牛肺肝素提取新工艺(中试实验)

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牛肺肝素钠提取工艺研究

张耕
( 四川畜牧兽医学院生物技术系
摘
要
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重庆荣昌
如 2 粼刃
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本课题研究了牛肺肝素钠提取工艺及工艺条件目前采用的酶解或盐解工艺都不能将
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肝素与蛋白质形成的糖蛋白完全分离得不到理想的提取效果但采用胰酶酶解后再盐解则获得
较高的肝素收率
关键词牛肺
肝素钠
工艺
19 1 6
年肝素从动物肝脏中提取以来现已发现其广泛存在于动物肝肺小肠粘膜中
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生物体内肝素和蛋白质结合以糖蛋白形式存在结合蛋白无抗凝活性随着蛋白质的去除而活性增加
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注
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效价测定采用天青
比色法
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一种从动物肺中提取肝素钠的方法及该肝素钠[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610870212.4(22)申请日 2016.10.05(71)申请人陈石良地址 432600 湖北省孝感市安陆市经济开发区宝迪路1号宝迪工业园4栋206室(72)发明人陈石良　(51)Int.Cl.C08B 37/10(2006.01)(54)发明名称一种从动物肺中提取肝素钠的方法及该肝素钠(57)摘要本发明公开了一种从动物肺中提取肝素钠的方法及该肝素钠，是以动物肺为原料，经过绞碎打浆、酶解脱脂、盐解提取、酶解除蛋白、树脂吸附与洗脱、调酸碱除蛋白、沉淀脱盐、复沉精制、脱水干燥制得肝素钠。

本发明在动物肺肝素钠萃取、纯化过程中，采用盐解与酶解相结合，酸处理与碱处理相结合，树脂提纯与乙醇分级沉淀相结合工艺，最大限度地使肝素与蛋白质、软骨素等杂质解离，较为彻底地去除了与肝素紧密结合的蛋白质、硫酸软骨素、硫酸皮肤素等杂质，具有工艺简单、成本低廉、提取效果好、适合大规模工业化生产的特点。

所制备的肝素钠纯度好，效价高，收率高，平均效价达到120U/mg以上，平均每公斤动物肺提取肝素钠效价达到22万单位以上。

权利要求书2页说明书11页附图1页CN 106432549 A 2017.02.22C N 106432549A1.一种从动物肺中提取肝素钠的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）绞碎打浆：动物肺经预处理、绞碎、匀浆后加水，搅拌混匀，得到肺浆液；（2）酶解脱脂：用NaOH调节步骤（1）中的肺浆液的pH值至8.5 -9.2，升温至40-45℃，加入脂肪酶，保温酶解，过滤，收集滤渣，加水搅拌得脱脂肺浆液；（3）盐解提取：往步骤（2）中的脱脂肺浆液中加入氯化钠，调节pH值，升温至50-55℃并保温，再升温并进行过滤，得到盐解液；（4）酶解除蛋白：将步骤（3）中的盐解液降温至55℃，调节pH值至8.0-9.0，加入蛋白酶，保温酶解，然后升温灭酶并进行过滤，得到酶解液；（5）吸附：将步骤（4）中的酶解液降温至60℃，调整其盐度和pH值，加入D-254树脂，保温吸附处理10-12小时后，收集吸附后的树脂；（6）洗脱：（6-1）：用水反复冲洗步骤（5）中的吸附后的树脂至水变清为止，滤干树脂，再以完全浸没树脂为量，加入质量分数为5-7%的氯化钠溶液，温度保持在50-55℃，搅拌30-60min，滤干得洗涤后的树脂；（6-2）：以完全浸没步骤（6-1）中的洗涤后的树脂为量，加入质量分数为20-25%的氯化钠溶液，温度保持在50-55℃，搅拌3-4小时后，分离树脂，收集洗脱液；（6-3）：重复步骤（6-2）一次，将两次收集的洗脱液合并，并用100目滤袋过滤，收集洗脱液待用；（7）调酸除蛋白：往步骤（6-3）中的洗脱液加入其重量0.1-0.3%的保护剂搅拌均匀后，用稀盐酸调节pH值至3.0-3.5，静置10分钟，用100目滤袋过滤，收集滤液待用；（8）调碱除蛋白：用NaOH调节步骤（7）中的滤液的pH值至11.0，搅拌均匀后静置30分钟，用100目滤袋过滤，收集滤液待用；（9）沉淀脱盐：用稀盐酸调节步骤（8）中的滤液的pH值至7.0-8.0，加入其体积1.8-2.2倍的质量分数为80-85%的预冷过的乙醇，搅拌均匀后密封沉淀18-24小时，倾出上层乙醇清液，收集沉淀物待用；（10）复沉精制：（10-1）：往步骤（9）中的沉淀物中加入其重量10倍的质量分数为3%的氯化钠溶液，搅拌溶解后,升温至80℃并保温，然后降温并进行过滤，收集滤液，加入乙醇，静置，收集沉淀物；（10-2）：往步骤（10-1）中的沉淀物中加入其重量10倍的质量分数为3%的氯化钠溶液，充分搅拌溶解后,升温至80℃并保温，然后降温并进行过滤，收集滤液，加入乙醇，静置，收集沉淀物；（11）脱水干燥：往步骤（10-2）中的沉淀物中加入其重量2倍的质量分数为95-100%的乙醇脱水2-3次，收集沉淀物，置于60-70℃下干燥10-15小时即得肝素钠。

种浓缩纯化肝素的生产工艺参考模板

权利要求书1.一种浓缩纯化肝素的生产工艺，其特点在于，采用扩张柱床离子交换树脂法可将猪、牛、羊等哺乳动物的小肠粘膜、肝、肺脏等脏器的组织匀浆的提取液不经过预处理直接采用色谱技术分离、浓缩、纯化肝素的生产技术，还可用于粗品肝素的精制，改变了使用传统的离子交换固定柱床吸附技术原料液中不能含有不溶性颗粒的限制。

其原理在于吸附介质颗粒在向上流动的液体的作用下膨胀起来，吸附介质颗粒在床体中均匀的悬浮，并按照不同的颗粒尺寸和密度形成梯度而有续的排列，形成一个均衡、稳定的吸附环境，液体中的目标肝素被吸附于介质上，而细胞、细胞碎片、杂蛋白、核酸及杂多糖和其他的组织碎片将通过柱子而流出去，洗脱目标肝素时从相反方向将吸附介质压紧，再用洗脱缓冲液将目标肝素洗下来。

扩张柱床色谱技术兼有流化床和填充床的优点，不需预先除去料液中的颗粒而可以直接从料液中吸附目标产物。

从而起到有效的吸附分离作用。

扩张柱床离子交换色谱技术不但可用于从哺乳动物脏器匀浆液直接提取肝素，还可用于粗品肝素的精制。

采用扩张柱床离子交换色谱技术从哺乳动物脏器匀浆液直接提取肝素和用粗品肝素精制肝素，大大降低了肝素纯化工艺的复杂性，提高了产率，降低了生产成本。

改变以往的国内树脂法精制肝素的生产中，基本上都是采用分批吸附的方法。

分批吸附法理论塔板数低，柱效损失大，纯化效率低，对目的分子吸附不够充分，因此损失大。

采用扩张柱床离子交换色谱技术提取肝素，可将肝素与杂质蛋白、核酸及其余硫酸多糖分离，浓缩，纯化一次完成。

减少工序，缩短时间，降低成本，提高效率和质量。

采用扩张柱床离子交换色谱技术直接从匀浆液中提取肝素，肝素单位效价达到120U/mg以上，用粗品精制肝素，效价达到160U/mg以上，产品中紫外区杂质(260nm，280nm)均满足药典要求；技术内容：(1)哺乳动物小肠粘膜的匀浆液经碱盐水解、胰蛋白酶酶解(猪牛羊等哺乳动物的肝脏肺脏的组织匀浆液加入0.1-0.5％木瓜蛋白酶)、高温变性和过滤处理，经过在一定离子浓度和PH 条件下进行扩张柱床吸附层析法吸附、浓缩、纯化肝素，乙醇沉淀，丙酮脱水，低温干燥。