大豆胰蛋白酶抑制因子(ti)ELISA试剂盒说明书
植物胰蛋白酶抑制剂(TI)酶联免疫分析(ELISA)
植物胰蛋白酶抑制剂(TI)酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定植物组织，细胞及其它相关样本中胰蛋白酶抑制剂(TI)含量。
实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中植物胰蛋白酶抑制剂(TI)水平。
用纯化的植物胰蛋白酶抑制剂(TI)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入胰蛋白酶抑制剂(TI)，再与HRP标记的胰蛋白酶抑制剂(TI)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的胰蛋白酶抑制剂(TI)呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中植物胰蛋白酶抑制剂(TI)浓度。
试剂盒组成：试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1个1个酶标包被板1×481×962-8℃保存标准品：108ng/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存标本要求：1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
大豆胰蛋白酶抑制剂的分离纯化
总 厂 ；Ｕ １０ Ｔ 一 ８ ０紫外 可见分光光度计 ： 北京普 析通用仪 器 有限责任公 司 ；２ 分 光光度计 ： ７１ 上海第 三分 析仪 器 厂 ； Ｇ ． Ｌ Ｊ ５冷冻 干燥 机 ：北京 四环科 学仪器 厂生产 ； ０ Ｄ Ｃ 一４ Ｙ Ｚ ２ Ｄ电泳 槽 ：北 京六 一仪 器 厂 ；００５ ０ｐｗ ｒ １０ １０ ｅ ｏ ｓｐ ｌ ｕ ｐｙ电泳仪 电源 ： ｉ— ａ 司 ；８ ３ — Ｖ紫外 检 Ｂｏ Ｒ ｄ公 ８２Ａ ｕ 测仪 ：北京市新技术 应用研究所 ； Ｌ２ Ａ全 自动 高速 Ｇ ０ 冷 冻离心机 ： 湘西仪器仪表总厂机械仪器厂 。
摘
要： 采用盐析、 电点沉 淀、 Ｅ Ｅ Ｃ ｌ ｌｓ一 ２离子 交换柱层 析纯化 大豆胰蛋 白酶抑 制剂 ， 等 Ｄ Ａ — ｅ ｕｏｅ ３ ｌ 电泳测定其相 对分
子量 为 ２ ． ｋ ， Ａ Ｅ 苯 甲酰一 － ０１ ｕ Ｂ Ｅ （ Ｌ 精氨 酸 乙酯） 法测定抑制 比为 ０ ：。纯化后的 Ｓ Ｔ（ ．１ ９ Ｂ Ｉ大豆胰蛋 白酶抑制荆 ） 可以作
ａｆ ｉｙｃ ｒ ｍａｏ ａ ｈ ． ｆ ｎ ｔ ｈ ｏ ｔ ｇ ｐ ｙ ｉ ｒ
Ｋｅ ｙｗｏｒ ｓ：ｏ ａ ｙ ｐ ｉ ｎ ｉ ｉ ｒ ＤＥＡＥ－Ｃｅｌ ｏ ｅ ２；ｎ ｂ ｔｒ ａｉ ｄ ｓ ｙＢｅ Ｔｒ ｓｎ Ｉ ｈ ｂｔ ； ｎ ｏ ｌｕ ｓ －３ ｉｈｉｉ ｙ ｒ ｔｏ ｌ ｏ
维普资讯
科 研 学究
食品研究与开发
第０第月 ２８ ４ ２ 期 ０年４ ９ 卷
３ ＝＝ ９ －
大豆胰蛋 白酶抑制剂的分离纯化
武金霞 １ Ｉ １ 吴娅平 ’ 学敏 韩丽梅 ’ ＂ ， 杜 ， （ ．河北大学生命科学学 院 ， １ 河北 保定 ０ １０ ；． ７０２２ 石家庄 高等医学专科学校冀联校 区， 河北 石家庄 ０ １０ ） ５０ ０
豆制品中胰蛋白酶抑制剂活性测定方法研究 (2)
收稿日期 :2005 - 11 - 03 ;修回日期 :2005 - 12 - 09
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.
一个胰蛋白酶单位 (AU) ,是 10ml 反映溶液在 本文叙述的条件下 ,于 410nm 处测得反映前后所增 加 0. 01 光密度为 1 单位 (Absorbance Unit) ,胰蛋白酶 抑制剂活力用胰蛋白酶抑制剂单位 ( TLU) 表示 。 2 结果计算
用 TLUΠml 对分析所用提取液体积 (ml) 做标准 曲线 ,并外推到零 。每克样品的 TLU 值 = 延伸值 × 稀释倍数 ,当用分析的提取液的 TLUΠml 对分析液体 积做图并不是直线关系时 ,则计算出每单位体积提 取液中 TLU 平均值 ,则 TLUΠg 样品 = 平均值 ×稀释 倍数 , 测出常见豆制品结果见附图 。
王英男1 ,修建成2 ,富校轶1 ,李家栋1
(1. 国家大豆工程技术研究中心 ,哈尔滨 150050 2. 哈药总厂哈尔滨康铃科技开发有限责任公司 ,哈尔滨 150086)
摘要 :利用紫外分光光度计 ,对豆制品中胰蛋白酶抑制剂在抑制牛胰蛋白酶活性反应前后的吸光 值差异制作差值曲线 ,从而得出斜率与抑制剂活性之间关系的方法 。并通过反复的实验对比 ,最 终可以快速准确地测定大豆制品中胰蛋白酶抑制剂活性 。 关键词 :豆制品 ;胰蛋白酶抑制剂活性 ;测定方法
Measurement of Trypsin Inhibitor Activities in Soybean Product Wang Yingnan1 ,Xiu Jiancheng2 ,Fu Xiaoyi1 ,Li Jiadong1
大豆胰蛋白酶抑制因子论文
大豆胰蛋白酶抑制因子动科1112班 2011230054 夏娉摘要：大豆胰蛋白酶抑制因子是大豆食品和饲料中的主要抗营养因子，是一种蛋白质或多肽，可与胰蛋白酶结合形成稳定的化合物，从而抑制胰蛋白酶活性。
本文主要从胰蛋白酶抑制因子的理化性质，作用机理，危害，应对措施，展望等方面进行综述。
关键词：胰蛋白酶抑制因子作用机理危害应对措施展望引言：在生大豆中胰蛋白酶抑制因子含量约30毫克/克，它对植物本身有保护作用，可防止大豆自身发生分解代谢，并具有抗虫作用，因此是大豆的含需成分。
[1]。
但随着养殖业的不断发展，为达到更好地养殖效益以及产品质量，对饲喂养殖动物的食品和饲料的要求日益增加，因此对饲料中常见到的抗营养因子的研究越来越受关注，胰蛋白酶抑制因子是大豆食品和饲料中含量高，对畜禽危害最大的一种抗营养因子，可抑制鸡、猪等畜禽的生长，引起胰腺肿大，抑制蛋白酶活性。
本文主要是针对目前已有的大豆胰蛋白酶抑制因子研究作一综述。
1 大豆胰蛋白酶抑制因子的种类和理化性质大豆胰蛋白酶抑制因子是大豆中的主要抗营养因子。
目前从大豆中分离出的胰蛋白酶抑制因子主要是Kunitz型胰蛋白酶抑制因子(KTI)和Bowman- Birk 型胰蛋白酶抑制因子( BBI）。
KTI由181个氨基酸和少量的半胱氨酸形成的2个二硫键组成。
活性中心位于第63号精氨酸和第64号异亮氨酸之间，主要对胰蛋白酶直接且专一的起作用，与胰蛋白酶1:1定量结合[2]。
KTI不溶于乙醇；遇酸和蛋白酶易失活；热不稳定：80℃时短时间加热变性；90℃不可逆失活。
BBI是由71个氨基酸所组成的单肽链，包含7个二硫键，其分子量约为8kDa。
BBI分子中有两个活性中心：一个是赖氨酸16-丝氨酸17，为胰蛋白酶结合位点；另一个是亮氨酸44-丝氨酸45，为胰凝乳蛋白酶结合位点。
[3]BBI不溶于丙酮；对热、酸较稳定；105℃干燥10min仍能保持活性；不易被蛋白酶水解。
这两种抑制因子通过结合位点的作用与胰蛋白酶络合，从而使胰蛋白酶失活，起到对昆虫、动物及人类的抗营养作用。
大豆分离蛋白加工全程中非安全因素浅析
主要包括在大豆贮存期间， 为防止病虫害而使用 的杀虫剂 （ 磷化物、环氧乙烷） 、熏蒸剂 （ 二氧化硫、 溴甲烷、硫酰氟、磷化氢等） 、灭鼠剂 （ 氟化物、氰 化物剧毒农药） 被其吸附。大豆对溴甲烷的吸附量为 ９１．２８％， 我 国 和 许 多 发 达 国 家 已 经 禁 止 使 用 熏 蒸 剂 磷化铝， 日本制定了再残留限量为 ０．０１ ｍｇ／ｋｇ， 氰化 物不得检出。欧盟对溴代甲烷 （ 甲基溴） 、二硫化碳、 四氯 化 碳 、 磷 化 物 残 留 限 量 小 于 ０．１ ｍｇ／ｋｇ， 氰 化 物 类残留限量小于 １５ ｍｇ／ｋｇ［６， １５］。 １．２．４ 原料中的抗营养因子
大豆中含有胰蛋白抑制素、脲酶、凝集素、过敏
·９８·
农产品加工·学刊
２００８ 年第 ７ 期
蛋白等抗营养因子。胰蛋白抑制剂因子是大豆中最主 要的一类抗营养因子， 位于大豆的种子中， 占其蛋白 总量的 ８％￣１０％， 占可溶性蛋白的 １５％￣２０％， 分为 ＫＴＩ 和 ＢＢＴＩ 两类 ， 大 豆 制 品 中 主 要 残 留 的 是 ＢＢＴＩ。 据 Ｖｏｌｌｍａｎｎ 测定， 常规大豆品种的胰蛋白酶抑制剂 活性 （ ＴＩＡ） 为 ８５￣１４０ ｍｇ／ｇ； ＴＩＡ 小于 ８ ｍｇ／ｇ 时， 才 不会对人类造成危害。随着胰蛋白抑制剂活性的降 低， 大豆蛋白有效比率会有所提高［１６￣１９］。
饲料学考试复习资料
饲料：能够提供饲养动物所需养分，保证健康、促进生产和生长，且在合理使用下不发生有毒有害作用的物质。
饲料的营养价值：指饲料本身所含养分以及这些养分被动物利用后所产生的营养效果养分：饲料中凡能被动物用于维持生命、生产产品，具有类似化学成分性质的物质饲料原料：以一种动物、植物、微生物或矿物质为来源的饲料平衡日粮：各种营养物质的种类、数量和相互比例基本能满足营养需要的日粮。
日粮配合：拟定饲料配方的过程或步骤。
日粮：指一个个体饲料动物在24h内所采食的各种饲料组分的总量饲粮：指按日粮中各种饲料组分比例配制的饲料粗饲料：指饲料干物质中CF三18%，以风干物为饲喂形式的饲料。
青绿饲料：供给畜禽饲用的幼嫩青绿饲料植株、茎秆或菜叶，自然状态下水分含量高于60%，种类繁多，分布广，因富含叶绿素得名。
青贮饲料：指天然新鲜青绿植物性饲料为原理，在厌氧条件下，经过以乳酸菌为主的微生物发酵后调制成的饲料，具有青绿多汁的特点青饲作物：农田栽培的农作物或饲料作物，在结实前会结实期刈割做为青绿饲料所用。
能量饲料：粗蛋白含量低于20%，粗纤维含量低于18%的一类饲料蛋白质饲料：指干物质中CP三20%, CF三18%勺饲料饲料添加剂：人们为了满足家畜的营养需要，对天然饲料中已有的营养物质再另外加入起补充或强化作用的一类物质，成为补充物或营养性添加剂。
常量矿物质饲料：包括钙源性饲料、磷源性饲料、食盐以及含硫饲料和含镁饲料再生性饲料资源：指不断产生的资源，一种不灭的养分来源，只要指三大有机物：蛋白质、碳水化合物和脂肪盐化：铡碎或粉碎的秸秆饲料，用1%的食盐水，与等质量的秸秆充分搅拌后，放入容器内或在水泥地面堆放，用塑料薄膜覆盖后，放置12-14小时，使其充分软化。
膨化：利用高压水蒸气处理后突然降压以破坏纤维结构的方法。
全价配合饲料：配合饲料中营养物质种类、数量及其相互比例均能满足畜禽营养需要，并使其达到一定生产水平的饲料。
配合饲料：指按照动物的不同生长阶段、不同生理要求、不同生产用途的营养需要和饲料的营养价值把多种单一饲料以一定比例按规定的工艺流程均匀混合而产生出的营养价值全面的能满足动物各种实际需求的饲料添加剂预混料：指有一种或多种的添加剂原料与载体或稀释剂搅拌均匀的混合物。
大豆中的抗营养因子及处理方法
大豆中的抗营养因子及处理方法
大豆胰蛋白酶抑制因子
大豆中的主要抗营养因子是大豆胰蛋白酶抑制因子（STI）。
生大豆中主要有两种胰蛋白酶抑制因子，一种是库尼兹胰蛋白抑制因子，另一种是鲍曼-贝尔克胰蛋白酶抑制因子。
大豆胰蛋白酶抑制因子可与动物小肠液中的胰蛋白酶结合，降低胰蛋白酶的活性，导致蛋白质消化利用率下降，并能引起动物生长抑制作用，如引起老鼠、小鸡的胰腺肿大和增生等。
因此，钝化大豆胰蛋白酶抑制因子对改善和提高大豆食品与饲料的营养价值和食用安全有重要意义。
胰蛋白酶抑制因子的检测方法
常用来检测大豆胰蛋白酶抑制因子的方法是脲酶检测法和氢氧化钾检测法。
生大豆中的脲酶与胰蛋白酶抑制因子的含量相近，变性失活的程度也与胰蛋白酶抑制因子相似，故可用脲酶活性作为大豆加工适宜程度的检测指标。
而氢氧化钾检测法是用来评估大豆加工过度和加工不足的最佳方法。
但是这两种方法并不能直接测出蛋白酶抑制因子的含量。
胰蛋白酶抑制因子失活方法
近十年来国内外对于大豆胰蛋白酶抑制因子失活方法与技术的研究，主要在物理失活、化学失活、生物学失活等几个方面获得明显的进展。
其中，物理方法包括热失活法、超声波失活法和其他失活法。
到目前为止,热处理仍是消除大豆中胰蛋白酶抑制因子的主要方法。
其
原理是通过加热,破坏饲料中对热不稳定的抗营养因子。
通常在120℃条件下加热10分钟，大豆中的抗营养因子可以失活，并且较好地保存大豆的营养价值。
胰蛋白酶抑制剂
植物化学物质，如植酸和胰蛋白酶抑制剂等。 胰蛋白酶抑制剂(STI)具有特殊效能，其生物活 性对治疗由营养过剩产生的疾病(如高血压和癌
症)有促进作用。
• 大豆胰蛋白酶抑制剂是具有抑制胰 蛋白酶作用的类物质，可以调控生 物体内生理反应，具有多种药理活 性,包括抗炎、抗病毒、抗肿瘤等。 对结肠癌、前列腺癌、乳腺癌，子 宫内膜癌，人宫颈癌的研究已经证 实大豆胰蛋白酶抑制剂有明显的抗 肿瘤作用。
大豆胰蛋白酶抑制剂 (soybean trypsi inhibitor，简称STI)是大豆 中主要抗营养因子，是一 种多肽类或蛋白质。组成 多肽氨基酸残基在72～ 197个左右，氨基酸残基 组成及性质差异，决定大 豆胰蛋白酶抑制剂差异。 大豆中胰蛋白酶抑制剂约 有7～1O种 ，目前，从大 豆中已分离出两种类型蛋 白抑制剂：即Kunitz型胰 蛋白酶抑制剂(KsTI)和 Bowman．Birk型胰蛋白 酶抑制剂(BBI)。
作用机理
这两种抑制剂使酶失活机理为：大豆胰蛋白 酶抑制剂链环结构中暴露氨基酸残基(活性部 位)与胰蛋白酶中氨基酸发生络合作用，使蛋 白酶失去酶解能力，抑制该酶活性，防止蛋 白质消化成氨基酸，这样就去除了快速生长 的癌细胞所需要的氨基酸。
现状及前景
目前临床上广泛应用于 急性胰腺炎、外科手术、 脑血管疾病、妇产科疾 病和休克。因此，胰蛋 白酶抑制剂是人类重要 的生化试剂和药物资源。
• 但现在胰蛋白酶抑制剂在抗癌方面只在 临床试验阶段，实验室研究已取得成功， 所以开发这方面的药物很有前景。
建议大家多吃豆类食品
大豆胰蛋白酶抑制因子(TI)-NEWA
本试剂盒只能用于科学研究，不得用于医学诊断大豆胰蛋白酶抑制因子（TI）ELISA检测试剂盒使用说明书检测原理试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。
往预先包被大豆胰蛋白酶抑制因子（TI）抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。
用底物TMB 显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的大豆胰蛋白酶抑制因子（TI）呈正相关。
用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。
样品收集、处理及保存方法1. 样本不能含叠氮钠（NaN3），因为叠氮钠（NaN3）是辣根过氧化物酶（HRP）的抑制剂。
2. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行。
3. 植物萃取液或其它相关样本：请1000 x g离心20分钟，取上清即可检测。
4. 保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
自备物品1.酶标仪（450nm）2.高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL3.37℃恒温箱操作注意事项1. 试剂盒保存在2-8℃，使用前室温平衡20分钟。
从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解后再使用。
2. 实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。
3. 浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对照或者空白；按照说明书操作时样本已经稀释5倍，最终结果乘以5才是样本实际浓度。
4. 严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。
5. 所有液体组分使用前充分摇匀。
试剂盒组成名称96孔配置48孔配置备注微孔酶标板12孔×8条12孔×4条无标准品0.3mL*6管0.3mL*6管无样本稀释液6mL 3mL 无检测抗体-HRP 10mL 5mL 无20×洗涤缓冲液25mL 15mL 按说明书进行稀释底物A 6mL 3mL 无底物B 6mL 3mL 无终止液6mL 3mL 无封板膜2张2张无说明书1份1份无自封袋1个1个无注：标准品（S0-S5）浓度依次为：0、50、100、200、400、800 ng/mL试剂的准备20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。
大豆胰蛋白酶抑制剂的研究进展
具有 的特征 性规则 结构 域 。但 Ｂ Ｉ Ｂ 环形 结构 的独特 之处
大豆胰蛋 白酶抑 制剂 （Ｔ ） Ｓ Ｉ 是一种 多肽类 或蛋 白
质 。它对植物本身具有保护作用 ， 可防止大豆籽粒 自身 发生分解代谢 ， 使种子处于休眠状态 ， 能调节大豆蛋 白质
的合成 与分解 ， 具 有抗 虫 作用 ， 并 因而 是 大豆 必 需 成 分 。
（．广西职业技术学院 ， １ 广西 南宁 ５０ ０ ；．华南理工大学 轻工与食品学院 ， ３０ １２ 广东 广卅Ｉ １６ ０ ０４ ； ５ ３ ．华南理工大学 分析测试 中心 ， 广东 广州 ５０４ ） １６０
摘
要 ： 结构 、 从 毒理 学分析和灭活方法 ３个方面对 国 内外近年来对大豆胰蛋 白酶抑制 剂的研究进展进行 了综述。
它在人 类饮食 中的作 用 也越 来 越 受 到重 视 。然 而 ， 大豆 蛋 白（ 对人 类 而 言 ） 不 是 一 种 理 想 的 蛋 白质 来 源 。除 并
Ｂ ｕ ａ 作为丙酮不溶 因子从大豆 中分离 出来 ， ｏａｎ ｎ 其分离
过 程包括 利用 ６％ 乙醇 溶 液 浸 提 大 豆并 用 丙 酮 沉 淀 出 ０ 这 种抑制 剂 ； 之后 ， ｉ Ｂｒ ｋ于 １６ 年 成 功 纯化 并 定 义 这种 ９１
了氨基酸组成方面的限制之外 ， 抗营养因子也限制 了大
大豆膨化参数选择及膨化大豆在断奶仔猪日粮中应用
河北农业大学硕士（毕业）论文文献综述膨化全脂大豆的研究进展及其在断奶仔猪上的应用ｊ年—Ｌ剐百蛋白质是动物必需的一种营养物质，在机体内发挥着重要的作用。
仔猪断奶后必须从饲料中摄取足够的蛋白质，才能维持正常的生命和生产活动，同时防止各种缺乏症的出现。
大豆是一种优良的蛋白质资源，其中含有３５％的粗蛋白，而且必需氨基酸丰富平衡，它为全世界提供了超过１／４的油脂和２／３的蛋白质。
但生大豆中含有胰蛋白酶抑制因子（ＴＩ）等抗营养因子和抗原蛋白——大豆球蛋白和１３—伴大豆球蛋白，用生大豆喂仔猪会引起仔猪腹泻及生产性能的降低。
早期断奶仔猪腹泻是影响仔猪生产的一个世界性难题。
近二十年的研究表明：饲粮是引起仔猪断奶后腹泻的重要原因。
饲粮的蛋白质水平和来源、纤维物质、饲料的酸碱性、矿物质及抗营养因子均与腹泻有关。
其中蛋白质水平是引起腹泻的直接原因之一，高蛋白日粮比低蛋白日粮更易造成腹泻。
Ｓｔｏｋｅｓ等（１９８７）…观察到３周龄断奶仔猪采食大豆为唯一蛋白质来源的饲粮后第５天发生超敏反应，一周后超敏反应消失。
Ｌｉ等（１９９１）”１测出早期断奶仔猪采食大豆蛋白后血液中含有高水平的抗大豆抗体ＩｇＧ。
因此如何去除大豆中的抗原物质及抗营养因子，降低或消除其抗营养作用，提高大豆的营养价值，是多年来人们十分关心的研究课题。
为了降低大豆对断奶仔猪腹泻及生产性能的不利影响，提高大豆中各种养分的利用率，人们对大豆产品的加工工艺进行了无数研究。
０ｓｂｏｒｍｅ和Ｍｅｎｄｅｌ（１９１７）”１首次发表了关于热处理可以极大地改善大豆对生长鼠的营养价值的研究报道。
２０世纪５０年代美国将膨化技术应用于饲料工业。
挤压膨化的高温、高压、高剪切力的瞬时作用，有利于蛋白质的变性、淀粉的糊化及大豆油细胞的破裂，从而提高大豆的营养价值，因此受到人们的普遍关注。
到了８０年代该技术便成为国外发展速度最快的饲料加工新技术。
主要用于特种动物、水产饲料及断奶仔猪料的开发，最近１０年，在美国和欧洲，人们喜欢用整粒熟大豆饲喂家畜，膨化全脂大豆在畜禽上的应用得到了空前发展。
大豆的抗营养因子介绍
大豆中的抗营养因子大豆因其蛋白质含量高和氨基酸平衡性好而成为动物理想的植物性蛋白质源。
遗憾的是，大豆中含有多种抗营养因子，包括膜蛋白酶抑制子、凝集素、异黄酮、抗原蛋白、抗维生素因子、单宁、皂甙、脲酶、赖丙氨酸、硫葡萄糖甙和生物碱等。
这些抗营养因子通过干扰营养物质的消化吸收、破坏正常的新陈代谢和引起动物不良的生理反应等多种方式危害动物尤其是幼龄动物的生长和健康，从而在一定程度上降低了大豆及大豆制品在动物中的利用。
自从发现大豆中存在抗营养因子以来，人们就一直试图通过化学处理、热处理、挤压处理等方式削弱或去除抗营养因子的活性。
1、大豆抗营养因子的种类和特性按照抗营养作用方式的不同，通常将大豆抗营养因子分为以下6类：抑制蛋白质消化和利用的因子，包括胰蛋白酶抑制因子、糜蛋白酶抑制因子和凝集素等；影响碳水化合物消化的因子，包括酚类化合物(单宁)和寡糖等；降低矿物元素利用的因子，如植酸；抗维生素因子，包括抗维生素A、维生素D、维生素E 和维生素B 12等因子；剌激免疫系统的抗营养因子，如致过敏反应蛋白等以及其它一些抗营养因子，包括致甲状腺肿因子、皂甙、异黄酮和生氧糖甙等。
其中胰蛋白酶抑制因子、糜蛋白酶抑制因子、凝集素、致甲状腺肿因子及抗维生素因子具有对热敏感的特性，而皂甙、单宁、异黄酮、寡糖、致过敏反应蛋白及植酸等对热稳定。
2 、大豆抗营养因子的作用机理2.1 大豆蛋白酶抑制因子大豆蛋白酶抑制因子是指能和蛋白酶的必需基因发生化学反应，从而抑制蛋白酶与底物结合，使蛋白酶的活力下降甚至丧失的一类物质。
通常所说的蛋白酶抑制因子是指蛋白质类胰蛋白酶抑制因子(Trypsin Inhibitors，TI)。
根据其结构组成可分为库尼兹大豆胰蛋白酶抑制因子(kunitz Trypsin Inhibitor，KTI)和包曼-伯克膜蛋白酶抑制因子(Bowmm-Birk Proteinase inhibitor，BBI)两类，生大豆中含有1.4%的KT I和0.6%BBI。
胰蛋白酶（Trypsin）试剂盒说明书（分光光度法）
胰蛋⽩酶（Trypsin）试剂盒说明书（分光光度法）正式测定前务必取2-3个预期差异较⼤的样本做预测定测定意义：胰蛋⽩酶选择性⽔解变性蛋⽩质中由赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链，是⼀种重要的消化酶。
此外，胰蛋⽩酶还⼴泛应⽤于脓胸、⾎胸、外科炎症、溃疡、创伤性损伤等所产⽣的局部⽔肿、⾎肿及脓肿等的辅助治疗。
测定原理：胰蛋⽩酶催化⽔解TAME的酯键，释放出的游离羧基与反应体系中的氢氧化钠发⽣中和反应，导致溶液的pH值降低，以**红为指⽰剂，测定溶液在555nm处吸收值的变化，可以快速测得胰蛋⽩酶活性数据。
胰蛋⽩酶在⼀定范围内与555nm处吸收值的降低呈良好的线性关系。
组成：产品名称PI007-50T/48S Storage提取液：液体60ml4试剂⼀：液体10ml4试剂⼆：液体10ml4避光试剂三：液体4ml4说明书⼀份⾃备仪器和⽤品：紫外可见分光光度计、1ml玻璃⽐⾊⽫、台式离⼼机、⽔浴锅、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏⽔。
粗酶液提取：提取：粗酶液1、组织样品：按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为1：5~10的⽐例（建议称取约0.1g组织，加⼊1ml提取液）冰浴匀浆，10000g，4离⼼10min，取上清，即粗酶液。
测定步骤：1、分光光度计预热30min以上，调节波长⾄555nm，蒸馏⽔调零。
⼯作液的配制：临⽤前根据⽤量按照试剂⼀（V）：试剂⼆（V）：蒸馏⽔（V）：试剂三（V）=1ml：1ml：5.4ml：0.4ml的⽐例充（注意：现⽤现配，⽤多少配多少，在空瓶中配制，试剂盒中带有4个空瓶）分混合。
（注意：现⽤现配，⽤多少配多少，在空瓶中配制，试剂盒中带有3. 吸取25µl样本，加⼊975µl⼯作液，混匀后⽴即测定，记录555nm下1min时的吸光值A1和2min时的吸光值A2。
计算A=A1-A2注意：如果A⼩于0.005，可将反应时间延长到5min。
如果A⼤于0.5，体系迅速变⾊，可将样本⽤提取液稀释后测定（建议稀释10倍），计算公式中乘以相应稀释倍数。
大豆抗营养因子的研究概况_刁恩杰
粮油加工与食品机械 油脂工程大豆抗营养因子的研究概况刁恩杰 丁晓雯(西南农业大学食品学院)摘 要 大豆具有很高的营养价值,但大豆中存在的抗营养因子阻碍了机体对营养物质的消化吸收和利用。
本文分别介绍了各种抗营养因子的结构、抗营养机理及去除方法。
关键词 大豆;抗营养因子;研究中图分类号:TS214 文献标识码:A 文章编号:1009-1807(2003)08-0040-03大豆抗营养因子(简称AHFs)根据耐热性分为热稳定性和热不稳定性。
其中热稳定性包括大豆抗原蛋白、植酸、大豆寡糖等;热不稳定性包括胰蛋白酶抑制剂、糜蛋白酶抑制剂、植物凝集素、致甲状腺肿素、脂肪酶抑制剂、皂甙等。
1 抗营养因子1 1 胰蛋白酶抑制剂大豆胰蛋白酶抑制剂(简称ST I)是大豆中的主要抗营养因子,相对分子量在7975~21500之间的多肽类或蛋白质,具有生物活性,其在大豆中含量约2%。
大豆中的胰蛋白酶抑制剂(简称T I)约有7~10种,但迄今只有2种胰蛋白酶抑制剂得到较详细的研究。
蛋白酶抑制剂的主要抗营养机理是它与胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶结合成复合物,使这些酶失去活性。
这样,一方面影响糜蛋白酶的消化,另一方面又可反馈促使胰脏增加这些消化酶的分泌而造成内源蛋白质的大量损失,从而制约了营养成分的利用,使转化率降低。
1 2 植物凝集素大豆的植物凝集素是一个四聚体糖蛋白,有数量相等的结构并由不同的2种亚基构成。
其抗营养作用机理是通过它与肠粘膜上皮细胞受体结合导致细胞内吞,进而干扰消化和吸收,由于肠粘膜的损伤,会使粘膜上皮的通透性增加,这样,植物凝集素和其他一些肽类便可被人体吸收,可对机体的免疫系统产生影响。
1 3 凝血素大豆中的凝血素是一种以高亲和性将聚糖结合在糖蛋白、糖脂或多糖上的糖蛋白。
近来研究表明:大豆凝血素除凝血作用外,还具有刺激肠壁、妨碍消化吸收营养物质以及影响小肠粘膜细胞代谢、肠道内细菌生态及免疫机能等不良作用。
1 4 致甲状腺肿素致甲状腺肿素在大豆中含量极微,其前体物质是硫代葡萄糖苷。
豆粕中抗营养因子及其消除方法
豆粕中抗营养因子及其消除方法摘要：大豆是重要的植物蛋白质和油脂来源，具有极高的营养价值，在畜禽饲料中得到广泛应用。
但大豆中的抗营养因子限制了大豆及其制品在畜禽饲料中的利用水平。
因此，人们对大豆抗营养因子的钝化方法进行研究。
本文简要地介绍了几种主要的大豆抗营养因子，并对使大豆抗营养因子失活的方法和发酵豆粕的营养特性进行了综述，为发酵豆粕在畜禽饲料中的广泛应用提供依据。
关键词：发酵豆粕，大豆抗营养因子，钝化二十世纪九十年代以来，在英国疯牛病危机之后，引发了人们对畜禽饲料中动物来源蛋白质安全性的担忧，世界各国纷纷禁止动物源蛋白质在饲料中使用，由此相应地增加了对高质量植物蛋白的需求量。
这意味着能够提供优质蛋白质的大豆和大豆蛋白制品必将在今后的畜禽饲料配制中扮演更加重要的角色。
然而，大豆中含有的抗营养因子降低了养分的有效性，限制了其在动物饲料中的使用。
因此，通过育种、加工和营养等手段来降低大豆及其制品中抗营养因子的含量，提高养分的利用率一直是营养学家们工作的重点。
豆粕是大豆经浸提或预压浸提制油工艺的副产物，为植物性蛋白质饲料的主要来源之一，占畜禽蛋白质饲料原料用量的百分之六十以上。
大豆榨油过程中的热处理可以有效地灭活大豆中的胰蛋白酶抑制因子和大豆凝集素等抗营养因子，但生产中对热处理必须进行严格控制：加热不足不能完全灭活抗营养因子，而加热过度，有可能因发生美拉德反应而降低养分的可利用率，使得豆粕的营养特性发生很大的变化（Helena等，2003），与传统的豆粕相比，发酵豆粕在营养成分含量、氨基酸有效性和抗营养因子去除率等方面均有很大提高。
发酵豆粕是采用独特的菌种和发酵工艺，利用微生物发酵过程中分泌的蛋白酶使大豆蛋白被分解成小分子蛋白和小肽分子，游离氨基酸和UGF（未知生长因子）等物质，同时能消减抗营养因子的一些作用，使其易被幼龄动物消化吸收。
因此，发酵豆粕作为功能性饲料蛋白质而受到广泛关注。
大量的研究将发酵大豆蛋白和豆粕对于早期断奶仔猪的饲养效果进行比较（Cho等，2007），表明发酵过程中的酶解作用使发酵豆粕中含有较高比例的小肽（Hong等，2004）以及降低了发酵豆粕中的抗营养因子含量（Reddy和Pierson，1994）。
大豆胰蛋白酶抑制剂的制备及性质
大豆胰蛋白酶抑制剂的制备及性质程芬芬;刘春;杨晓泉【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2017(038)003【摘要】采用硫酸钠盐析法从大豆乳清废水中选择性回收大豆胰蛋白酶抑制剂(soybean trypsin inhibitor,STI), 且以商品化的Kunitz型胰蛋白酶抑制剂(soybean Kunitz trypsin inhibitor,KTI)为对照表征STI的理化性质和界面性质.结果表明,STI提取优化条件为:乳清溶液固形物含量13％、pH4、加盐量9g/100 mL,此条件下STI的得率为20.54％;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱显示,其主要成分为KTI,以苯甲酰-DL-精氨酸-p-硝基酰替苯胺盐酸盐为底物的胰蛋白酶抑制活力为2 135.00 TIU/mg,且具有良好的温度和pH值稳定性(80℃加热30 min后仍保持73.19％的抑制活力,在pH 2～11范围内抑制活力无明显变化);傅里叶变换红外光谱和圆二色性结果显示,其与KTI (Sigma T9218)的结构类似,二级结构主要是β-折叠和无规卷曲;界面性质数据表明,STI分子能很快吸附到气水界面形成高弹性界面,从而使其具有良好的起泡性和泡沫稳定性.因此,简单的硫酸钠盐析法是大规模制备高纯度且功能性质良好的STI的有效方法,所获得的STI在医药及功能性食品领域有潜在的应用价值.【总页数】8页(P37-44)【作者】程芬芬;刘春;杨晓泉【作者单位】华南理工大学食品科学与工程学院食物蛋白工程研究中心,广东广州510640;华南理工大学食品科学与工程学院食物蛋白工程研究中心,广东广州510640;华南理工大学食品科学与工程学院食物蛋白工程研究中心,广东广州510640【正文语种】中文【中图分类】S565.1【相关文献】1.大豆胰蛋白酶抑制剂的提取纯化及其对凡纳滨对虾类胰蛋白酶的抑制作用 [J], 郑鸯鸯;吉薇;吉宏武;苏伟明;刘书成2.大豆胰蛋白酶抑制剂的制备与性质测定 [J], 方林求3.重组Bowman-Birk型大豆胰蛋白酶抑制剂的性质及抑制机理 [J], 刘利;杨帆;李素霞;郭奥;刘晓;王之可4.大豆胰蛋白酶抑制剂与大豆抗大豆胞囊线虫的关系 [J], 杨少旭;段玉玺;陈立杰;王雪;周博5.大豆（G．max）胰蛋白酶抑制剂SBTi－A_2新类型Ti^x的纯化及其性质研究[J], 严晴燕;曹凯鸣;徐隽;林锐;李严;顾其敏;赵述文因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
本试剂盒只能用于科学研究，不得用于医学诊断大豆胰蛋白酶抑制因子（TI）ELISA检测试剂盒使用说明书检测原理试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。
往预先包被大豆胰蛋白酶抑制因子（TI）抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。
用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的大豆胰蛋白酶抑制因子（TI）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。
样品收集、处理及保存方法1.样本不能含叠氮钠（NaN3），因为叠氮钠（NaN3）是辣根过氧化物酶（HRP）的抑制剂。
2.标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行。
3.植物萃取液或其它相关样本：请1000x g离心20分钟，取上清即可检测。
4.保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
自备物品1.酶标仪（450nm）2.高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL3.37℃恒温箱操作注意事项1.试剂盒保存在2-8℃，使用前室温平衡20分钟。
从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解后再使用。
2.实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。
3.浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对照或者空白；按照说明书操作时样本已经稀释5倍，最终结果乘以5才是样本实际浓度。
4.严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。
5.所有液体组分使用前充分摇匀。
上海笃玛生物科技有限公司试剂盒组成名称96孔配置48孔配置备注微孔酶标板12孔×8条12孔×4条无标准品0.3mL*6管0.3mL*6管无样本稀释液6mL3mL无检测抗体-HRP10mL5mL无20×洗涤缓冲液25mL15mL按说明书进行稀释底物A6mL3mL无底物B6mL3mL无终止液6mL3mL无封板膜2张2张无说明书1份1份无自封袋1个1个无注：标准品（S0-S5）浓度依次为：0、50、100、200、400、800ng/mL试剂的准备20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。
洗板方法1.手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加满洗涤液，静置1min后甩尽孔内液体，在吸水纸上拍干，如此洗板5次。
2.自动洗板机：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。
操作步骤1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；3.样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加。
4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。
6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。
结果判断绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。
上海笃玛生物科技有限公司试剂盒性能1.准确性：标准品线性回归与预期浓度相关系数R值，大于等于0.9900。
2.灵敏度：最低检测浓度小于1.0ng/mL。
3.特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。
4.重复性：板内、板间变异系数均小于15%。
5.贮藏：2-8℃，避光防潮保存。
6.有效期：6个月免责声明1.试剂盒仅供研究使用，不得用于临床实验或人体实验，否则所产生的一切后果，由实验者承担，本公司概不负责。
2.严格按照说明书操作，实验者违反说明书操作，后果由实验者承担。
上海笃玛生物科技有限公司FOR RESEARCH USE ONLY.NOT FOR USE IN DIAGNOSTIC PROCEDURES. Soybean trypsin inhibitor(TI)ELISA Kit instruction Intended useThis TI ELISA kit is intended Laboratory for Research use only and is not for use in diagnostic or therapeutic procedures.The Stop Solution changes the color from blue to yellow and the intensity of the color is measured at450nm using a spectrophotometer.In order to measure the concentration of TI in the sample,this TI ELISA Kit includes a set of calibration standards.The calibration standards are assayed at the same time as the samples and allow the operator to produce a standard curve of Optical Density versus TI concentration.The concentration of TI in the samples is then determined by comparing the O.D.of the samples to the standard curve.Sample collection and storages1.Can’t detect the samples which contain NaN3,because NaN3inhibits HRPactivity of the horseradish peroxidase.2.Extract as soon as possible after Specimen collection,Extracted according to the relevant literature.Cell culture supernates and plant exact fluids-Remove particulates by centrifugation and assay immediately or aliquot and store samples at-20°C or -80°C.Avoid repeated freeze-thaw.Materials required but not supplied1.Standard microplate reader(450nm)2.Precision pipettes and Disposable pipette tips.3.37℃incubatorPrecautions1.Do not substitute reagents from one kit to another.Standard,conjugate and microplates are matched for optimal e only the reagents supplied by manufacturer.2.Do not remove microplate from the storage bag until needed.Unused strips should be stored at2-8°C in their pouch with the desiccant provided.3.Mix all reagents before using.Remove all kit reagents from refrigerator and allow them to reach room temperature (20-25°C)上海笃玛生物科技有限公司Materials suppliedName96determinations48determinations Microelisa stripplate12*8strips12*4stripsStandard0.3ml*6tubes0.3ml*6tubesSample Diluent 6.0ml 3.0mlHRP-Conjugate reagent10.0ml 5.0ml20X Wash solution25ml15mlChromogen Solution A 6.0ml 3.0mlChromogen Solution B 6.0ml 3.0mlStop Solution 6.0ml 3.0mlClosure plate membrane22User manual11Sealed bags11Standard(S0→S5)concentration was followed by:0,50,100,200,400,800 ng/mlReagent preparation20×wash solution:Dilute with Distilled or deionized water1:20.Assay procedure1.Prepare all re a g e n t s before starting assay procedure.It is recommended that all Standards and Samples be added in duplicate to the Microelisa Stripplate.2.Add standard:Set Standard wells,testing sample wells.Add standard50μl to standard well.3.Add Sample:Add testing sample10μl then add Sample Diluent40μl to testing sample well;Blank well doesn’t add anyting.4.Add100μl of HRP-conjugate reagent to each well,c over with an adhesive strip and incubate for60minutes at37°C.5.Aspirate each well and wash,repeating the process four times for a total of five washes.Wash by filling each well with Wash Solution(400μl)using a squirt bottle, manifold dispenser or plete removal of liquid at each step is essential to good performance.After the last wash,remove any remaining Wash Solution by aspirating or decanting.Invert the plate and blot it against clean paper towels.6.Add chromogen solution A50μl and chromogen solution B50μl to each well. Gently mix and incubate for15minutes at37°C.Protect from light.7.Add50μl Stop Solution to each well.The color in the wells should change from blue to yellow.If the color in the wells is green or the color change does not appear uniform,gently tap the plate to ensure thorough mixing.8.Read the Optical Density(O.D.)at450nm using a microtiter plate reader within15minutes.Calculation of results1.This standard curve is used to determine the amount in an unknown sample.The standard curve is generated by plotting the average O.D.(450nm) obtained for each of the six standard concentrations on the vertical(Y)axis上海笃玛生物科技有限公司versus the corresponding concentration on the horizontal(X)axis.2.First,calculate the mean O.D.value for each standard and sample.All O.D.values,are subtracted by the mean value of the zero standard before result interpretation.Construct the standard curve using graph paper or statistical software.3.To determine the amount in each sample,first locate the O.D.value on theY-axis and extend a horizontal line to the standard curve.At the point of intersection,draw a vertical line to the X-axis and read the corresponding concentration.4.Any variation in operator,pipetting and washing technique,incubation time ortemperature,and kit age can cause variation in result.Each user should obtain their own standard curve.5.The sensitivity by this assay is1.0ng/ml6.StandardcurveStorage：2-8℃.validity：six months.FOR RESEARCH USE ONLY;NOT FOR THERAPEUTIC ORDIAGNOSTIC APPLICATIONS!PLEASE READ THROUGHENTIRE PROCEDURE BEFORE BEGINNING!上海笃玛生物科技有限公司。