qPCR实时荧光定量PCR

1.实时荧光定量PCR技术原理及特点
实时荧光定量PCR是将荧光能量传递技术 (fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)应用于常规 PCR仪中,指在PCR反应体系中加入荧光基团或荧光染料,利用 荧光信号积累,从而实时监测整个PCR过程,最后通过标准曲线 对未知模板浓度进行定量分析的方法 。
域值 → ↑ Ct
如果检测到荧光信号超过域值则被认为是真正的信号 ,它可用于定义样本的域值循环数(Ct)。
Ct(cyclethreshold)值的含义是:每个反应管内的荧光 信号达到设定的域值时所经历的循环数。
研究表明,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的 对数存在线性关系,Ct值随着起始模板量的增加而线性降 低,利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线。其中 横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此只要 获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的 起始拷贝数。
(2)TaqMan荧光探针:该探针是一种寡核苷酸探针。
PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的 荧光探针,两端分别标记一个荧光基团和一个淬灭基团。 当探针与靶序列配对时,荧光基团发射的荧光信号被淬灭 基团吸收。PCR扩增时,Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶 切降解,使荧光基团和淬灭基团分离,从而荧光监测系统可 接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子 形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
(1)特异性好。使用针对靶序列设计的特异性探针对定量分子 进行识别,具有很高的准确性。同时,靶序列由引物和探针 双重控制,特异性好、假阳性低。
(2)灵敏度高。荧光定量PCR检测技术是综合了PCR技术、 荧光标记技术、激光技术、数码显像技术为一体的技术, 因此大大提高了其检测灵敏度。
(3)线性关系好、线性范围宽。由于荧光信号的产生和每次扩 增产物成一一对应的关系,通过荧光信号的检测可以直接 对产物进行定量。
(4)操作简单、安全、自动化程度高、防污染。扩增和检测在 全封闭的同一管内检测,不需要开盖,降低了溴化乙锭的污 染。同时扩增和检测一步完成,不需要后期处理,不再需要 担心放射性污染。
(5)速度快、效率高。可在2-3小时完成多个样品的定量分析, 有效的减少了劳动量。
域值 → ↑
Ct
SYBR 染料
1.1 基本原理
在实时荧光定量PCR中,对整个PCR反应扩增过程进行 了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号,随着反应时 间的进行,监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。
在PCR反应早期,产生荧光的水平不能与背景明显地区别 ,而后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期。FQPCR可行性定量是在PCR扩增的指数期进行的。首先需设定 一定荧光信号的域值,一般这个域值是以PCR反应的前15个 循环的荧光信号作为荧光本底信号,荧光域值的缺省设置是 3~15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。
TaqMan 探针
1.3 特点
一般PCR产物都需要经过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭 （EB）染色紫外光观察结果或通过聚丙烯酰胺凝胶电泳 和银染检测,不仅需要多种仪器,而且费时费力,所使用的染 色剂溴化乙锭对人体又有害处,在这繁杂的实验过程中会 带来假阳性的污染。而荧光定量PCR克服了常规PCR的许 多缺点,有着ห้องสมุดไป่ตู้下显著的优点:
1.2 化学反应原理
依据反应中所选荧光物质的不同,实时荧光定量PCR的 化学反应原理通常分为荧光染料和荧光探针两种:
(1) SYBR荧光染料:SYBR是一种与双链DNA小沟结合的染料 。在PCR反应体系中,加入过量SYBR荧光染料, SYBR荧光 染料特异性掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的 SYBR染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号 的增加与PCR产物的增加完全同步。