-G G G A G C T G C C C A T A C A G A C -3'G A P DHF :5'-TG A C C T C A A C T A C A T G G T C T A C A -3'R :5'-C T T C C C A T T C T C G G C C T T G -3'1.8 统计学分析 采用S P S S 22.0软件进行统计学分析,数据用均数ʃ标准差( xʃs )表示,多组间数据比较采用单因素方差分析(A N O V A )和L S D 法,以P <0.05为差异有统计学意义㊂2 结 果2.1 小鼠胃㊁十二指肠组织G S H 含量的比较 5组小鼠干预15d 后,胃组织G S H 含量差异有统计学意义(F =28.25,P <0.01),B 组显著低于A 组(P <0.01),C ㊁D ㊁E 组较B 组显著提高(均为P <0.01);E组显著高于C ㊁D 组(P =0.008,P =0.023),且C ㊁D 组间差异无统计学意义(P =0.538),E 组与A 组差异无统计学意义(P =0.405,表2)㊂5组间小鼠十二指肠G S H 含量差异有统计学意义(F =76.17,P <0.01),与A 组相比,B 组十二指肠的G S H 含量显著降低(P <0.01),而C ㊁D ㊁E 组比B 组显著提高(均为P <0.01),C 组与D 组间差异无统计学意义(P =0.154);E 组显著高于C 组和D 组(P =0.003,P =0.047),但仍显著低于A 组(P =0.035,表2)㊂表2 各组小鼠胃㊁十二指肠组织G S H 含量的比较T a b .2C o m pa r i s o n o f G S H c o n t e n t i n t h e s t o m a c h a n d d u o d e -n u m o f m i c e i n e a c h g r o u p ( x ʃs ,μm o l /g p r o t )组别胃组织十二指肠组织A 组34.46ʃ0.8056.00ʃ0.18B 组27.49ʃ0.76*37.35ʃ2.12*C 组31.40ʃ0.79*#ә48.76ʃ1.24*#әD 组31.87ʃ0.35*#ә50.54ʃ0.60*#әE 组33.83ʃ0.83#53.17ʃ0.53*#与A 组比较,*P <0.05;与B 组比较,#P <0.05;与E 组比较,әP <0.05㊂2.2 小鼠胃㊁十二指肠组织G S H -P x 活性的比较 5组间小鼠胃组织G S H -P x 活性差异有统计学意义(F =9.44,P <0.01),与A 组相比,B 组G S H -P x 活性显著下降(P <0.01),C ㊁D ㊁E 组比B 组明显升高(均为P <0.01),C 组与D 组间差异无统计学意义(P =0.923),E 组显著高于C 组和D 组(P =0.037,P =0.043),E 组与A 组间差异不显著(P =0.770,表3)㊂5组间小鼠十二指肠G S H -P x 活性差异有统计学意义(F =340.39,P <0.01),B 组十二指肠的G S H -P x活性比A 组显著降低(P <0.01);与B 组相比,C ㊁D ㊁E 组则显著提高(均是P <0.01),且E 组显著高于C 组与D 组(P =0.003,P =0.018),但C ㊁D 组间差异无统计学意义(P =0.325);E 组仍低于A 组,且差异有统计学意义(P =0.008,表3)㊂表3 各组小鼠胃㊁十二指肠组织G S H -P x 活性的比较T a b .3 C o m p a r i s o n o f G S H -P x a c t i v i t y in t h e s t o m a c h a n d d u o d e n u m o f m i c e i n e a c h g r o u p( x ʃs ,U /m g pr o t )组别胃组织十二指肠组织A 组63.01ʃ2.1250.11ʃ0.20B 组51.98ʃ2.30*29.94ʃ0.74*C 组57.43ʃ2.75*#ә45.67ʃ1.04*#әD 组57.63ʃ0.70*#ә46.31ʃ0.39*#әE 组62.39ʃ1.83#48.05ʃ0.29*#与A 组比较,*P <0.05;与B 组比较,#P <0.05;与E 组比较,әP <0.05㊂2.3 小鼠胃组织G S H /G S T s 通路相关基因m R N A 表达变化 各组连续处理15d 后,5组间小鼠胃组织的各基因表达差异具有统计学意义(G C L C :F =32.94,P <0.01;G S S :F =22.73,P <0.01;G S R :F =20.22,P <0.01;p i -谷胱甘肽S -转移酶(G S T p i ):F =27.39,P <0.01);B 组小鼠胃组织的G C L C ㊁G S S ㊁G S R ㊁G S T pi 表达均比A 组显著下调(均为P <0.01),C ㊁D ㊁E 组的G C L C ㊁G S S ㊁G S R 表达比B 组明显升高(均为P <0.05)㊂E 组G C L C ㊁G S S ㊁G S R 表达显著高于2186期魏 倩,M U H A MM A D U m a r ,姜苹哲,等.海藻糖氧钒对小鼠胃肠道的氧化损伤以及V c 和G S H 的抗氧化保护作用h t t p ://y x x b .x jt u .e d u .c n C ㊁D 组(均为P <0.05),但与A 组无显著差异,且C ㊁D 组间差异不明显(均为P >0.05);G S T pi 在C ㊁D ㊁E 组间差异无统计学意义,且其水平都达到了正常对照组(A 组)水平(均为P >0.05,图1)㊂图1 小鼠胃组织中G S H /G S T s 通路相关基因m R N A 表达的比较F i g .1T h e m R N A e x p r e s s i o n o fG SH /G S T s p a t h w a y re l a t e d g e n e i n t h e s t o m a c h of m i c e 与A 组比较,*P <0.05;与B 组比较,#P <0.05;与E 组比较,әP <0.05㊂2.4 小鼠十二指肠中G S H /G S T s 通路相关基因m R N A 表达变化 5组间小鼠十二指肠中各基因表达差异具有统计学意义(G C L C :F =126.74,P <0.01;G S S :F =21.86,P <0.01;G S R :F =26.41,P <0.01;G S T p i :F =41.05,P <0.01);与A 组相比,B 组小鼠十二指肠中的G C L C ㊁G S S ㊁G S R 和G S T pi 表达均显著下调(均为P <0.01),C ㊁D ㊁E 组比B 组有显著上升(均为P <0.05);与C ㊁D 组相比,E 组的G C L C ㊁G S S ㊁G S R 表达分别显著升高(均为P <0.05),但只有G S R 表达恢复到对照组(A 组)的水平(P =0.954)㊂C ㊁D 组之间的G C L C ㊁G S S ㊁G S T p i 表达差异均无统计学意义(均为P >0.05),但C 组G S R 表达明显高于D 组(P =0.035);C ㊁D ㊁E 组间G S T p i 表达无统计学差异且都显著低于对照组(A 组)(均为P <0.05,图2)㊂3 讨 论氧化应激是机体遭受到各种有害刺激时,体内高活性分子如活性氧自由基(r e a c t i v e o x y g e n s pe c i e s ,R O S)产生过多,机体无法及时清除,氧化系统与抗氧化系统失衡,从而导致组织损伤㊂R O S 包括超氧阴离子(㊃O 2-)㊁羟自由基(㊃O H )和过氧化氢(H 2O 2)等;在生理条件下,钒主要以+5㊁+4两种价态形式存在,在其转化过程中伴随有R O S 产生㊂V 4+通过f e n t o n 反应生成V 5+,并产生大量的㊃O H ㊂钒化合物刺激细胞后,使胞内p 47-ph o x 蛋白质磷酸化,从而激活N A D P H 氧化酶,并在细胞内产生大量的㊃O 2-[11]㊂机体存在两类抗氧化系统:一类是酶抗氧化系统,包括超氧化物歧化酶(S O D )㊁过氧化氢酶(C A T )㊁谷胱甘肽过氧化物酶(G S H -P x )等;另一类是非酶抗氧化系统,包括V c ㊁维生素E ㊁G S H ㊁类胡萝卜素和硒(S e)等[12]㊂本研究采用连续灌胃给药处理15d 后,结果显示V T 给药组小鼠胃㊁十二指肠G S H 含量及G S H -P x 活性均低于对照㊂分析主要原因可能有:①五价钒转化为四价钒的过程中G S H 被氧化而消耗;②钒和G S H有高亲和力,导致二者直接结合;③钒诱导产生的R O S氧化G S H 而使机体细胞中G S H 水平降低㊂体内G S H 的缺乏或耗竭均会加剧多种化学物质的毒性作用,增加氧化损伤[13]㊂小鼠灌服V T 使谷胱甘肽过氧化物酶(G S H -P x)活性降低,原因可能是其钒离子与-S H 有很强的亲和力,与G S H -P x 活性中心的-S H 结合导致活力降低;此外,可能还与钒易与G S H -P x 的底物G S H 结合而使G S H -P x 活力降低有关㊂318西安交通大学学报(医学版)第39卷h t t p ://y x x b .x jt u .e d u .cn 图2 小鼠十二指肠中G S H /G S T s 通路相关基因m R N A 表达的比较F i g .2T h e m R N A e x p r e s s i o n o fG SH /G S T s p a t h w a y re l a t e d g e n e i n t h e d u o d e n u m of m i c e 与A 组比较,*P <0.05;与B 组比较,#P <0.05;与D 组比较,ҖP <0.05;与E 组比较,әP <0.05㊂灌服V T 使小鼠胃肠道抗氧化系统损伤并导致机体产生氧化应激反应㊂F O L A R I N 等[14]研究发现钒引起小鼠大脑的G S H 含量及G S H -P x 活性下降㊂也有文献报道钒可降低大鼠肝细胞的G S H 含量[15]㊂本研究结果表明,外源补充V c 和G S H 均能增加小鼠胃㊁十二指肠G S H 含量及G S H -P x 活性,但只有两者联合使用时,才能使胃中G S H 含量及G S H -P x活性恢复到正常对照组水平,表明V T 对十二指肠G S H 含量及G S H -P x 活性的影响较胃组织更明显㊂外源性补充G S H 可直接增加体内G S H 含量,有利于清除自由基,并与亲电子复合物在非酶或谷胱甘肽巯基转移酶(G S T )的作用下产生交联复合物,最终形成硫醚氨酸排出体外,增加细胞解毒功能,加快毒副产物的排泄速率,减弱钒的毒性㊂WA N G 等[16]报道外源补充G S H 可加速小鼠体内砷的排泄,减轻砷诱导的氧化应激,从而降低砷毒性㊂外源性补充V c 可增加胶原蛋白合成和修复,保护黏膜细胞,维持胃肠道结构和功能的完整性;还可快速与㊃O 2-㊁H 2O 2和㊃O H 反应生成半脱氢抗坏血酸以清除或减少这些自由基,从而防止或减轻细胞发生氧化损伤㊂亦有研究报道,V c 可提高肠上皮细胞抗氧化能力,减低其氧化损伤[17]㊂G S H /G S T s 是动物重要的抗氧化和解毒系统,G S H 合成(G C L C ㊁G S S ㊁G S R )和分解代谢相关酶基因(G S T pi )构成了一个完整的G S H /G S T s 功能系统和较为完整的通路[6]㊂在机体内还原型G S H 以氨基酸为底物在γ-G C L 和G S S 的催化下合成,其中,γ-G C L 是限制酶,G C L C 是该酶的催化亚基;同时,也可在G S R 和N A D P H 作用下使氧化型谷胱甘肽(G S S G )还原生成G S H [18]㊂本研究结果显示,与正常对照组相比,V T 给药组胃和十二指肠中的G C L C ㊁G S S 和G S R 基因表达均下调,表明V T 对胃和十二指肠产生一定毒性,造成抗氧化功能障碍,干扰了相关基因的正常表达㊂外源补充V c 和G S H 及两者联用都能提高G C L C ㊁G S S 和G S R 基因m R N A表达,且只有两者联用组的胃组织的表达才可恢复到正常对照组水平,这与对G S H 含量及G S H -P x 活性的影响相一致㊂推测可能是外源添加V c 和G S H 增加了体内抗氧化能力,保护胃和十二指肠的功能并降低了V T 毒副作用对相关基因表达的影响㊂值得注意的是,补充V c 组在十二指肠中的G S R 表达量显著高于补充G S H 组,且两者联用使其表达可恢复到正常对照组水平,可能是V c 比G S H 能更有效提高G S R 活性,增加了体内G S H 量,再与G S H 联用,使4186期魏 倩,M U H A MM A D U m a r ,姜苹哲,等.海藻糖氧钒对小鼠胃肠道的氧化损伤以及V c 和G S H 的抗氧化保护作用h t t p ://y x x b .x jt u .e d u .c n 细胞功能恢复到了正常水平[17]㊂谷胱甘肽S -转移酶(G S T s)属于Ⅱ相代谢解毒酶的同工酶家族,具有清除体内自由基和解毒的双重功能㊂G S T pi 是G S T s 家族重要成员,可参与多种内㊁外源性物质的代谢,清除有害物质,降低机体的氧化损伤,对细胞具有保护作用[19]㊂本研究中,因V T对胃和十二指肠产生毒性,损伤了细胞的正常功能,从而使G S T pi 表达下降㊂外源补充V c 和G S H 及两者联用都使G S T p i 表达有所增加,但只有在胃组织中与正常对照组水平相当,说明V T 对十二指肠的影响更大㊂本研究中,分别单独补充V c 和G S H 虽然比V T给药组对各指标有改善效果,但仍没达到正常对照组水平㊂一方面可能是单独使用V c 和G S H 其作用有局限性;另一方面也可能与补充量不足有关㊂当V c和G S H 联用时,结果使一些指标恢复到正常水平,效果优于V c 和G S H 单独使用,说明两者除能独自发挥抗氧化作用外,还具有一定的协同作用㊂在体内V c 和G S H 构成耦联的氧化还原对,当V c 被氧化成脱氢V c 时,G S H 依赖性脱氢V c 还原酶的活性,在维持V c 生理循环上发挥重要作用,而V c 也可使氧化型谷胱甘肽(G S S H )还原成G S H ,使其增加含量并帮助其发挥作用[20]㊂因此,需进一步研究V c 和G S H 单用的有效剂量以及两者联用的合理配比,并进一步阐明其所涉及的信号通路的变化机制㊂参考文献:[1]C A N I V E L L S ,G O M I S R.D i a gn o s i s a n d c l a s s i f i c a t i o n o f a u t o -i mm u n e d i a b e t e s m e l l i t u s [J ].A u t o i m m u n i t y R e v ,2012,13(4-5):403-407.[2]WH I T I N G D R ,G U A R I G U A T A L ,W E I L C ,e t a l .I D F d i a -b e t e s a t l a s :G l o b a l e s t i m a t e s o f t h e p r e v a l e n c e o f d i a b e t e s f o r2011a n d 2030[J ].D i a b e t e s R e s C l i n P r a c t ,2011,94(3):311-321.[3]W I L K A ,S Z Y P U L S K A -K O Z I A R S K A D ,W I S Z N I E W S K A B .T h e t o x i c i t y o f v a n a d i u m o n g a s t r o i n t e s t i n a l ,u r i n a r y a n d r e pr o d u c -t i v e s y s t e m ,a n d i t s i n f l u e n c e o n f e r t i l i t y an d f e t u s e s m a l f o r m a t i o n s [J ].P o s t e p y H i g Me d D o s w ,2017,71:850-859.[4]I MU R A H ,S H I MA D A A ,N A O T A M ,e t a l .V a n a d i u m t o x i c -i t y i n m i c e :P o s s i b l e i m p a i r m e n t of l i pi d m e t a b o l i z m a n d m u c o -s a l e p i t h e l i a l c e l l n e c r o s i s i n t h e s m a l l i n t e s t i n e [J ].T o x i c o l P a t h o l ,2013,41(6):842-856.[5]L E E J C ,S O N Y O ,P R A T H E E S H K UMA R P ,e t a l .O x i d a t i v es t r e s s a n d m e t a l c a r c i n o ge n e s i s [J ].F r e e R a d i c B i o l M e d ,2012,53(4):742-757.[6]K A L I N I N A E V ,C H E R N O V N N ,N O V I C H K O V A MD.R o l eo f g l u t a t h i o n e ,g l u t a t h i o n e t r a n s f e r a s e ,a n d g l u t a r e d o x i n i nr e g u l a t i o n o f r e d o x -d e p e n d e n t p r o c e s s e s [J ].B i o c h e m i s t r y,2014,79(13):1562-1583.[7]F I AMM E T T A M ,E R I C A A ,C H I A R A G ,e t a l .V i t a m i n C ,a g i n g an d A l z h e i m e r s d i s e a s e [J ].N u t r i e n t s ,2017,9(7):670.[8]B A R R I O D A ,W I L L I AM S P A ,C O R T I Z O AM ,e t a l .S yn t h e -s i s o f a n e w v a n a d y l (I V )c o m p l e x w i t h t r e h a l o s e (T r e V O ):I n -s u l i n -m i m e t i c a c t i v i t i e s i n o s t e o b l a s t -l i k e c e l l s i n c u l t u r e [J ].JB i o l I n o r g Ch e m ,2003,8(4):459-468.[9]J I A N G P Z ,D O N G Z ,MA B C ,e t a l .E f f e c t o f v a n a d y l r o s i gl i -t a z o n e ,a n e w i n s u l i n -m i m e t i c v a n a d i u m c o m pl e x e s ,o n g l u c o s e h o m e o s t a s i s o f d i a b e t i c m i c e [J ].A p pl B i o c h e m B i o t e c h n o l ,2016,180(5):841-851.[10]J I A N G P Z ,N I Z Z ,WA N G B ,e t a l .A c u t e t o x i c i t y ,t w e n t y-e i g h t d a y s r e p e a t e d d o s e t o x i c i t y a n d g e n o t o x i c i t y o f v a n a d yl t r e h a l o s e i n K u n m i n g m i c e [J ].R e g u l T o x i c o l P h a r m a c o l ,2017,85:86-97.[11]L U S H C H A K V I .F r e e r a d i c a l s ,r e a c t i v e o x y g e n s pe c i e s ,o x i -d a t i v e s t r e s s a n d i t s c l a s s if i c a t i o n [J ].C h e m B i o l I n t e r a c t,2014,224:164-175.[12]P A T R I K P ,K L A U D I A J ,M I R I AMA S ,e t a l .T a r g e t i n g fr e e r a d i c a l s i n o x i d a t i v e s t r e s s -r e l a t e d h u m a n d i s e a s e s [J ].T r e n d s P h a r m a c o l S c i ,2017,38(7):592-607.[13]N E M E T I B ,A N D E R S O N M E ,G R E G U S Z.G l u t a t h i o n e s yn -t h e t a s e p r o m o t e s t h e r e d u c t i o n o f a r s e n a t e v i a a r s e n o l y s i s o f gl u t a t h i o n e [J ].B i o c h i m i e ,2002,94(6):1327-1333.[14]F O L A R I N O R ,A D A R A M O Y E O A ,A K A N N I O O ,e t a l .C h a n -g e s i n t h e b r a i n a n t i o x i d a n t pr o f i l e a f t e r c h r o n i c v a n a d i u m a d m i n i s -t r a t i o n i n m i c e [J ].M e t a b B r a i n D i s ,2017,6(25):1-9.[15]H O S S E I N I M J ,S H A K I F ,G H A Z I KM ,e t a l .T o x i c i t y of v a -n a d i u m o n i s o l a t e d r a t l i v e r m i t o c h o n d r i a :A n e w m e c h a n i s t i ca p pr o a c h [J ].M e t a l l o m i c s ,2013,5(2):152-166.[16]WA N G D ,L I N L ,L I X ,e t a l .E f f e c t s o f gl u t a t h i o n e o n t h e i n v i v o m e t a b o l i s m a n d o x i d a t i v e s t r e s s o f a r s e n i c i n m i c e [J ].J T o x i c o l S c i ,2015,40(5):577-583.[17]刘扬,池磊,冯琳,等.维生素C 对建鲤肠上皮细胞氧化损伤保护作用的研究[J ].动物营养学报,2012,24(8):1503-1511.[18]L U S C .G l u t a t h i o n e s y n t h e s i s [J ].B i o c h i m B i o p h ys A c t a ,2013,1830(5):3143-3153.[19]M I C H A E L S ,T O MMY K ,MA R C D.R e g u l a t i o n o f e p i ge n e t i c t r a i t s of t h eg l u t a thi o n e S -t r a n s f e r a s e P 1g e n e :F r o m d e t o x i f i -c a t i o n t o w a r d c a n c e r p r e v e n t i o n a n d d i a g n o s i s [J ].F r o n t P h a r -m a c o l ,2014,5:170.[20]G A O F ,Y A O C L ,G A O E ,e t a l .E n h a n c e m e n t o f gl u t a t h i o n e c a r d i o p r o t e c t i o n b y a s c o r b i c a c i d i n m y o c a r d i a l r e pe rf u s i o n i n -j u r y [J ].J P h a r m a c o l E x p Th e r ,2002,301(2):543-550.(编辑 国 荣)518。