一株高效广谱染料降解细菌的分离鉴定及脱色特性研究[1]
高效苯酚降解菌Bacillus sp. L5-1的分离及其降解特性
中国环境科学 2021,41(5)：2441~2448 China Environmental Science 高效苯酚降解菌Bacillus sp. L5-1的分离及其降解特性刘庆辉,李剑*,杨航,王志宇,李艳,张玮川,贾银娟,张秋根,罗旭彪(南昌航空大学,重金属污染物控制与资源化国家地方联合工程研究中心,江西南昌 330063)摘要：从污水处理厂活性污泥中分离筛选出一株高效苯酚降解菌L5-1,经菌落形态观察和16S rDNA基因测序,结果表明菌株L5-1为蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus),美国国家生物信息中心(NCBI)的注册号为MN784421.将苯酚设置为唯一碳源,对其生长和苯酚降解特性展开研究.结果表明: 菌株L5-1在10%接种量、温度30~35℃、pH值7~8的条件下,均能高效降解培养基中苯酚(培养基体积为100mL,初始苯酚浓度为500mg/L,14h时降解率>93%).而在最优降解条件下(10%接种量,培养温度为35,pH℃值7.0,NaCl浓度为1%),初始苯酚浓度为500mg/L,菌株在14h内的苯酚降解率可达97.1%;而当初始苯酚浓度为1000mg/L,菌株也可在46h内达到97.71%的降解率.运用Haldance方程动力学模拟菌株在不同浓度苯酚下的生长过程,其最大比生长速率为0.355h-1,半饱合常数104.27mg/L,抑制常数为322.83mg/L,R2=0.997. 菌株L5-1为目前已报道的Bacillus菌属中降解苯酚能力较强的菌株,为实际处理含酚废水中提供理论参考.关键词：Bacillus cereus；苯酚；生物降解；动力学中图分类号：X172 文献标识码：A 文章编号：1000-6923(2021)05-2441-08Isolation and degradation characteristics of highly efficient phenol-degrading bacteria Bacillus sp. L5-1. LIU Qing-hui, LI Jian*, YANG Hang, WANG Zhi-yu, LI Yan, ZHANG Wei-chuan, JIA Yin-juan, ZHANG Qiu-gen, LUO Xu-biao (National-Local Joint Engineering Research Center of Heavy Metals Pollutants Control and Resource Utilization, Nanchang Hangkong University, Nanchang 330063, China). China Environmental Science, 2021,41(5)：2441~2448Abstract：A highly efficient phenol-degrading bacterium named L5-1 was isolated and screened from the activated sludge from a sewage treatment plant. The colony morphology observation and 16S rDNA gene sequencing showed that the strain L5-1 was Bacillus cereus, with the registration number of MN784421 in the US National Center for Biotechnology Information (NCBI). A series of experiments with Phenol as the only carbon source were conducted to study the growth and phenol degradation characteristics of this strain L5-1. The results showed that under the conditions of 10% inoculum, temperature range of 30 to 35℃, pH range of 7 to 8 , the strain L5-1 effectively degraded phenol in the culture medium (with the 100mL of medium volume and the initial phenol concentration of 500mg/L), the degradation rate was better than 93% in 14h. Under optimal degradation conditions (10% inoculum, culture temperature at 35℃, pH 7.0, and NaCl concentration at 1%), The phenol degradation rate reached 97.1% within 14 hours when the initial concentration was set at 500mg/L. When the initial phenol concentration was set to 1000mg/L, the strain L5-1 still reached 97.71% degradation rate within 46 hours. The Haldane kinetic model was used to simulate the growth process of strains under different concentrations of phenol. The maximum specific growth rate was 0.355h-1, the semi-saturation constant was 104.27mg/L, the inhibition constant was 322.83mg/L, R2=0.997. This study confirmed Strain L5-1 was a Bacillus strains with strong phenol degradation ability among the reported strains of the genus Bacillus, and provided certain theoretical references for the actual treatment of phenol-containing wastewater.Key words：Bacillus cereus；phenol；biodegradable；kinetics苯酚污染废水是一种典型的高毒性工业废水,是纺织加工、煤炭气化、石油精炼、皮革制造、树脂合成、医药制造、香料生产、合成纤维等许多工业过程中常见的有机污染物[1].并且苯酚具有很强的流动性,在浓度很低时(1mg/L)也能快速渗透到周围生态环境中,导致水体有难闻的气味和味道,对动植物有长效性和生物积累性[2].美国和中国也先后将苯酚列入首批水中优先控制污染物名单[3].目前含酚废水的处理方法主要有物理法、化学法和生物法.利用生物法替代物理化学法矿化废水中的苯酚具有成本低、效率高等特点,且降解后的最终产物多为环境无害物质,如低碳化合物,二氧化碳和水[4-5].因此,利用生物法处理含酚废水受到广泛关注.近年来,国内外学者就如何利用微生物降解苯收稿日期：2020-09-25基金项目：国家自然科学基金资助项目(21467018);江西省教育厅项目(GJJ170576);江西省重点研发计划项目(20181ACG70021)* 责任作者, 副教授,***************.cn2442 中国环境科学 41卷酚污染废水进行了大量的研究, 筛选出多种菌株,有根瘤菌(rhizobia)[6]、不动杆菌如Acinetobacter calcoaceticus[7]和Acinetobacter sp.AQ5NOL 1[8]、红球菌如Rhodococcus erythropolis[9]和Rhodococcus spp.CM-HZX1[10]、产碱杆菌(Alcaligenes sp.)[11]等.其中有许多能降解高浓度苯酚并具有良好耐受性的微生物,如Jiang等[12]从湖北某药厂的生物池中分离出Candida genus,能在72h内降解800mg/L苯酚.陈晓华等[13]从北京一处人工湿地分离出的Ochrobactrum sp.可耐受1300mg/L苯酚并在48h内对1000mg/L苯酚降解率达到82.2%,王图锦等[14]从一个焦化厂受污染的土壤中分离出不动杆菌,能在60h内完全降解初始浓度1200mg/L苯酚. Shourian 等[15]从制药处理废水中分离出的Pseudomonas sp.能在85h内降解1000mg/L苯酚.在目前发现的众多苯酚降解菌中,有不少研究报道Bacillus菌属能有效降解苯酚. Bacillus thuringiensis J20 在120h内对700mg/L的苯酚降解率为88.6%[16],Bacillus brevis 降解1000mg/L苯酚需132h[17].其中Bacillus cereus 降解废水中苯酚的研究较少,苯酚降解效率也较低,菌株Bacillus cereus F6在8h内仅能降解100mg/L 苯酚[18],Bacillus cereus B3降解800mg/L的苯酚需72h[19].本文取江西南昌象湖污水处理厂的曝气池活性污泥,在实验室模拟工业含酚废水逐步驯化苯酚降解菌,筛选出一株对高浓度苯酚耐受并且降解效果优异的菌株L5-1,探讨了培养条件(接种量、温度、pH值、盐度、初始苯酚浓度)对L5-1生长及苯酚降解的影响.并将实验数据与Haldance方程动力学模型相拟合,探究了菌株生长和初始苯酚浓度之间的关系,以期为微生物处理苯酚污染废水提供理论参考.1材料与方法1.1菌种的来源本研究用来分离筛选菌株的样品取自江西南昌象湖污水厂曝气池活性污泥(黑色絮状).1.2培养基的制备无机盐培养基(g/L):NH4NO31.50,KH2PO4 1.50, K2HPO4 1.2, NaCl 5.00, MgSO4 0.06, MnSO4 0.02, H3BO3 0.02,ZnSO4.7H2O 0.03, FeSO4 0.05,通过1mol/L的NaOH和HCl调节pH值.定容至指定体积后灭菌备用.富集培养基(g/L):牛肉浸膏4,蛋白胨8,NaCl 4.定容至指定体积后灭菌备用.固体培养基:在已配好的液体培养基中加入1.8%(质量分数)的琼脂粉制成固体培养基,经高压灭菌锅中灭菌后倒入无菌培养皿冷却备用.1.3菌种的富集与驯化将适量活性污泥加入到100mL无菌生理盐水中,在30,150r℃/min下充分振荡1h,取10%体积的菌液,在无菌环境下接种到灭菌后的富集培养基中.在30,150r℃/min下培养到对数增长期后,取10mL富集菌液接种到90mL的无机盐培养基中,并添加苯酚作为唯一碳源.在同样的培养条件下重复此操作,以100mg/L为增加量逐步提升苯酚浓度至1000mg/L.选择生长较好的培养基进行下一步实验.1.4苯酚降解菌的筛选与纯化用无菌水将培养至对数期的菌液稀释成不同浓度梯度.在无菌环境下均匀地涂布在固体培养基表面.在恒温培养箱中倒置培养,定时观察,挑取形态及大小、颜色不同的单一菌落,于事先配置好的300mg/L苯酚的固体无机盐培养基上划线,得到单一纯菌.将分离的单一纯菌富集培养至OD600为1.0左右,作为接种体备用.以10%(体积比)的接种量加入到无机盐培养基中,添加苯酚作为唯一碳源.在30℃、150r/min,以相同条件下没有加入菌液但添加了相同浓度苯酚的无机盐培养基作为对照组,通过定时检测各培养基的苯酚浓度选择出降解效果最好的菌株,最后再反复划线确保得到单株菌种.并用斜面低温保存.1.5菌株生长和苯酚降解率的测定细菌生长量的测定:采用不含菌液的无机盐培养基作为对照参比,在波长600nm处测定菌种吸光值(OD600).代入公式(1)计算菌体质量浓度(DCW)[19].600DCW(mg/L)314.5OD=× (1) 苯酚浓度采用4-氨基替比林法测定苯酚浓度[20],代入公式(2)计算培养基苯酚降解率(%)100%=−×苯酚降解率初始苯酚度微生物浓处浓浓理后苯酚度初始苯酚度(2)1.6菌株的鉴定及系统发育树的构建5期 刘庆辉等：高效苯酚降解菌Bacillus sp. L5-1的分离及其降解特性 24431.6.1 形态学及生理生化鉴定 将菌株接种于固体培养基中观察其菌落形态,采用扫描电镜(SU1510)在10000倍下观察菌株L5-1的表面形态.测定菌株革兰氏染色、好氧性等生理生化指标.1.6.2 16S rDNA 序列分析 将要鉴定的菌株在固体培养基中划线培养至对数期后,用试剂盒(上海生工)提取分离出菌株L5-1的基因组DNA,采用细菌通用引物27F 和反向引物1492R 扩增反应DNA 序列[21].将产物电泳检测后进行测序分析(上海生工).测序结果在BLAST 和MEGA4.1软件中进行基因库比对分析和以邻位相接法构建系统发育树,初步获得菌株的生物学分类地位. 1.7 菌株生长及降解苯酚特性以不同体积比的接种量(6%、8%、10%、12%、14%)、不同培养温度(15, 20, 25, 30, 35, 40, 45℃)、不同pH 值(4, 5, 6, 7, 8, 9, 10)、不同NaCl 浓度(0%、2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%)在体积为100mL,初始苯酚浓度为500mg/L 的无机盐培养基中进行单因素试验,在150r/min 的振荡培养箱中培养, 间隔1h 取一次样,测定培养基中生物量和苯酚降解率,确认其最适宜的苯酚降解条件.菌株在不同初始苯酚浓度下的降解:根据以上试验确定的最佳接种量、温度、pH 值以及NaCl 浓度接种于不同初始苯酚浓度(200~1400mg/L)的无机盐培养基中,在150r/min 的培养箱中间隔2h 取一次样,测定培养基中的生物量和苯酚含量.以上试验均重复3次.1.8 苯酚降解动力学分析在微生物降解苯酚的过程中,降解底物苯酚既作为微生物的唯一碳源,又因为其毒性会对微生物生长产生抑制作用[22].因此本研究采用Haldane 方程来描述初始苯酚浓度对菌株L5-1生长的影响[23], 如公式(3)所示max phenol2phenolphenol =s iC C K C K µµ++(3)式中: µ为微生物比生长速率, h -1;µmax 为最大比生长速率, h -1;C phenol 为苯酚质量浓度, mg/L ;K s 为半饱和常数, mg/L;K i 为抑制常数, mg/L.并用Origin8.0将实验数据与动力学方程拟合. 2 结果与讨论2.1 苯酚降解菌的筛选与鉴定图1 菌株L5-1的扫描电镜图Fig.1 Scanning electron micrograph of strain L5-1×10000图2 菌株L5-1的16S rDNA 序列进化树Fig.2 The 16S rDNA sequence phylogenetic tree of strain L5-12444 中国环境科学 41卷通过多次富集驯化和分离纯化后,本研究得到4株对高浓度苯酚具有较高降解效果且能够良好生长的菌株,其中一株菌株具有良好的苯酚耐受性以及高效的苯酚降解率,将该菌株命名为L5-1,观察其菌落形态和部分生理生化特征,结合16S rDNA鉴定其菌种.经观测,L5-1菌落形态为白色,圆形,不透明,表面粗糙.革兰氏染色呈红色,为革兰氏阳性菌.进行琼脂柱穿刺实验发现其为兼性好氧菌.扫描电镜(10000×)结果如图1所示,可以看出菌体为杆状,表面较为平整,不透明,大小在1.5~2µm左右,且生长状况良好.测定16Sr DNA核酸序列,并将序列在GenBank 数据库中作比对分析,构建了菌株L5-1与其他相近菌株之间的系统发育关系(图2).结果显示菌株L5-1与蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus. MH19)相似性为99.6%,根据同源性分析结果,该菌株归属于Bacillus sp.,鉴定结果为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus).该菌株的基因序列已提交至NCBI基因库,其注册号为MN784421.2.2接种量对菌株L5-1降解苯酚的影响图3 不同接种量对菌株L5-1降解苯酚的影响Fig.3 Effect of different inoculation amount on phenoldegradation by Strain L5-1接种量的多少会对菌株降解苯酚产生直接影响,接种量过少会导致菌株更容易受到苯酚的抑制作用,接种量过高则会增加投入成本,会造成菌株之间对碳源的竞争,影响降解效果.如图3所示,接种量为6%菌液时,培养基中菌株在14h内对500mg/L苯酚的降解率为74.4%,菌株降解苯酚的停滞期随着接种量的增高而明显缩短,培养基中苯酚的浓度也在不断降低,接种量为10%、12%时,在14h内培养基中浓度为500mg/L的苯酚均被完全降解,接种量为14%时,在14h内培养基中苯酚降解率为96.8%.说明适当的提高接种量是提升菌株降解苯酚效果的一种有效途径.可以看出接种量超过10%时菌株对苯酚的降解效果提升不明显,接种量过大时反而影响到菌株的降解效果,且会增加经济成本,综合考虑选择10%作为菌株L5-1的最佳接种量.2.3温度对菌株L5-1生长和降解苯酚的影响温度是影响微生物生长繁殖的重要因素,选择出合适的温度能有效提高微生物酶活性,有助于提升参与苯酚降解的酶促反应速率[23].从图4中可以看出,菌株L5-1的最佳生长和降解苯酚温度为35,℃并在30~35℃之间对500mg/L苯酚在14h的降解率都大于95%(30℃为95.4%,35℃为96.9%),且生长状况良好.该菌株具有典型的嗜中温特点,培养温度在15和45℃时生物量和降解率都达到最低(15℃时降解率19.7%,45℃时降解率24.6%).这可能是因为培养温度过低会使参与酚类降解的微生物酶活性降低,细菌新陈代谢速率变慢,温度过高则容易让微生物酶失去活性[24].OD60图4 温度对菌株L5-1生长及苯酚降解的影响Fig.4 The effect of temperature on the growth of strainL5-1and degradation of phenol初始苯酚浓度500mg/L,14h2.4pH值对菌株L5-1生长和降解苯酚的影响如图5所示,菌株L5-1的最佳生长和降解苯酚pH值为7.0,14h内对500mg/L苯酚降解率为97%,培养基中pH值低于7.0后,随着pH值的下降菌株对苯酚的降解率逐渐下降,当培养基中pH值为4.05期 刘庆辉等：高效苯酚降解菌Bacillus sp. L5-1的分离及其降解特性 2445时,菌株基本不生长.当pH 值超过7.0后,菌株在碱性条件下对苯酚的降解率和生长状况相比酸性条件下有明显提高(pH 值为5.0时31.3%,pH 值为6.0时70.6%,pH 值为8.0时93.4%,pH 值为9.0时61.7%,pH 值为10.0时7.8%).这是因为苯酚在降解过程中会产如己二酸、丙酮酸等有机酸,致使培养基的pH 值逐渐降低,所以中性和偏碱性环境相比酸性环境更有利于菌株降解苯酚[25-26].并且在偏酸和偏碱的条件下,菌株L5-1的生长和苯酚降解效率都明显下降.这可能由于pH 值影响到了微生物的生长和代谢,进而影响到微生物对培养基中营养物质的吸收和苯酚的降解[27].在pH 值为6.0~9.0条件下,菌株L5-1在14h 内对苯酚的降解率都大于60%,表面菌株L5-1对pH 值有良好的耐受范围且该菌株更耐碱性环境.O D600pH 值图5 pH 值对菌株L5-1生长及苯酚降解的影响 Fig.5 Effect of pH on the growth of strain L5-1 anddegradation of phenol初始苯酚浓度500mg/L,14h2.5 NaCl 对菌株L5-1生长和降解苯酚的影响在工业废水的排放过程中,除了高浓度含酚污染物之外,通常还含有大量盐分,过高的盐分会抑制菌株的生长且对微生物有一定的毒害作用[28].如图6所示,菌株最适宜NaCl 浓度为1%.当NaCl 浓度在2%~6%范围内时,菌株L5-1和苯酚降解率在68h 内对500mg/L 苯酚降解率都为97%左右,当培养基中NaCl 浓度超过6%时,菌株的生长和苯酚降解随着NaCl 浓度的升高而明显受到抑制.当培养基中NaCl 浓度增加至10%时,菌株L5-1的生长量和苯酚降解率仍达到0.58和62.7%,表明菌株对盐浓度有很好的耐受性.王丽娟等[29]发现Bacillus ZU -R6在5%的盐度下降解500mg/L 苯酚,72h 时内降解率仅在50%左右,在8%的盐度下降解500mg/L 苯酚,72h 时降解率仅在20%左右.黄中子等[30]发现一株Virgibacillu sp.在5%的盐度下降解500mg/L 苯酚,72h 内的去除率达98%.因此,菌株L5-1与现有的菌株相比具有较宽的盐浓度适应范围和较快的降解速率,在处理含盐苯酚废水中有一定的优势.O D600图6 NaCl 浓度对菌株L5-1生长及苯酚降解的影响 Fig.6 Effect of NaCl concentration on the growth of strainL5-1 and degradation of phenol初始苯酚浓度500mg/L,68h2.6 菌株生长与苯酚的降解菌株L5-1在最佳降解条件下(10%的接种量、温度为35℃、pH 值为7.0、NaCl 浓度为1%)接种至初始苯酚浓度为500mg/L 的无机盐培养基中,其随时间的生长与苯酚降解曲线如图7所示.O D600图7 最佳条件下菌株L5-1的生长及苯酚降解曲线 Fig.7 Growth and phenol degradation curve of strain L5-1under optimal conditions 500mg/L由图7可知,L5-1经历了近4h 的停滞期,在此期2446 中国环境科学 41卷间苯酚浓度下降缓慢,5~9h进入对数生长期,细菌数量增长极其迅速,苯酚含量随着细菌数量的增加而迅速下降,并在接种13h后达到静止期,此时培养基中细菌总数达到最大,其OD600值为0.93.到14h时,对500mg/L苯酚的降解率达到97.1%.2.7初始苯酚浓度对降解率的影响菌株在不同初始苯酚浓度下,苯酚浓度随时间降解效果如图8所示.当初始苯酚浓度为200mg/L时,在6h内苯酚降解率达到89%.46h对1000mg/L苯酚的降解率达到97.71%.随着初始苯酚浓度的提高,菌株的停滞期也相应的增加,菌株降解相同含量的苯酚所需的时间逐渐延长.当初始苯酚浓度为1200mg/L时,66h才将培养基中苯酚浓度降解到32mg/L左右,降解率为97.4%.而当初始苯酚浓度为1400mg/L时,苯酚66h内的降解率仅为29.0%,由此可见,高浓度苯酚对菌株L5-1的生长有强烈的抑制或毒害作用,使得菌株降解苯酚速率变得尤为缓慢.图8 不同初始苯酚浓度对菌株L5-1降解苯酚的影响Fig.8 Degradation of phenol by strain L5-1 at different initialconcentrations of phenol2.8菌株L5-1对苯酚的降解动力学研究将微生物比生长速率和苯酚初始质量浓度通过非线性最小二乘法按照方程拟合(图9),方程动力学参数为:µmax=0.355h-1,K s=104.27mg/L,K i为322.83mg/L,降解苯酚最适浓度为183.78mg/L.实验数据与模型拟合吻合良好,相关系数R2为0.997.结果表明,苯酚是一种抑制底物,初始苯酚浓度低于183.78mg/L时,菌株L5-1的比生长速率与初始苯酚浓度成正比关系,这是因为培养基中降解菌缺乏足够的碳源供其生长,此时培养基中底物的浓度对菌株的生长速率起主导作用.初始苯酚浓度高于183.78mg/L时,菌株L5-1的比生长速率成负相关,此时初始苯酚浓度的升高使其对菌株抑制作用逐渐增强.表1中为目前已报道的几种微生物苯酚降解动力学参数,其中µmax表示最大比生长速率,K s饱和常数大小表示菌株对苯酚的亲和性,K s越小表示菌株对苯酚的亲和性越大,菌株的比生长速率也就更快, K i抑制常数则表示苯酚对菌株的抑制强度和毒害大小,K i值越大,苯酚对菌株的抑制和毒害作用也就越小,菌株耐受苯酚程度就越大[22].由表可以看出,菌株L5-1比较于其它苯酚降解菌的最大比生长速率和饱和常数相差不大,属于一般水平,其抑制常数大于Ochrobactrum sp.CH10[13]、波茨坦短芽孢杆菌[22]和Trichosporo n.sp[31]等其它苯酚降解菌,说明菌株L5-1具有良好的苯酚耐受能力.表1不同微生物的苯酚降解动力学Haldhance方程参数Table 1 Haldhance equation parameters of phenol degradation kinetics of different microorganisms菌种µmax(h-1) K s(mg/L) K i(mg/L)R2 Bacillus sp.L5-1(本文) 0.355 104.27 322.83 0.997 Ochrobactrum sp. CH10[13]0.441 77.77 110.6 0.973 Brevibacillus borstelensis[22]0.334 14.07 196.89 0.992 Halomonas sp. H17[23] 0.31 191.63 683.050.997Trichosporon.sp[31] 0.667 51.14 271.70.997Alcaligenes faecalis[32] 0.150 22.20 245.40 0.987图9 菌株L5-1苯酚降解动力学Fig.9 Kinetics of degradation of phenol by strain L5-13结论3.1从污水处理厂活性污泥中分离出一株苯酚降5期刘庆辉等：高效苯酚降解菌Bacillus sp. L5-1的分离及其降解特性 2447解菌.鉴定分析为芽孢杆菌属(Bacillus sp.),命名为L5-1.该菌株对苯酚具有高效的降解能力.其中最佳降解条件是接种量为10%,生长温度为35,pH℃值7.0,NaCl浓度为1%.3.2菌株降解不同初始浓度苯酚动力学与Haldance模型吻合良好,经拟合其生长参数为µmax= 0.355h-1,K s=104.27mg/L,K i=322.83mg/L.相关性系数(R2)为0.997.3.3该菌株相比于其他Bacillus cereus降酚菌株具有较宽的环境适应范围和更高的降解效率,14h对500mg/L苯酚的降解率达到97.71%,46h对1000mg/L苯酚的降解率达到97.7%.因此,该菌株在含酚废水的生物降解领域有极大的应用潜力.参考文献：[1] Mao Z, Yu C, Xin L. Enhancement of phenol biodegradation byPseudochrobactrum sp. through ultraviolet-induced mutation [J].International Journal of Molecular Sciences. 2015,16(12):7320-7333. [2] Massalha N, Shaviv A, Sabbah I. 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高效纤维素降解菌的筛选[1]
![高效纤维素降解菌的筛选[1]](https://img.taocdn.com/s3/m/07e44f56312b3169a451a439.png)
mL - 1 mL - 1
X21 14
9
X22 16
11
X23 10
7பைடு நூலகம்
Z21 18
22
Z22 73
35
Z23 54
29
Z24 22
18
Z25 55
24
透明圈 直径
1. 1 1. 3 1. 0 1. 5 3. 4 2. 0 1. 5 1. 2
CM C 酶 FPA 透明圈 菌种 U · U · 直径
mL - 1 mL - 1
21. 5 21. 5 21. 5 21. 5 21. 5 21. 5 21. 5
0. 000 0. 264 0. 427 0. 592 0. 754 0. 811 1. 112
DN S 法测糖。在上述条件下, 定义每分钟催化纤维素
水解生成 1 Λg 葡萄糖的酶量为一个酶活力单位U 。
滤纸酶活 (FPA ) 的测定 将新华 1 号滤纸 (1
2. 2. 1 GL C 标准曲线 用 DN S 法, 在波长为 520 nm 条件下, 测定一
系列已知样品, 制备标准 GL C 曲线, 制备过程见表 1, 绘制结果见图 2。
表 1 葡萄糖标准曲线测定结果
含糖总量 m g 葡萄糖液 mL 蒸馏水 mL DN S 试剂 mL 加热 冷却 蒸馏水 mL 光密度 O. D.
Keywords: Screen ing Cellu lo se2decom po sing M icroo rgan ism s
植物纤维素约占植物体干重的 33. 4%～ 50% , 是地球上最丰富的有机物质。但是, 由于纤维素中存 在许多高能的氢键, 因此其水解、利用均很困难。 世 界上平均每年约生成 1500～ 2000 亿 t 植物性有机 物, 其中约有一半为纤维素类物质, 仅能利用一小部 分。绝大部分都被弃置[1], 因此如何更有效地开发和 利用纤维素资源已成为当今世界的热门课题之一。 能够降解纤维素的微生物有很多, 可是目前的研究 却大多集中在有限的几个菌株上, 如康宁木霉、里氏 木霉等。然而这些菌株仍然存在着产酶成本高, 酶活 性不稳定, 作用 pH 范围狭窄等问题。 因此寻找更 多、更高效、作用范围更广泛的新菌种是十分必要 的。作者研究比较了几种纤维素降解菌筛选方法, 并 从自然界筛得高效纤维降解细菌 1 株, 真菌 3 株。该 细菌可在 4 d 内将滤纸平板完全降解为粘质, 初步 鉴定为嗜纤维菌属。 此外, 3 株真菌均为木霉菌, 降 解活性也很高, 其中一株在发酵培养第 6 d, 滤纸酶 活 (FPA ) 即可达到 51 U mL。
苯酚降解菌的筛选、鉴定及其降解特性的研究
上海师范大学硕士学位论文苯酚降解菌的筛选、鉴定及其降解特性的研究姓名：何小丽申请学位级别：硕士专业：微生物学指导教师：肖明20090501上海师范大学硕士学位论文摘要论文题目：苯酚降解菌的筛选、鉴定及其降解特性的研究学校专业：微生物学学位申请人：何小丽指导教师：肖明摘要酚类化合物为细胞原浆毒物，属高毒性物质。
这类物质来源广泛，通常污染水源，毒死鱼虾，危害农作物，并严重威胁人类的健康。
含酚有机物的毒性还在于其只能被少数的微生物分解。
从自然界中筛选分离出能够降解特定污染物的高效菌种，有针对性的投加到已有的污水处理系统中的生物强化技术，能够快速提供大量具有特殊作用的微生物，在有毒有害污染物治理中显示出巨大的潜力。
1、本研究从胜利油田河口采油厂的飞雁滩油田土壤样品中分离得到10株能够利用并降解苯酚的菌株P1-P4、P7、P9-P13。
该10株苯酚降解菌能够在以苯酚为唯一碳源和能源的培养基上生长，经16S rDNA分子鉴定和生理生化检测，该10株降酚菌分别被鉴定到属或种。
其中降酚菌株P1、P3和P4这3株菌株分别属于劳尔氏菌属(Ralstonia)、贪噬菌属（Variovorax）和节杆菌属（Arthrobacter）里的种。
其它7株降酚菌株P2、P7、P9-P13都属于假单胞菌属（Pseudomonas）里的种。
这4个属里的细菌在国内外都已被报道有降解苯酚的特性，其中有关假单胞菌降解环境有机物的报道较多。
2、培养液中的苯酚含量通过4-氨基安替比啉分光光度法测定，通过苯酚降解效率的比较，菌株P2降解苯酚的能力较其它9株菌株要强。
于是将菌株P2作为本研究中进一步研究的对象，研究了不同的环境条件下该菌株降解苯酚和菌体生长的情况。
3、通过苯酚羟化酶特异性引物的设计，从菌株P2扩增出苯酚羟化酶大亚基基因，该基因片段编码对苯酚有催化活性的多肽，催化苯酚代谢的第一步反应；表明菌株P2能降解苯酚是由于细胞具有降解苯酚的遗传基础。
生物法对偶氮染料废水脱色的研究
生物法对偶氮染料废水脱色的研究从某印染废水的活性污泥中富集了一个能够高效降解酸性大红GR的菌群。
研究结果表明，该菌群在15h内几乎将100mg/L的酸性大红完全脱色。
该菌群在偏碱性环境下的脱色效果大于酸性环境，并表现出高效广谱染料脱色降解特性。
当温度在10°C～30°C之间时，脱色率随温度的递增而增大，在30°C时脱色率达到最大。
标签：酸性大红GR；脱色；菌群；偶氮染料Abstract：A bacteria group capable of degrading acid scarlet GR was enriched from the activated sludge of a printing and dyeing wastewater. The results showed that the bacteria almost completely decolorized acid scarlet at 100 mg/L within 15h. The decolorizing effect of the bacteria group in the alkaline environment was higher than that in the acidic environment，and showed the characteristics of decolorization and degradation of the dyes with high efficiency and broad spectrum. When the temperature is between 10 °C and 30 °C，the decolorization rate increases with the increase of temperature，and reaches the maximum at 30°C.Keywords：acid scarlet GR；decolorization；microflora；azo dyes1 概述1.1 课题背景染料和印染工业快速发展，这种发展导致了生产废水越趋增多，大约占了总的工业废水的十分之一。
高效苯酚降解菌的筛选及其特性的研究
鉴定该菌为球 菌， 兰氏染色阴性 。 实验结果表 明 ： 革 降解苯 酚的最佳条件为 ： 温度 ３ 、 Ｈ值 ７ ８ 葡 萄糖 浓度 １５０ｍｇ 、 ０ｏ ｐ Ｃ ～， ０ ／ 接 Ｌ
种 量 ｌ％、 液 量 ５ Ｌ Ｏ 装 ０ｍ 。 关键词 ： 酚 ； 化 ； 苯 驯 筛选 ； 响 因素 影
文章 编 号 ：６ ４ １２ （０ ０ ０ — ０ ５ ０ １ ７— ０ １ ２ １ ）９ ０４ — ３
长所 需 的各种 营 养物 质 。实 际工 业含 酚废 水 中可 能 苯 酚是 一种 重要 的有 机化 工 原料 ，是 丙烯 的重
要 衍 生物 之 一 ， 要用 于 生 产 酚醛 树 脂 、 主 己内酰 胺 、 双 酚 Ａ、 己二 酸苯胺 以及 水杨 酸 等 …， 成 为这 些 工 并
ｄｏ ｅ１ ％ ，ｉ ｉ ｏ ｕ ｅ５ ｍ Ｌ ｓ ０ ｌｑｕ ｄｖ ｌ ｍ ０ Ｋｅ ｙ ｗｏｒ ｄｓ： ｈｅ ｏ ； ｃ ｌｍａｔ ａｉ ｎ ｓ ｒ ｅ ｎｇ ｆ ｃｏ ｓ ｐ ｎ ｌａ ｃ ｉ ｉ ｔｏ ； ｃ ｅ ｎｉ ； ａ ｔｒ ｚ
中 图分 类 号 Ａ
Ｋ２ ＨＰＯ４０． Ｌ， Ｓ ５ Ｍｇ Ｏ４‘ ７Ｈ２ ０． ／ Ｃａ ２０． ／ ０ ２ ｇ Ｌ， Ｃ１ １ ｇ Ｌ，
业废 水 中 的主要 污染 物 。 中国等 许多 国家 已将 其列
入重点污染物的名单之中［。 ２ 近年来 ， １ 国内外许多学 者在生物降解苯酚方面进行了广泛的研究 ，已筛选 出多种 降 酚微 生物 菌株 ， 如假 单 胞 菌 （ｓｕｏ ｏａ— Ｐｅｄｍ ｎｓ ｓ． 、 ｐ ） 真养 产碱菌 （ ａｉｅｅ ｕｒ ｈ ｓ …、 Ａｌ ｌ ｎ ｓ ｔ ｐ ｕ ） 醋酸 钙 ｃ ｇ ｅ ｏ
高效苯 酚降解菌 的筛选及其特性 的研究
211171517_降解偶氮染料嗜盐菌的分离、降解特性及机制
化工进展Chemical Industry and Engineering Progress2023 年第 42 卷第 4 期降解偶氮染料嗜盐菌的分离、降解特性及机制田芳1，郭光1，丁克强1，杨凤1，刘翀2，王慧雅1（1 南京工程学院环境工程学院, 江苏 南京 211167；2 中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所，北京 100081）摘要：高盐限制了普通微生物处理印染废水的效果，分离嗜盐微生物对于提高高盐印染废水的处理效率，具有重要的应用价值。
本研究从印染废水的活性污泥中，分离了一株降解酸性金黄G 的菌株，通过16S rDNA 对该菌进行鉴定，并研究了其降解机理。
结果表明，该菌与Exiguobaterium strain ACCC11618同源性最高，属于微小杆菌属。
该菌在5%盐度下，8h 内对100mg/L 的酸性金黄G 脱色95%以上。
最佳脱色条件是30℃下，pH=7，5%盐度，以酵母粉作为碳源。
偶氮还原酶、NADH-DCIP 酶是主要的降解酶，盐度抑制了这两种酶的活性。
酸性金黄G 的偶氮键对称断裂成4-氨基苯磺酸和对氨基二苯胺，进一步降解为二苯胺、苯胺、2-庚酮肟等，降解后产物毒性降低。
菌株对不同浓度的酸性金黄G 具有耐受性，具有良好的应用潜力。
该研究以期为嗜盐菌处理高盐印染废水提供菌种资源和理论依据。
关键词：偶氮染料；分离；脱色；酸性金黄G ；嗜盐菌中图分类号：X170 文献标志码：A 文章编号：1000-6613（2023）04-2115-07Isolation of halophilic bacterium and their decolorization characteristicsand mechanism of azo dyesTIAN Fang 1，GUO Guang 1，DING Keqiang 1，YANG Feng 1，LIU Chong 2，WANG Huiya 1(1 College of Environmental Engineering, Nanjing Institute of Technology, Nanjing 211167, Jiangsu, China; 2 Institute ofEnvironment and Sustainable Development in Agriculture, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China)Abstract: High salinity in textile wastewater limited the application of biological method in textile wastewater. Isolation of halophilic microorganisms is important for improving the treatment efficiency of high salinity textile wastewater. A strain was isolated from active sludge of textile wastewater, which can decolorize metanil yellow. The bacteria were identified by 16S rDNA. The degradation mechanism was analyzed. The results showed the bacteria had the highest homology with Exiguobaterium strain ACCC11618 and belong to the genus. At 5% salinity, more than 95% metanil yellow was decolorized by S2 within 8h. The optimum decolorization condition was 5% salinity, pH 7, at 30℃, and yeast powder as carbon source. Azo reductase and NADH-DCIP are the main degrading enzymes. Salinity inhibits the activity of these two enzymes. The azo bond of metanil yellow was symmetrically broken into 4-aminobenzene sulfonic acid and p -aminobenzidine, which further degraded into diphenylamine, aniline, and 2-heptanone oxime. The toxicity was decreased after decolorization. The strain could decolorize metanil yellow at different研究开发DOI ：10.16085/j.issn.1000-6613.2022-1092收稿日期：2022-06-10；修改稿日期：2022-09-26。
染料废水菌种降解处理技术
染料废水菌种降解处理技术1 引言真菌是微生物群里对合成染料降解最高效的微生物.相对于细菌，真菌降解范围的广谱性及降解产物的无毒性使其逐渐引起人们的关注，但真菌本身对外界环境适应的局限性也影响了其更广泛的应用.固定化是真菌投入到实际应用的一种技术手段，可以使真菌细胞和液体培养基分离，使其免受水力剪切的破坏，并且固定化培养比游离培养能更好地抵抗外界环境的影响，如pH变化的影响或者暴露在高浓度化学品中对其造成的毒性影响.固定化技术中，海藻酸由于无毒性且形成的凝胶对微生物的刺激性较小，成为相对比较合适的基质材料.研究人员进行了大量关于海藻酸钙包埋白腐真菌、藻类细胞的研究，但由于固定化真菌处理染料时首先是污染物在载体表面积累，然后被其内部的菌丝降解，这一过程时间较长.为缩短固定化真菌对污染物的吸附时间，提高处理效率，本研究设计在固定化载体内部加入吸附材料.本研究选择壳聚糖铁凝胶作为改善固定化菌球性能的材料.壳聚糖铁凝胶是一种合成的新型多聚物复合吸附材料，由于其多聚物特性使其具有较低的密度，能够在海藻酸钠溶液中处于悬浮状态，并且在高速振荡下能够均匀分布在海藻酸钠溶液中，适宜用于本研究.过去固定化菌种的选择中多以黄孢原毛平革菌为主，其在降解染料时，主要依靠分泌木质素降解酶对染料进行降解，但使用的菌种多是从国外引进，并且木质素产酶量制约了其在环境领域的大规模应用.本研究选择新疆本土采集的菌种作为固定化的菌种，经ITS测序鉴定为疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)，属于半知菌纲(deuteromycetes)，壳霉目，杯霉科，为目前已知的高产漆酶菌.漆酶是单电子氧化还原酶，通过生成底物自由基中间体及4个铜离子的协同作用催化不同类型底物氧化反应，可以有效地降解难降解染料.本研究首次尝试将疣孢漆斑菌固定化到海藻酸钙中，并将壳聚糖铁凝胶和疣孢漆斑菌结合起来，综合分析其对染料的处理能力及处理机制，同时对结合后漆酶的活性进行检测.2 材料和方法2.1 实验材料实验选用的壳聚糖(脱乙酰度 91.04%)购自浙江金壳生化公司，氯化铁、乙醇(分析纯)、海藻酸钠购自国药集团化学试剂有限公司，分析用试剂ABTs购自Aladdin公司，实验用染料为商用产品.实验中用水为去离子水.真菌菌种I-5由浙江大学农业与生物技术学院王洪凯老师提供，由其从新疆的腐殖地皮上分离采集，4 ℃下保存在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，每3个月再次培养.2.2 壳聚糖铁凝胶的制备将壳聚糖粉末溶解在0.1 mol · L-1氯化铁溶液中，搅拌4 h后加入乙醇，壳聚糖铁固体析出，固体用乙醇冲洗以清洗多余FeCl3，并在80 ℃下干燥，干燥后的固体放在5%的戊二醛乙醇溶液中交联2 h，用乙醇和去离子水梯度冲洗，然后置于烘箱中80 ℃烘干，即制备成壳聚糖铁凝胶2.3 真菌活化发酵I-5真菌在28 ℃条件下在PDA培养基上活化培养7 d，待菌丝布满培养基后，用1 cm2打孔器在培养基上打孔，接种到PDB(Potato dextrose broth)中，置于恒温振荡培养箱中于28 ℃、150 r · min-1条件下振荡培养.2.4 真菌种类鉴别为了鉴别I-5真菌的种类，需提取培养在PDA 上菌丝的DNA，并进行PCR扩增、测序.PCR扩增时采用的引物为通用引物ITS1、ITS4，上游引物ITS1-F: 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，下游引物ITS4-R: 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，PCR反应体系见表 1，反应条件为：95 ℃预变性5 min;94 ℃变性30~40 s，55 ℃退火30~40 s，72 ℃延伸1 min，35个循环;72 ℃延伸5 min.PCR扩增后在琼脂糖凝胶中进行电泳，将电泳后的凝胶置于Tanon 2500 成像系统中成像.电泳结束后的琼脂糖凝胶回收纯化后送到上海生物工程有限公司进行测序，将测序后的序列与电泳分析图进行比较确定测定结果是否准确，并在NCBI(National Center for Biotechnology information)上进行核苷酸的比对以确定该菌种的种类.表1 PCR反应体系2.5 固定化固定化即将培养的I-5菌种包埋到海藻酸钠球中.将25 mL接种培养2 d的I-5菌培养基混合溶液同0.02 g · L-1的海藻酸钠溶液(50 mL)混合后分成两份，一份加入0.7 g壳聚糖铁凝胶并用涡旋振荡器混合均匀，另一份不加作为对照.混合溶液通过用1 mL注射器逐滴滴加至0.2 mol · L-1氯化钙溶液中，并低速搅拌以防止粘结.为了最小化菌丝的离散，本研究采用再包埋的方法(Daâssi et al., 2013)，将之前固定化好的小球用去离子水冲洗过后置于0.5 g · L-1 的海藻酸钠溶液中，使球中的Ca2+和海藻酸钠结合在球的表面再次形成一层海藻酸钙层，最后用0.07 g · L-1的氯化钠溶液冲洗(Enayatzamir et al., 2010).2.6 脱色实验2.6.1 确定球/培养基最优比例固定化的真菌小球按照0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 g · L-1的比例加入到等量相同的液体培养基中，培养1 d后，加入适量酸性红73(AR73)，配成50 mg · L-1的含染料培养基，24 h后测定染料的脱色率，确定球/培养基最优比例，反应温度为28 ℃.2.6.2 对照试验最优球/培养基比例下，在50 mL、50 mg · L-1 AR73染料培养基中，比较固定化壳聚糖铁菌球、固定化菌球、灭活的固定化壳聚糖铁菌球(采用2.5%的次氯酸钠灭活)24 h染料的脱色率.2.6.3 染料初始浓度的影响在染料浓度为50、100、150、200、250 mg · L-1的条件下测定不同时间下固定化壳聚糖铁菌球对染料的脱色率变化.2.6.4 振荡影响研究比较静态和150 r · min-1振荡条件下固定化壳聚糖铁菌球、固定化菌球不同时间段的染料脱色率.2.6.5 对不同酸性染料的脱色测定固定化壳聚糖铁菌球对酸性蓝113(AB113)、酸性蓝193(AB193)、酸性红GR(AR9)、酸性黑10B(AB1)等不同染料24 h的脱色率.2.7 漆酶活性测定漆酶活性测定采用分光光度法，λ=436 nm(ε436=29300 L · mol-1 · cm-1)，用ABTS作为底物，300 μL、10 mmol · L-1 ABTs溶液和2670 μL醋酸钠缓冲溶液(0.2 mol · L-1，pH=4.5)混合，30 ℃水浴下恒温10 min，加入样品30 μL，利用紫外分光光度计的Time course 程序测定单位时间内的数值变化，醋酸钠缓冲溶液作空白.2.8 固定化菌球表征通过电子扫描显微镜研究菌球表面和横截面的形态学，菌球的扫描电镜图(SEMs)利用SU8010在3.0 kV下检测.由于样品含真菌，在检测前对样品要进行前处理.3 结果与讨论3.1 固定化菌球表征实验中制备的壳聚糖铁固定化菌球表面(图 1a、1b)和横截面(图 1c、1d)的扫描电镜照片如图 1所示.由1a可以看出，菌球的表面布满了菌丝;图 1b为固定化菌球表面1000倍的放大图，可以更加细致地观察到I-5菌丝的形态为长杆型，且在部分区域可以看到分生孢子.图1 壳聚糖铁固定化菌球表面(a，b)及横截面(c，d)扫描电镜图图 1c显示出明显分层现象，球表面由厚厚的菌丝包裹，内部则是海藻酸钙.从内部放大图(图 1d)可以看到，在球体的内部也生长有菌丝，其被海藻酸钙紧紧包埋.由SEMs可以看出，疣孢漆斑菌在被海藻酸钙固定化后长势良好，具有较高的生长密度，便于在脱色实验中更好地发挥作用.3.2 真菌种类鉴别图 2的电泳分析图显示，I-5的条带在500~750 bp之间，550 bp左右，而测出来的核苷酸序列长度也在这一范围内，所测出来的核苷酸序列与电泳分析相符.将I-5的核苷酸序列放到NCBI上进行比对，比对出这种真菌和NCBI上ID为gb|KC140223.1|的序列相似度为99%，比对结果确定I-5真菌为疣孢漆斑菌.图2 I-5在EB着色的1.5%琼脂糖凝胶DNA量电泳图(M是Trans2K Plus DNA 标记物) 测得I-5核苷酸序列如下：>I-5AAACTCCCAACCCTTTGTGACCTTACCATATTGTTGCTTCGGCGGGACCGCCCCGGCGCCTTCGGGCCCGGAACC AGGCGCCCGCCGGAGGCCCCAAACTCTTATGTCTTTAGTGGTTTTCTCCTCTGAGTGACACATAAACAAATAAAT AAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAA TTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTC GAGCGTCATTTCAACCCTCAGGCCCCCAGTGCCTGGTGTTGGGGATCGGCCCAGCCTTCTCGCAAGGCCGCCGGC CCCGAAATCTAGTGGCGGTCTCGCTGTAGTCCTCCTCTGCGTAGTAGCACAACCTCGCAGTTGGAACGCGGCGGT GGCCATGCCGTTAAACACCCCACTTCTGAAAGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATA TCAATAAGCGGAAGAAAT3.3 球/培养基最优比例确定由表 2可以看出，接种量在0.15~0.25 g · L -1时，球对染料的24 h 去除率能达到90%以上，且在20%时去除率达到最大.这同对固定化白腐真菌对染料的脱色研究结果相似，球的接种量比例都在20%左右，且由于本研究中壳聚糖铁凝胶的加入，极大地改善了对染料的处理效果，研究的24 h 的脱色率最高达50%左右.表2 接种量(球/培养基)对染料去除的影响3.4 对照实验为了判定固定化壳聚糖铁菌球脱色染料时壳聚糖铁和I-5菌丝各自对脱色所起作用的大小，设计了对照试验.由于壳聚糖铁凝胶在高温高压下吸附性能受到影响，因此，采用0.025 g · L -1的NaClO 对固定化壳聚糖铁菌球进行灭活，既不影响壳聚糖铁的性能，同时便于操作.由图 3可以看出，与壳聚糖铁固定化菌球相比，灭活后的菌球的脱色能力明显衰退.灭活的壳聚糖铁固定化菌球在24 h 时对染料的去除效果达到平衡，表明在这段时间壳聚糖铁凝胶对染料的吸附起主要作用;并且通过比较壳聚糖铁固定化菌球和灭活壳聚糖铁菌球两条曲线的差异可以得出，疣孢漆斑菌在染料脱色中起着积极的作用，真菌处理染料的机制最主要的是生物吸附和生物降解.通过比较固定化菌球和灭活菌球的曲线差异，可以判别菌种降解所起到作用的大小.固定化菌球对染料的脱色曲线呈现稳步上升趋势，说明随着时间延长，代谢产物酶的积累，菌丝的降解作用逐步增强，菌丝对染料的降解过程是一个缓慢的过程.同时，灭活的菌球对染料也有部分去除能力，证明海藻酸钙对染料也有吸附作用，关于海藻酸钙球对污染物(如染料)有去除作用也有相关的研究报道.图3 灭活前后菌球对染料的脱色率(150 r · min-1，pH=6.5，28 ℃)3.5 染料浓度的影响研究实验研究了固定化壳聚糖铁菌球对不同最初浓度染料的脱色率差别，结果如图 4所示，不同于之前普通的固定化菌球随着染料浓度升高，脱色效果呈现差异较大的递减趋势的性质，改良后的壳聚糖铁固定化菌球对初始浓度为50~150 mg · L-1的染料去除率能达到90%以上，而在染料初始浓度大于200 mg · L-1时，其去除率也高于70%，远高于之前固定化菌球对染料脱色研究的效果.壳聚糖铁固定化菌球在48 h内对染料的去除效果能达到平衡，较之以往对真菌脱色染料的研究，改良后的菌球缩短了处理的时间，为真菌投入到处理废水实际应用增加了可能.图4 最初染料浓度对脱色率的影响(150 r · min-1，pH=6.5，28 ℃)3.6 振荡影响研究壳聚糖铁固定化真菌和固定化真菌在静态和振荡条件下对染料的脱色能力比较如图 5所示，在静态条件下，疣孢漆斑菌的固定化菌球对染料的去除能力低于振荡条件下菌球的去除能力.振荡条件可以满足微生物对氧气的需求，增加溶液中的溶解氧含量，增强气-液之间的传质作用，加强菌丝的代谢，这可能影响菌丝的形态并且影响酶的合成率，对于染料的降解起到了积极的作用.另外，随着固定化菌球培养时间的延长，染料的去除效果有了明显的改善，固定化菌球和培养基中的染料接触的过程时间较长，培养基中的染料首先被吸附到海藻酸钙上，逐渐积累然后被降解.壳聚糖铁凝胶的加入，大大缩短了染料吸附积累到球表面的时间，便于菌丝进行降解，从而提高了染料的去除效率.图5 振荡(150 r · min-1)和静态条件下对染料的去除比较3.7 对不同染料的脱色研究由于分子间的复杂结构随着有机链和相应官能团的不同而发生变化，直接影响某些吸附材料的吸附性能.同时，研究发现，真菌对不同染料的降解能力也不尽相同.所以，为了判断真菌和吸附材料结合以后对染料的去除效果，实验研究了在相同条件下，壳聚糖固定化菌球对其他酸性染料(浓度为50 mg · L-1)的脱色效果.如图 6所示，24 h后，壳聚糖铁固定化菌球对这几种酸性染料的去除率均能达到90%以上，表明该材料对酸性染料的去除具有广谱性.真菌和吸附材料的结合，既可以通过吸附材料的吸附降低染料对真菌产生的毒性影响，也可以通过真菌的降解作用扩大吸附材料的吸附阈值，两者相互协同作用.图6 壳聚糖铁固定化菌球对不同染料的脱色率3.8 漆酶酶活测定漆酶为疣孢漆斑菌在生长过程中所产生的次级代谢产物，具有高氧化能力.漆酶被应用在很多方面，最重要的就是脱色难降解的染料(Mishra et al., 2011)，这是因为漆酶含有4个铜原子提供了不同键位使其在催化机制中起到重要作用.漆酶的存在可以通过测定漆酶的活性来判断，为了确定改良后的固定化菌球在处理染料时仍能产生漆酶，对投加菌球的染料取样测定酶活性.结果表明，24 h时酶活性为(48.63±4.26)U · mL-1，48 h时为(81.40±3.18)U · mL-1.实验数据表明，壳聚糖铁固定化菌球投加到染料中后，菌丝具有较高活性.球中疣孢漆斑菌菌丝迅速增殖并覆盖到菌球表面后，次级代谢产物逐渐积累，使测定的漆酶活性值呈现上升趋势，有利于染料的降解。
活性翠兰KN—G脱色细菌的选育与研究
北 京建 筑工程 学 院学报
第 ｌ ８卷 第 ３期 ２０ ０ ２年 ９月
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用于 国 内 。 在 生 产 和 使 用 过 程 中 大 约 有 ｌ ０～ ２ ％ 的染 料 会 直 接 随 废 水 排 人 环 境 中 ’ ０ 。染 料 结 构 复 杂 ， 多 数 染 料 属 于难 降 解 物 质 ， 环 境 中难 以 大 在 自然 降 解 ， 别 是 新 的 人 工 合 成 染 料 不 断 出现 ， 特 自 然界 中没 有 相 应 的 微 生 物 可 以 降 解 这 些 物 质 ， 有 使 关染 料 降 解 的 问 题 变 得 复 杂 而 迫 切 。 近些 年 来 ， 大 多数 发 达 国 家 对 含 染 料 废 水 的 排 放 要 求 越 来 越 严
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文 章 编 号 ：０ ４—６ １ （０ ２ ０ １０ ０ １ ２ ０ ） ３—０ ０ ０ １—０ ７
活 性 翠 兰 ＫＮ —Ｇ 脱 色 细 菌 的 选 育 与 研 究 。
文湘华 徐 文 东 付 莉 燕 付 新 苗
（ ＫＬ Ｐ 清 华 大 学 环 境 科 学 与 工 程 系 ， 京 １０ ８ ） Ｓ ＥＳ Ｃ， 北 ０ ０ ４
三种农用抗生素降解真菌的筛选及其降解性能
三种农用抗生素降解真菌的筛选及其降解性能王强锋1，2，朱彭玲2，夏中梅1，2，王赟2，曾芸2，侯勇1，2*（1.四川省农业科学院生物技术核技术研究所，成都610066；2.四川省兰月科技有限公司，成都610207）收稿日期：2018-03-19录用日期：2018-06-15基金项目：四川省财政创新能力提升工程青年基金项目（2015QNJJ-002）；四川省财政创新能力提升工程优秀论文基金项目（2016LWJJ-001）；四川省科技支撑计划项目（2017SZ0188）作者简介：王强锋（1988—），男，四川平昌人，助理研究员，从事土壤与环境微生物研究。
E-mail ：wqf198808@朱彭玲与王强锋同等贡献*通信作者：侯勇E-mail ：yonghou@摘要：为了从重金属污染的土壤中分离筛选出能降解土霉素、诺氟沙星、磺胺二甲嘧啶的真菌菌株，利用抗生素作为唯一碳源进行抗生素降解真菌富集驯化培养，分离纯化耐受真菌，将纯化后的菌株回接到以抗生素作为唯一碳源的液体培养基中，运用高效液相色谱法（HPLC ）及紫外分光光度法对各菌株抗生素降解能力进行检测，并通过菌落形态学特征、ITS 序列和系统发育树对菌株进行分子鉴定。
筛选到4株抗生素降解真菌KS248、KS256、KS257、KS272，分别鉴定为轮状镰刀菌（Fusarium verticillioides ）、腐皮镰刀菌（Fusarium solani ）、聚多曲霉（Aspergillus sydowii ）、微紫青霉（Penicillium janthinellum ）。
其中，菌株KS248、KS256、KS257具有土霉素、诺氟沙星、磺胺二甲嘧啶降解能力；菌株KS272具有土霉素、诺氟沙星降解能力。
在抗生素初始浓度1500μg·L -1、30℃、150r·min -1条件下避光培养7d 后，菌株KS272降解土霉素、诺氟沙星能力最强，降解率分别达到40.29%、10.59%，菌株KS256降解磺胺二甲嘧啶能力最强，降解率达到18.53%。
真菌和细菌对染料的吸附脱色及再生能力的研究
文章编号:025322468(2002)20620779205 中图分类号:X 788 文献标识码:A真菌和细菌对染料的吸附脱色及再生能力的研究李蒙英,倪建国,洪法水,谢立群,孟祥勋 (苏州大学生命科学院生物科学系,苏州 215006)摘要:进行了真菌和细菌共培养对染料的吸附脱色和吸附脱色能力再生的研究.结果表明,青霉菌G 21首先对偶氮染料S 2119、蒽醌染料艳紫K N 2B (C.I.Reactive violet 22)水溶液中染料进行快速吸附去除,菌丝对同种染料的吸附速度随菌丝培养液中葡萄糖浓度的增加而加快,吸附染料的G 21菌丝在与细菌的共培养中完成对染料的脱色降解,脱色速度受培养液中葡萄糖和氮源浓度影响较大,从吸附速率和完全脱色时间综合评价,以葡萄糖浓度为5g ΠL 、酒石酸铵为20mm ol ΠL 的培养基中培养的菌丝对染料的吸附脱色效果最好,吸附在菌丝上的艳紫K N 2B 脱色后菌丝吸附脱色能力得到再生,菌丝对100mg ΠL 的艳紫K N 2B 染料水溶液可重复处理4次.青霉菌G 21对酸性染料废水处理3h ,色度去除率为75.9%,吸附染料的菌丝在与细菌共培养中完成对染料的脱色,对试验所用染料废水,菌丝的处理能力获得1次再生.关键词:染料;生物吸附脱色;再生菌丝;真菌和细菌Adsorption and decolorization of dyes by fungus and bacterium ,and re 2generation of the adsorption and decolorization capacityLI M engying ,NI Jianguo ,H ONG Fashui ,XIE Liqun ,ME NG X iangxun (Department of Biology Science ,C ollege ofLife Science ,Suzhou University ,Suzhou 215006)Abstract :Adsorption and decolorization of dyes by fungus and bacterium ,and regeneration of the adsorption and decolorization capacity ware investigated in.The results showed that the fungus ,P enicillium sp.G 21adsorbed and elim inated azo dye P olyS 2119T M and anthraquinone dye C.I.Reactive violet 22form solutions ,and the adsorption rate increased with the increase of glucose concentration in the liquid medium of mycelium.Decoloriaztion and degradation of the adsorbed dyes ware im plemented through co 2culturing dyes adsorpted mycelium with bacteri 2um ,and decolorization rate was in fluenced at certain extent by the concentration of glucose and nitrogen in medium.The liquid medium with 5g ΠL glucose and 20mm ol ΠL amm onium tartrate showed the best effect in mycelium adsorption and decolorzation to the dyes.The mycelium could be repeatedly used for four times to treat the dye solution with 100mg ΠL C.I.Reactive violet N 2R dye wastewater.75.9%of decolori 2zation and elim ination of dyeing 2waste water was obtained by treatment with P enicillium sp G 21for 3h.The dye 2adsorbed mycelium could be com pletely decolorized by coculturing with bacterium ,and could be regenerated to treat dye 2wastewater one m ore time.K eyw ords :dyes ;biosorption and decolorization ;regeneracy mycelium;fungus and bacterium收稿日期:2001211226;修订日期:2002201226基金项目:苏州市科委资助课题SSZ 0141作者简介:李蒙英(1963—),女,讲师由于真菌对染料的脱色降解具有广谱性,在处理成分复杂,染料变化频繁的染料废水中具有很好的应用前景,因而倍受世界各国的关注.一些研究表明Phanerochaete chrysosporium 、Trametes ver sicolor 、Penicillium sp.等真菌在吸附、脱色染料的广谱性、矿化率、脱色速度等方面都表现出一定的优越性[1—3].但真菌一般不能以染料作为唯一的碳源和能源正常生长,从而会使其在染料废水处理中因补充碳源或能源使成本提高.我们曾报道了青霉菌Penicillium sp.对偶氮、蒽醌染料的吸附、脱色降解作用[3].但利用青霉菌和细菌共同作用对染料吸附、脱色及其吸附脱色能力的再生从而降低处理成本的研究国内外还未见报道.本文在前述工作的基础上进一步探讨了碳、氮营养因子对青霉菌和细菌吸附及脱色降解染料的影响,以加快青霉菌对染第22卷第6期2002年11月环 境 科 学 学 报ACT A SCIE NTI AE CIRCUMST ANTI AEV ol.22,N o.6N ov.,2002087环 境 科 学 学 报22卷料的吸附去除和与细菌共培养时的脱色降解速度,促进青霉菌吸附脱色能力的再生,为真菌应用于染料废水处理,加快染料脱色降解速度,增加菌体对染料废水的处理次数提供理论依据及技术指导.1 材料与方法1.1 材料染料:偶氮染料S2119(P oly S2119T M,最大吸收波长为472nm)购自Sigma公司,蒽醌染料艳紫K N2B(C.I.Reactive violet22,最大吸收波长为562nm),取自苏州某印染厂.酸性染料废水:采自苏州某印染厂,颜色为黑紫色,C OD值为1000—1500mgΠL,pH3.1.真菌:青霉菌G21(Peni2 cillium sp.B1,ATCC74414),取自美国模式菌种保藏中心.细菌:L21菌株(Enterobacter sp.)和L22菌株(P seudomonas sp.),从染料废水中分离、获得,并通过API分类系统鉴定到种.本实验以L21菌株和L22菌株的混合细菌悬液为接种物.1.2 培养基PDA培养基[4],葡萄糖浓度改为5gΠL,酒石酸铵20mm olΠL,pH5.8,葡萄糖含量对菌丝吸附脱色影响实验中葡萄糖浓度分别为0、2.5、5.0、10.0和20.0gΠL,含氮量对菌丝吸附脱色影响实验中酒石酸铵浓度分别为0、10、20、30和40mm olΠL.1.3 培养方法以斜面培养基上的青霉菌G21孢子制成孢子悬液,4层纱布过滤后接种液体培养基, 28℃,150rΠmin振荡培养3d,取出菌丝球做吸附实验,同时向培养液中加入1m L1×109—2×109个Πm L混合细菌悬液继续培养.1.4 菌丝对染料吸附脱色能力再生实验方法称取10g湿菌球放入100m L已灭菌的不同浓度染料水溶液中,28℃,150rΠmin振荡,12h 后取上层清液3000rΠmin离心15min,分光光度法测定染料最大吸收波长处的吸光度值,计算染料残留量,同时从染料水溶液中取出吸附染料的菌丝球放回加入细菌的原培养液中,观察菌丝球颜色变化,当菌丝球上颜色完全褪去,重新变成白色时即认为染料完全脱色,随后将菌丝球放入初始浓度与前次相同的染料水中,重复上述吸附脱色实验,观察、测定菌丝吸附脱色能力再生情况.1.5 菌丝对染料废水的处理称取200g湿菌球放入2000m L染料废水中,常温(25℃)下曝气,处理过程中以重铬酸钾法[5]定时测定水样C OD值,日立U23000分光光度计扫描10倍稀释水样在200—700nm的吸收光谱,根据光谱图比较废水在较大吸收波长504nm处吸光度值(A)的变化,计算色度去除504率.3h后取出吸附染料的菌丝球放回加入细菌的原培养液中,目测菌丝球上的染料完全脱色后,取出吸附能力得到再生的菌丝球放入新的染料废水中,再次测定水样C OD值和吸光度值变化.由于从培养基中取出的菌丝球放入废水中会带入一部分有机物,废水吸附试验的同时进行对照试验,取20g湿菌球放入200m L蒸馏水中,以相同处理方式测定蒸馏水的C OD值(C OD对照)变化,菌丝对染料的C OD去除率(%)=(C OD原废水-C OD水样ΠC OD原废水)×100%.2 结果与讨论2.1 营养因子对青霉菌和细菌吸附及脱色降解染料的影响图1 葡萄糖对菌丝吸附去除染料的影响F ig.1 E ffect of glucose on ads orption and elim ination of dyes by m ycelium of P enicilium s p.2.1.1 葡萄糖含量对菌丝吸附、脱色的影响 由图1可见,在不同葡萄糖浓度培养基中培养的菌丝对染料的吸附去除效果不同,无葡萄糖培养基中培养的菌丝对染料的吸附去除效果最差,而含葡萄糖培养基中培养的菌丝球对染料水溶液处理20h ,去除率都在95158%以上.从一定量菌丝吸附染料速率看,5g ΠL 以上葡萄糖培养基中培养的菌丝球对两种染料的吸附速率均较快.将在染料水中吸附20h 后的菌丝球放回加入混合细菌的原培养液,菌丝上的染料吸附牢固,只有极少量染料进入培养液,培养其间菌丝和培养液中染料逐步脱色,从表1可知葡萄糖浓度高或低,均使完全脱色时间延长,从吸附速率和完全脱色时间综合评价,以5g ΠL 葡萄糖浓度的培养基中培养的菌丝对染料的吸咐脱色效果最好,以下试验所用培养基葡萄糖浓度均采用5g ΠL.表1 菌丝上染料在不同葡萄糖浓度培养基中的完全脱色时间(h)T able 1 T ime (h )needed for com plete decolorizationof dyes abs orbed on mycelium in mediumwith different glucose concentrations 葡萄糖浓度,g ΠL0 2.5 5.010.020.0S 211948483696148艳紫K N 2B4824812722.1.2 含氮量对菌丝吸附脱色的影响 本试验采用酒石酸铵作为G 21菌株的主要氮源.菌丝球在S 2119和艳紫K N 2B 染料水溶液中吸附10h 后,染料去除率见表2,由实验结果可知,菌丝对同种染料的吸附去除作用受氮源浓度影响不大.将在染料水溶液中吸附20h 的菌丝球放回加入细菌的原培养液后,染料完全脱色时 表2 不同氮源浓度培养基中的菌丝吸附10h 染料去除率(%)T able 2 Rem oval rate of dyes by mycelium abs orbed for10hours in medium with different N concentrations酒石酸铵浓度,mm ol ΠL010203040S 211995.9894.3095.9696.0095.78艳紫K N 2B98.4798.8099.2099.0899.13表3 菌丝上染料在不同氮源浓度培养基中的完全脱色时间(h)T able 3 T ime (h )needed for com plete decolorizationof dyes abs orbedon mycelium in medium with different N concentrations酒石酸铵浓度,mm ol ΠL010203040S 211912096386060艳紫K N 2B962481236间见表3.由表3可知,菌丝上染料的脱色受氮源浓度影响较大,吸附了S 2119和艳紫K N 2B 的菌丝都以在酒石酸铵浓度为20mm ol 的培养基中脱色最快,由于培养基中经历了3d G 21真菌的生长,1d 混合细菌的生长,推测在加入染料的第4d 培养基中氮源消耗较大.J.S wamy 的实验发现T .ver sicolor zai 在有葡萄糖(>0.13g ΠL )和低N 浓度(0.086g ΠL NH +4)条件下可保持快速脱色[6],P .chrysosporium 中起染料脱色作用的木素过氧化物酶(LiP )和锰过氧化物酶(MnP )的产生也与碳、氮浓度有关[7,8],限N (<2.4mm ol )或限C (<0.01mm ol )有利于染料脱色,本实验中青霉菌G 21和L 21、L 22细菌对染料的脱色速度亦与碳、氮浓度有密切关系,但碳、氮浓度分别在什么浓度范围时可对染料快速脱色还有待进一步研究.以下试验所用培养基酒石酸铵浓度均采用20mm ol ΠL.1876期李蒙英等:真菌和细菌对染料的吸附脱色及再生能力的研究2.2 菌丝吸附能力的再生G 21菌丝对100、200、400、600和800mg ΠL 艳紫K N 2B 水溶液吸附12h 后的染料残留浓度、放回原培养液后染料完全脱色时间及吸咐脱色能力再生情况见表4.用于处理100mg ΠL 染料水溶液的G 21菌丝球吸附、脱色再生次数可达4次,在第1、2和3次吸附时,对染料的去除率分别达98.1%、93.0%和89.3%,完全脱色时间均在12h 左右,第3次完全脱色后的菌丝球开始松散,无韧性,较难从培养液中全部取出,用于第4次吸附的菌丝球量减少,但染料去除率仍达66.7%,菌球对吸附染料第4次脱色后,菌球松散,不能再用.菌丝对400mg ΠL 以上染料水溶液的吸附、脱色,尽管再生次数少,但由于每次吸附量较大,累计吸附、脱色染料的总量与100mg ΠL 和200mg ΠL 的相近.表4 菌丝及再生菌丝对艳紫KN 2B 的吸附脱色T able 4 Ads orption and decolourization of C.I.Reactive violet 22by mycelium and regenerated mycelium初始浓度,mg ΠL 第1次第2次第3次第4次残留浓度,mg ΠL 完全脱色时间,h残留浓度,mg ΠL 完全脱色时间,h残留浓度,mg ΠL 完全脱色时间,h残留浓度,mg ΠL 完全脱色时间,h1001.898 6.96810.691233.332420065.692468.3824122.0948400229.9024242.6596600411.2730466.67120800581.3730685.29120 J.S wamy 等研究了真菌T .ver sicolor 对染料的连续脱色[6],以探索真菌脱色能力的持久性,培养液中真菌可在第3—15d 内对连续加入至20—60mg ΠL 的同一种或不同种或混合染料图2 原染料废水和经G 21菌丝处理1、2和3h 的染料废水的光谱图Fig.2 S pectrogram of original dve 2wastewater and the wastewater treated by mvcelium for 1,2,3h脱色.李慧蓉等研究了白腐真菌的固定化脱色[9],通过真菌的固定化探索真菌脱色染料的工业化应用,生长固定在维尼纶纤维上的白腐真菌P .chrysosporium 对100mg ΠL 比布列希猩红第5天的脱色率达97.2%,整个脱色过程均在培养液中进行.本实验中青霉菌G 21通过菌丝再生,对染料的脱色能力可维持8d 左右,但由于实验中G 21菌丝首先用于对染料水中染料的吸附,使染料水中染料被迅速抽提出来,减少了水体中的染料含量,吸附染料的菌丝则在培养液中与细菌共同完成对染料的脱色降解,因为青霉菌对染料的吸附和脱色不是在培养液这一单一体系中进行,这种脱色方式较有可能使真菌对大水量染料废水进行处理.2.3 菌丝对染料废水的处理从图2看出不同水样在226、312、504和622nm 处各有一吸收峰,其中以504nm 处吸收值最大.随处理时间的延长,染料废水各吸收波长处的吸光值均下降,以504nm 处吸光值的变化计算菌丝对染料废水色度去除率,由表5可知菌丝第1次对染料废水处理3h 色度去除率达7519%,吸附染料的菌丝放回原培养液后第3d 染料完全脱色,脱色能力得到再生的菌丝第2次对染料废水处理3h 色度去除率为6813%,吸287环 境 科 学 学 报22卷附染料的菌丝放回原培养液后脱色时间延长,第10d 菌丝和培养液中仍有少量染料没有脱色,菌丝球开始松散失去再生能力.两次处理,菌丝在3h 内均可通过吸附作用从废水中去除大部分染料,但处理后废水C OD 值仍偏高,从对照试验发现菌丝球带入一部分有机物到废水中,不同处理时间水样的C OD 中包含一部分由菌丝球带入的有机物,从而增加了废水中的C OD ,虽然处理后水样的C OD 值不够理想,但废水的性质已发生改变,废水中不易生物降解的染料大分子被菌丝吸附去除,增加了一部分由G 21菌丝带入的有机物,从而增强了废水的可生化程度,这就为废水的深度处理带来了方便.吸附到菌丝上的染料在与细菌共培养中被脱色,实现了微生物对复杂有机大分子物质的生物降解.表5 菌丝和再生菌丝对染料废水的处理T able 5 T reatment of dye wastewater by mycelium and regenerated mycelium第1次第2次原废水1h 2h 3h原废水1h 2h 3h A 5040.6730.2490.1850.1620.6210.2750.2150.197色度去除率,%63.072.575.955.765.468.3COD 水样,mg ・L -11015585.3486.1466.31018675.1601.1585.3COD 对照,mg ・L -1248.0297.6317.0COD 去除率,%42.352.154.133.740.142.53 结论青霉菌G 21可对偶氮染料S 2119、蒽醌染料艳紫K N 2B 水溶液中染料快速吸附去除,吸附染料的菌丝在与细菌的共培养中完成对染料的脱色降解.菌丝对同种染料的吸附速度随菌丝培养液中葡萄糖浓度的增加而加快,而脱色速度则以在葡萄糖含量较低的培养液中为快,完成脱色的菌丝吸附脱色能力得到再生,菌丝对100mg ΠL 的艳紫K N 2B 染料水溶液可重复处理4次,菌丝的再生为真菌对染料废水的低成本处理探索了新的途径.青霉菌G 21菌丝和再生菌丝对酸性染料废水处理1—3h ,色度去除率可达55.7—75.9%,废水中大部分不易生物降解的染料大分子被菌丝吸附去除,并在与细菌的共培养中被脱色降解,实现了微生物对复杂有机污染物的生物降解.参考文献:[1] S wamy J ,et al .The evaluation of white rot fungi in the decoloration of textile dyes[J ].Enzyme and M icro T ech ,1999,24:130—137[2] W ang Y X ,et al .Ads orption and degradation of synthetic dyes on the mycelium of T rametes versicolor[J ].W at sci T ech ,1998,38(4):233—238[3] 李蒙英等.青霉菌(Penicillium sp.)对三种活性染料的吸附和降解[J ].中国环境科学,2001,21(5):447—451[4] 张纪忠,编.微生物分类学[M].上海:复旦大学出版社,1990.364[5] 电力科学研究院.火力发电厂水汽实验方法[M].北京.中国工业出版社,1984.167—171[6] S wamy J ,et al .E ffects of glucose and NH +4concentrations on sequential dye decoloration by Trametes versicolor [J ].Enzyme and M icro T ech ,1999,25:278—284[7] M eyser P ,et al .Ligninolytic enzyme system of Phanerochaete chrysosporium :Syntheszed in the absence of lingnin in response to ni 2trogen starvation[J ].J bacteriol ,1978,135(3):790—797[8] Farrel R L ,et al .Physical and peroxidase is oenzymes from Phanerochaete chrys osporium[J ].Enzyme and M icro T ech ,1989,11:322—328[9] 李慧蓉,等.黄孢原毛平革菌细胞固定化技术的比较研究[J ].环境科学研究,2001,14(1):41—443876期李蒙英等:真菌和细菌对染料的吸附脱色及再生能力的研究。
广谱染料脱色细菌的分离鉴定及脱色特性初探
快速拉动了国内染料消费 的增长． 染料工业生产的
各 类染 料 、 光增 白剂 及有 机 颜 料 等 广 泛应 用 于 纺 荧
料的有氧降解有重要的理论价值和实际应用价值．
本试 验 以偶 氮 、 醌 、 环 、 苯 甲烷 不 同结 构 蒽 杂 三 类 型 的 ４种合 成染 料 为筛 选 底 物 ， 印染 厂 排 出 的 从 废 水 中分 离 出多株 对不 同结 构类 型 的染 料具 有脱 色 作 用 的细菌 ． 进一 步对 这些菌 株进 行生 理生化 鉴 定 ，
染 料从 结构 上 可分 为 偶 氮 、 醌 、 环 、 苯 甲 蒽 杂 三 烷等 ， 多是 难 以降 解 的芳 香 族 化合 物 Ｊ 目前 印 染 ． 废 水 的处理 方 法 主 要 有 化 学 混 凝 法 、 化 法 、 附 氧 吸
法、 内电解法、 物絮凝 、 生 生物 吸附等 ， Ｊ 而生 物降
中 图分类 号 ：５８ Ｑ Ｑ３； ７
文献标 识码 ： Ａ
文章编 号 ： ０ — ３ （０２ ０－ ８－ １ １ ３７ ２１ ）２ ０９ ７ ０ ５ ０ － ０
进 入新 世纪后 ， 中国纺织 和 印染等 行业 的发展 ，
生 长 、 以不 同结 构 的染 料 为 唯 一 碳 源 的细 菌 涂料、 油墨等各个领域． 在
发 展经 济便 利生 活 的 同时 也 造成 了环 境 污染 ， 大 其 量 排放 的废水 ， 不仅 Ｃ Ｄ、 Ｏ 盐度 和 酸 度 高 ， 而且 色 度
高效纤维素降解菌的筛选鉴定及特性研究
3、探索高效纤维素降解菌在其他方面的应用，如生物医药、生物防治等领 域；
4、结合现代生物技术手段，如基因工程、代谢工程等，对高效纤维素降解 菌进行遗传改造，提高其性能和适应性。
参考内容
引言
纤维素作为一种重要的生物质资源，在生物能源、材料等领域具有广泛的应 用前景。纤维素降解菌能够将纤维素分解为可利用的糖类，为工业生产和生物技 术领域提供重要的原料。因此，筛选具有高效降解能力的纤维素降解菌并研究其 特性，对于实现纤维素资源的有效利用具有重要意义。
高效纤维素降解菌的筛选鉴定及特 性研究
目录
01 高效纤维素降解菌的 筛选鉴定
03 结论与展望
02
高效纤维素降解菌的 特性研究
04 参考内容
随着生物技术的迅速发展，微生物在环保、能源等领域的应用备受。高效纤 维素降解菌作为其中之一，在解决全球气候变化、生物质能源开发等方面具有重 要意义。本次演示将围绕高效纤维素降解菌的筛选鉴定及特性研究展开论述。
4、数据处理与分析：对测定结果进行统计和分析，比较混合菌种与单一菌 种的降解效果。
3、测定结果
通过上述测定方法，我们发现混合菌种在纤维素降解方面表现出以下优势：
1、混合菌种的纤维素降解率高于单一菌种，说明不同菌种之间的协同作用 有助于提高降解效果。
2、混合菌种的生长曲线呈现平稳增长趋势，说明各菌种之间具有一定的协 同生长作用。
背景
纤维素降解菌主要包括细菌、真菌和放线菌等。这些微生物通过产生纤维素 酶来分解纤维素，将其转化为可利用的糖类。纤维素酶是一种复合酶，包括内切 葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等，分别作用于纤维素的不同部位， 使其降解为单糖。
方法
筛选纤维素降解菌的方法主要包括以下步骤：
一株染料高效脱色菌的分离与初步鉴定
． ／ ＼ 一
（） １ 废水的生化降解实验 。活性 污泥 取 自 图１ ＢＴ 金 Ｆ装置示意图 Ａ 华县双 宏化工 有限公司 ，污泥经过间歇 性驯化培养三周后 ， 加至反 投 应器 中接种挂 膜。由于连续式一边进水一边出水试验需要较 大水量 ， 因此本试验采用间歇式进水进行废水生化降解小试试验 。 （ ） ２ 污泥 的驯化 。取曝气池 原废水 ，加入适 量营养液傲补充碳 源 ，定期更换反应器 上清 液并逐步增 加原废水浓 度 ， 常温下驯化培养 ２ ３ ，并注意观 察溶液颜色 的变化 。通过对污泥 的驯化培养 ，使污 —周 泥中以染料为营养源 的细菌 大量繁殖 ，对染料不适应 的微生物加 以淘
１ｇ ０ ，牛 肉膏 ３ ，氯 化钠 ５ ，琼 ］ １－ ０ ，水 １０ ｍ ｇ ｇ ］ ５２ｇ ］ ￣ ０ ０ Ｌ，ｐ ７ － ．， Ｈ．７ ０ ２ １１２ 菌２￣ ￣。⑧ 染料培 养基 ：蛋白胨 １ｇ ２２灭 ｏ ｅ ０ ，牛肉膏３ ，Ｎ Ｃ５ ， ｇ ａｌ ｇ 染料５ ｍｇ ， ｌ ０ｍＬ ｐ ７ — ．，１ １ ０ ／ 水 Ｏ０ ， Ｈ ． ７ Ｌ ０ ２ ２ ℃灭 菌２ ｒ ｎ ０ ｉ。 ａ
填料大小 ：ａａａ １ ｃ １ ｃ １ ｃ （ ＊＊＝ ． ｍ＊． ｍ＊． ｍ 原来填 ３ ３ ３ 料的１ ６， 加量 ：３％。 ／ ）投 １ ０
。 ． 抖立方体边长。
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一。
－ － ： 池体直径 ；Ｈ 有效水深；Ｔ 水温 ；ｒ填 ． ６
－ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
１ 验 ． ４实 方法
关键词 印染废水 曝 气 生 物 流 化 床 （ＢＦ ） 脱 色 菌 Ａ Ｔ 生物 降 解
近２年来 ，随着合成纤维 的大量发展 ， 机染 料得到了极其广泛 ｏ 有 的应 用。染 料类型和应 用范 围 日益 扩大 ，产 量和 品种发展 迅速 。近 ｌ年来 ，我国的染料化学工业发展很快 ，已经 能够 生产ｌ个 大类的染 Ｏ １ 料 ，使得在工业废水当中 ，来 自印染和纺织工业 的染料废 水成为最难 处理的废水之一 ，这是因为染料是一种合成 的、含有复杂 的芳环类 结 构的化合物 ，很难被 生物 降解 。 染料废水对环境有很 大影响。在染料的生产和使用过程 中，大 约 有１％一０ ０ ２％的染料 以含染 料废水的形式 ， 放于环境 中 排 。染料废水 中含 有多种 具有生物 毒性或 三致性 能的有机物 ，难以采用常规处理方 法进 行治理 ，尤其是 废水 中残存的染料 组分即使浓度很低 ，排入水体 也会造 成水体透光率 降低 ， 导致 水体生态 系统 的破坏 ，由此造成不可 计量 的生态 及经 济损失 。据报 道 ，８％ ９％的癌症 与环 境 因子有 ０ 一０ 关 ，而 已发现的致癌物 中绝大多数是有 毒有机化合 物 。因此 ，印染 废水 的脱色和 回用成为一个关系生态环境和水资源的重要课题 。 处理印染废水常用的方法有物化法和生物 法。采用物化处理比较 有效 ，但处 理费用 高 ，且会 产生大 量难处理 的污 泥 ，形 成二次 污染 等 。而 采用生物氧化 法处理印染 废水 ，合格 率不足 ６％ ０“ 。本实验 生 物法采用曝气生物流化床 （ Ｂ Ｔ） Ａ Ｆ 处理印染废水 。 曝 气生 物流 化 池是 三 相生 物 流化 床 的 一种 ，曝气 生 物流 化 池 Ａ Ｆ （ ｅ ｆ ｎ ｉ ｏｉ ｌ ｌ ｄ ａｋ处理 工艺是微生 物 、酶与载体 自 Ｂ Ｔ Ａ ｒ ｏ ｏ ｇ ａ Ｆｕ ｎ ） ａ Ｂ ｌ ｃ ｉＴ ｉ 固定化技术的好氧 生物反应器。采用了合成高分子载体 固定化微生物 技术 ，该载体具有 大孔网状 以及优 良的机械强度和化学性能 ， 持水 量 是载体质量的２倍 ，空隙率为９％。载体 的比表 面积与常规的生物技 ５ ６ 术相比大许多 ， 以获得 高得多的生物量 ，废水基质的降解速度快 ， 可 停 留时问短 。在工 艺处理 中 ， 维持 了生 物的多样性 ，好氧菌 、兼性菌
一株Coniella 属真菌的分离培养鉴定及抑菌活性实验
Vol.36No.6Jun.2020赤峰学院学报(自然科学版)Journal of Chifeng University (Natural Science Edition)第36卷第6期2020年6月植物内生真菌是指在健康植物各种组织和器官内部或细胞间隙中度过全部或近乎全部生活周期而不使寄主表现任何症状的一类真菌[1],主要为子囊菌及其无性型,少数担子菌和接合菌.内生真菌感染植物组织,一般以菌丝存在于细胞内和细胞间,从寄主中吸收营养物质供其生长所需,同时内生真菌为寄主生长发育提供水分、矿物质元素等,二者互利互惠[2].植物内生真菌普遍存在于植物组织中,种类多,代谢物不仅能刺激植物生长发育、增强寄主的抗逆性,如抗旱、抗寒等能力[3-5],而且能提高植物对病虫害的抵抗力[6-10],研究发现植物内生真菌能产生具有多种生物活性的新型化合物,如抗生素、植物生长调节剂、免疫抑制活性物质、抗肿瘤活性物质等,极有可能成为发现和生产生物活性物质的重要来源,在医药、农林业等领域具有潜在的应用前景.真菌传统的分类鉴定主要是根据产孢结构和方式、孢子的形态学特征来确定.但有些内生真菌在自然条件和人工培养条件下均以菌丝和无形态形式存在,因此给形态鉴定带来困难,ITS 即内部转录间隔区,是核糖体DNA(rDNA)中的非编码转录间隔区,该区域基因在不同菌株间存在丰富的变异,国内外对ITS 区进行序列分析技术已很常见,在真菌的分类鉴定及系统发育等研究报道很多.本文采用形态学鉴定和ITS 测序法对一株内生真菌进行分离培养鉴定并对其抑菌活性进行研究.1材料和方法1.1供试材料赤峰学院校园内赤芍(Paeonia lactiflora Pall)为材料,截取健康新鲜的芍药侧根进行内生真菌的分离.1.2内生菌的分离和纯化取健康芍药植株侧根用自来水冲洗干净晾干,分别用0.1%升汞漂洗10~30s,然后用无菌水冲洗,再用75%酒精漂洗0.5~1min,最后用无菌水冲洗数次.样品经处理完毕后,在超净工作台内无菌状态下切成0.2cm 薄片,切口置于PDA 培养基上,每个培养皿3个样品.置于28℃条件下黑暗培养3~7d,观察培养材料切口处长出菌丝,挑取切口处菌落边缘菌丝转接到新的PDA 平板上,经2~3次纯化,得到纯培养.1.3内生菌的形态鉴定一株Coniella 属真菌的分离培养鉴定及抑菌活性实验张志博,张亚男,张笑,刘丽菲,贠娜娜,田慧敏(赤峰学院化学与生命科学学院,内蒙古赤峰024000)摘要:从赤芍(Paeonia lactiflora Pall )植株根部分离到一株内生真菌(编号Gen7).该菌菌丝无色,具隔膜,分生孢子梗短或无,分生孢子椭圆形初为无色,后为棕色;根据形态学特征鉴定为Coniella 属.基于ITS 的BLAST 检索表明该菌株与Coniella fragariae 相似度高达99.6%以上,鉴定为草莓垫壳孢Coniella fragariae (Oudem.)B.Sutton ,该菌属于半知菌门,球壳孢目spharropsidales ,球壳孢科Sphaeropsidacea 垫壳孢属Coniella ,为内蒙古新记录种,以黄瓜尖镰孢菌Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum J.H.Owen 、灰葡萄孢菌Botrytis cinerea Pers 和茄科劳尔氏菌Ralstonia solanacearum (Smith)Yabuuchi et al.为材料,研究其抑菌活性,发现Coniella fragariae (Oudem.)B.Sutton 对3种指示菌有不同程度的抑制作用,平均抑菌率分别达48.2%、43.1%和24.7%,该研究结果为内生真菌分离培养鉴定提供研究提供方法,并为潜在生防菌的开发利用提供理论依据.关键词:Coniella 属真菌;培养鉴定;抑菌活性中图分类号:Q914.83文献标识码:A文章编号:1673-260X(2020)06-0033-03收稿日期:2020-04-01基金项目:内蒙古自治区创新创业训练项目(201810138009)通讯作者:田慧敏(1980~),女,硕士,副教授,主要从事真菌学多样性教学及科研工作,E-mail:tiancfxy2009@33--. All Rights Reserved.1.3.1宏观特征观察法根据内生真菌在PDA培养基上的培养特征,包括菌落正面和背面颜色、纹饰、质地以及边缘形状、生长速度、大小进行观察,使用手机拍照记录.1.3.2显微观察挑取获得的纯培养菌丝,制成徒手切片,镜检观察菌株菌丝及产孢结构,如:分生孢子梗、分生孢子形态及大小等.依据真菌分类文献进行分类鉴定.1.4基于rDNA~ITS测序分子鉴定将纯培养菌丝加入液氮充分碾磨,取真菌组织约30mg,提取基因组DNA,用天根PFU PCR mix 进行PCR扩增,引物ITS1F/ITS4R,对所得PCR产物进行切胶纯化回收(DNA凝胶纯化试剂盒,AXY⁃GEN),使用NL4对回收DNA片段进行DNA测序.1.5数据处理用NCBI Blast程序将拼接后的序列文件在16S数据库中的数据进行比对,得到比对结果,从结果中挑选出同源性较高的DNA序列,查找相似性最高的菌种,确定分离菌株的分类地位.利用软件MEGA5.1按照最大似然法构建系统进化树,发育树的每个分支的统计学显著性分析重复次数为1000次.1.6该菌株对几种植物病原菌株的抑菌实验1.6.1指示菌采用植物常见病原菌,黄瓜枯萎病菌黄瓜尖镰孢菌Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum J.H. Owen、茄科劳尔氏菌Ralstonia solanacearum和灰葡萄孢菌Botrytis cinerea Pers菌株均来自微生物实验室.1.6.2实验方法采用对峙培养法,在无菌操作台上分别取指示菌定量接种,在固体培养基中,挑取内生真菌菌丝或孢子,每个样品做3个重复.培养皿置于室温培养,分别于培养3天、5天、9天后测定抑菌圈直径大小,重复多次,检测其抑菌效果.1.6.3抑制效果计算方法在无菌操作台上将三种指示菌接种于PDA培养基(d=10cm)中心,周围接种Gen7,接种3个接种点,置于室温24℃,培养72h后开始测量抑菌圈直径,抑菌率=DCK~DX/DCK×100,DCK=CK菌落直径,DX=对峙培养后尖孢镰刀菌的菌落直径.2结果与分析2.1Gen7菌株鉴定结果2.1.1形态学特征培养特征:菌落起初白色,棉絮状,背面呈灰白色,后期菌落会有黑棕色环形条纹,背面橘黄色,中央色深.最后整个菌落变为黑色.显微特征:分生孢子梗未见,产孢细胞圆柱形,无色,光滑,直径6~9μm,分生孢子初期无色长椭圆形,单胞顶端钝圆,无色,有的有两油滴,孢子6~ 8.4μm×4~6μm.2.1.2基于rDNA-ITS构建系统发育分析以Gen7所测两条序列Gen7-1和Gen7-2的ITS基因序列在Genbank数据库BLAST搜索,表明Gen7-1、7-2与Coniella fragariae(MH861493)相似度100%,Coniella fragariae(MG748688)相似度为99.61%,而与葡萄白腐病菌Coniella diplodiella 90.61%亲缘关系较远,与桉树小帽壳孢菌Pilidiella eucalyptorum相似度90%,Pilidiella为Coniella同物异名,都属于半知菌门,球壳孢目spharropsidales 球壳孢科Sphaeropsidaceae.2.1.3Gen7鉴定结果根据垫壳孢属Coniella态特征的描述[11,12]结合分子鉴定结果,该菌为草莓轮纹叶斑病病原草莓垫壳菌Coniella fragariae(Oudem.)B.Sutton.2.2抑菌试验结果对Gen7菌株与黄瓜尖镰孢菌Fusarium oxys⁃porum f.sp.cucumerinum J.H.Owen、茄科劳尔氏菌Ralstonia solanacearum、灰葡萄孢菌Botrytis A~B.3天后菌落正面和背面;C~D.5天后菌落正面和背面;E~F.9天后菌落正面和背面;G.菌丝及厚垣孢子;H.分生孢子图1Gen7菌株培养特性和显微结构特征图2菌株及来自Genbank的最相似物种的ITS序列构建的NJ系统发育树34--. All Rights Reserved.cinerea Pers 进行抑菌实验,结果表明,Gen5对所测试菌均具有不同程度的抑制作用.从表中可以看出菌株Gen7对黄瓜尖镰孢菌平均抑菌率达48.2%,对灰葡萄孢菌最大抑菌率达43.1%,对茄科劳尔氏菌的平均抑菌率24.7%,培养一周后对镰孢菌最大抑菌率70.6%,能明显抑制黄瓜枯萎病菌的生长,对灰霉病菌最大抑菌率达到62.5%,能明显抑制灰霉病的生长,而对茄科病菌抑菌率最大为24.7%,具茄科青枯病菌生长具有一定的抑制作用.Gen7对黄瓜尖镰孢菌Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum 、茄科劳尔氏菌Ralstonia solanacearum 、灰葡萄孢菌Botrytis cinerea 在第4天时,抑菌圈达到最大分别为48.8mm、20.7mm、40.7mm,抑制作用极强,5天后菌落直径30mm 以上,完全被抑制,生长缓慢基本停止,7天后抑菌率70%以上,完全被覆盖.3讨论本研究从芍药根部分离的一株真菌Coniella fragariae ,该种存在的变形结构,常被误定为Pili⁃diella 属,该种分布广泛,是植物病原之一,可侵入植物根、茎、叶,寄主范围较广,同时也可腐生于动物粪便中,研究表明从鹅肺中分离出的菌株提取的化合物抑制肿瘤细胞的迁移[13].尖孢镰刀菌、灰霉病菌和番茄青枯病菌具有很强的抑菌作用,为开发园艺植物病害生防菌提供理论依据,本研究对内生真菌仅做了分子鉴定及简单的抑菌实验,而内生菌发酵产物的功能还需进一步研究,为菌物资源的鉴定及安全开发提供依据.———————————————————参考文献:〔1〕郭良栋.内生真菌研究进展[J].菌物系统,2001,20(01):148-152.〔2〕官珊,钟国华,孙之潭,等.植物内生真菌的研究进展[J].仲恺农业技术学院学报,2005,18(01):61-66.〔3〕Funk C R,Halisky P M,Johnson M C,et al.Anendophytic fungus and resistance to sod webworms:association in Lolium perenne [J].Bio and Technology,1983,1:189-191.〔4〕Findlay JA,Li G,Johnson JA.Bioactive com⁃pounds from needles [J].Can J Chem.,1997,75:716-719.〔5〕兰琪,姜广华,吴文君.农用植物内生真菌研究进展[J].世界农药,2002,24(03):10-11.〔6〕White JF,Cole GT.Endophyte host associa⁃tions inforage grass Ⅲ.In vitro inhibition of fungi by Acremoniumcoenophialum [J].Mycolo⁃gia,1985,77:487-489.〔7〕李桂玲,王建锋,黄耀坚,等.几种药用植物内生真菌抗真菌活性的初步研究[J].微生物学通报,2001,28(06):64-68.〔8〕李飞,李春杰.内生真菌对禾草类植物抗旱性的影响[J].草业科学,2006,23(03):57-62.〔9〕West CP.Physiology and drought tolerance of endophyte infected grasses.Biotechnology of Endophytic Fungi of Grasses [C].CRC Press,Boca Raton,1994,87-99.〔10〕Malionwski DP,Belesky DP.Neotyphodiumcoenophialumendophyte infection affects the a⁃bility of tall fescue to use sparingly available phos⁃phorus [J].Journal of Plant Nutrition,1999,22:835-853.〔11〕Alvarez LV,Groenewald JZ,Crous 〕PW.Genera of phytopathogenic fungi [J].Mycolo⁃gy,2016,85:1-34.〔12〕Marin FY,Groenewald JZ,Cai L,et al.Re⁃vising the Schizoparmaceae:Coniella and its synonyms Pilidiella and Schizoparme[J].Mycol⁃ogy,2017,86:99-216.〔13〕Haiqian Yu,Julia Sperlich,Attila Mándi,etal.Azaphilone Derivatives from the Fungus Coniella fragariae Inhibit NF -KB Activation and Reduce Tumor Cell Migration[J].J.Nat.Prod.,2018,81(11):2493-2500.菌株/抑菌率2天后4天后7天后平均抑菌率%黄瓜枯萎病菌20.5±0.68b 53.6±1.08b 70.6±2.17ab 48.2a 灰霉病菌25.6±1.27a 41.4±1.47a 62.5±1.23a 43.1a 茄青枯病8.7±0.22a 18.6±0.44a 46.8±0.10a24.7b表Gen7对各种菌的抑制率实验结果A~B.Gen7对灰霉病菌有抑制作用曰C~D.Gen7对黄瓜枯萎病图3接菌5天后Gen7对各种病原菌的抑制情况35--. All Rights Reserved.。
1株产高温纤维素酶细菌的分离及Biolog鉴定
1株产高温纤维素酶细菌的分离及Biolog鉴定赵旭;王文丽;李娟【摘要】以羧甲基纤维素钠为唯一碳源,从来自甘肃永昌的双孢菇培养料中分离筛选得到1株降解纤维素的耐高温菌X3.利用Biolog GENⅢ微孔板将该菌株鉴定为芽孢杆菌(Bacillus vallismortis/subtilis).在初始pH为7.0、温度为50℃、接种量为2％、摇床转速为200 r/min的条件下培养72 h,该菌株粗酶液的CMCase活力达到20.36 U/mL.【期刊名称】《甘肃农业科技》【年(卷),期】2018(000)006【总页数】4页(P30-33)【关键词】芽胞杆菌;高温纤维素酶;筛选;Biolog鉴定【作者】赵旭;王文丽;李娟【作者单位】甘肃省农业科学院土壤肥料与节水农业研究所, 甘肃兰州 730070;甘肃省农业科学院土壤肥料与节水农业研究所, 甘肃兰州 730070;甘肃省农业科学院土壤肥料与节水农业研究所, 甘肃兰州 730070【正文语种】中文【中图分类】S181纤维素是绿色植物细胞壁的主要成分，是绿色植物通过光合作用形成的物质，为地球上含量最大的碳水化合物［1］。
然而由于纤维素降解速度缓慢，并且难溶于水，所以目前对纤维素的开发利用效率还非常低。
我国纤维素类资源丰富，农业生产中每年都产生数量非常巨大的作物秸秆和皮壳［2］，然而目前处理这些农业废弃物最主要的方法是将其在原地焚烧，这种方法虽然省时省力，但原地焚烧秸秆不仅没有充分利用秸秆给农民带来应有的经济效益，而且还严重污染了环境，加速了环境的恶化［3］。
理化降解纤维素的方法因降解成本高，容易污染环境而使用较少。
无污染、绿色环保分解利用纤维素的有效途径之一是利用纤维素酶的水解作用将其分解成小分子的有机物，并用这些有机物被用来合成多种为我们能利用的有益物质。
纤维素酶（Cellulase）是一类能够降解纤维素生成葡萄糖等小分子有机物的酶的总称，主要由真菌、放线菌、细菌等微生物产生，原生动物、软体动物、昆虫等在一定的条件下也可以产纤维素酶［4］。
人教版2019高中生物选择性必修3 生物技术与工程 第1章 微生物的选择培养和计数 同步练习1
1.2.2 微生物的选择培养与计数一、单选题(共0分)1．有报道称，自酿果酒如果在消毒杀菌方面做得不够完善，会存在大肠杆菌超标等情况。
某同学对样品中大肠杆菌进行计数时，吸取不同稀释度的样品各0.1mL，分别涂布到三个伊红美蓝培养基中（已知大肠杆菌在伊红美蓝培养基上生长的菌落呈黑色），每个稀释度接种3个平板。
在适宜条件下培养一段时间后，对平板上的黑色菌落数进行统计，结果如下表。
每毫升样品中大肠杆菌数约为（）A．7.5×104个B．7.5×103个C．2.7×104个D．2.7×105个2．下图为筛选分解淀粉的微生物的实验室培养相关操作，下列相关叙述错误的是（）A．筛选所用培养基的碳应该是淀粉和蛋白胨B．菌落①的透明圈比菌落②小，说明菌落②对淀粉的分解能力更强C．图中所示接种方法是稀释涂布平板法D．接种后应将培养皿倒置培养，培养后可以根据结果进行微生物计数3．刚果红是一种可以与纤维素形成红色复合物的染料，但不能和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生反应。
在筛选纤维素分解菌的培养基中加入刚果红染料，研究者观察到几个有透明圈的菌落。
据图分析错误的是（）A．图中培养基可用牛肉膏、蛋白胨等来配制B．培养基中的琼脂不能为纤维素分解菌提供能C．菌落②的中心区域最大，该菌落含有的纤维素分解菌数量最多D．菌落①降解纤维素的能力最强，是筛选和分离的目标菌株4．聚羟基脂肪酸酯（PHA）是由嗜盐细菌合成的一种胞内聚酯，它具有类似于合成塑料的理化特性，且废弃后易被生物降解，可用于制造无污染的“绿色塑料”。
科学家从某咸水湖中获得生产PHA含量高的菌种流程如下：①取湖水→②接种在培养基上→③培养→④挑取单菌落，分别扩大培养→⑤检测菌体的数目和PHA的产量→⑥获得目标菌株。
下列叙述正确的是（）A．②可用稀释涂布平板法接种到含PHA较高的选择培养基上B．④挑取菌落时，应挑取多个菌落以便于筛选PHA产量高的嗜盐细菌C．扩大培养时，需要将接种后的培养基放入恒温箱倒置培养，以防杂菌污染D．⑤中用显微镜直接计数法检测菌体的数目所得数值低于实际值5．下列培养酵母菌的培养基中需加琼脂的是（）A．探究酵母菌的呼吸方式B．探究酵母菌数量的动态变化C．利用酵母菌制作果酒D．酵母菌的纯培养二、多选题(共0分)6．洗手液中添加抑菌物质能够有效地减少“病从口入”。
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中国生物工程杂志 China B i otechnol ogy,2010,30(6):70Ο76一株高效广谱染料降解细菌的分离鉴定及脱色特性研究3司美茹1,233 苏 涛1 杨 革1,2(1曲阜师范大学生命科学学院 曲阜 273165)(2山东大学微生物技术国家重点实验室 济南 250000)摘要 通过梯度驯化,从印染废水长期污染土壤中分离筛选出能以4种不同结构类型的染料(刚果红、美蓝、孔雀绿和活性艳蓝K N 2R )为唯一碳源的菌株X S MR ,根据其形态学特征和生理生化鉴定及16S r DNA 序列分析,初步鉴定为无色杆菌属(A chro m obacter s p.)的菌株。
菌株X S MR 对4种染料均具有强的脱色降解能力,且对染料脱色的同时,自身能够生长繁殖,培养24h 菌体干重超过不加染料的对照。
在振荡培养条件下对该菌株的脱色反应条件进行研究,结果表明,当刚果红、美蓝、孔雀绿及活性艳蓝K N 2R 的初始浓度分别小于200mg/L 、200mg/L 、150mg/L 及150mg/L 时,在pH7.5、温度35℃、接种量4%(V /V )条件下,接种菌株X S MR 脱色14h 对4种染料的脱色率均可达到98%以上。
通过对降解产物的紫外2可见光谱分析,进一步证明了菌株X S MR 能彻底降解染料。
菌株X S MR 对染料脱色的机理包括生物降解和菌株吸附两方面。
关键词 筛选 染料 生物降解 无色杆菌属 脱色中图分类号 Q932331收稿日期:2010201205 修回日期:20102042133微生物技术国家重点实验室开放基金项目33电子信箱:si m eiru1016@ 随着染料和印染工业的迅猛发展,染料的种类和数量不断增加。
在染料生产和使用过程中,大约有10%～20%的染料随着废水排放出去,对环境造成严重的污染[1]。
染料从结构上可分为偶氮、蒽醌、杂环、三苯甲烷等,多是难以降解的芳香族化合物[2]。
染料废水显著的特点是色度高、成份复杂、水质变化大、水量大、可生化性差,pH 波动大。
因此,对染料废水进行脱色降解已成为当务之急[2]。
目前印染废水的处理方法主要有混凝沉淀、化学氧化、离子交换、光催化氧化、高压脉冲电解及生物吸附降解等[325],其中生物降解因具有无二次污染、成本低、可回收目标物质等优点而被认为是最经济有效的方法,备受广大研究者关注。
当前已有的脱色降解微生物研究主要集中在细菌和真菌方面,但多数能对染料废水脱色的细菌都是在厌氧条件下进行的,不仅不能以染料及其降解产物为唯一碳源,而且还会产生自己无法降解的、有致癌性质的无色芳香胺,对环境产生更大的危害;真菌酶系全,能彻底降解染料,但其生长缓慢、能同时降解染料的种类有限,导致其难以在废水处理中长期发挥作用,不适宜实际废水的生物修复。
因此,筛选快速生长、高效广谱、对不同结构类型的染料能彻底脱色和降解的微生物具有重要的理论和实用价值。
本试验以偶氮、蒽醌、杂环、三苯甲烷不同结构类型的4种合成染料为筛选底物,从印染废水长期污染土壤中分离出一株能对不同结构类型的染料高效脱色降解的细菌。
进一步对该菌株的脱色性能进行了研究,并利用紫外2可见分光光度计法对染料脱色代谢产物进行了分析,研究了染料的微生物脱色代谢过程,以期为工业化生物处理印染废水提供参考和依据。
1 材料与方法1.1 材 料1.1.1 供试土样 采自陕西咸阳市二印有限公司附近长期受印染废水污染的土壤。
2010,30(6)司美茹等:一株高效广谱染料降解细菌的分离鉴定及脱色特性研究1.1.2 试剂 偶氮类:刚果红(Congo Red,λmax= 506nm);三苯甲烷类:孔雀绿(Malachite Green,λmax= 618nm);杂环类:美蓝(Methylene B lue,λmax= 658nm);蒽醌类:活性艳蓝K N2R(Reactive B lue,λmax =594nm)。
以上试剂为分析纯,由曲阜师范大学微生物教研室提供。
1.1.3 培养基 (1)选择培养基 NH4NO34.0g, K2HPO4.3H2O0.5g,KH2PO40.5g,MgS O4・3H2O0.3g,微量元素溶液1m l,H2O1000m l,pH7.0。
微量元素溶液配方:FeS O4.7H2O0.5g,MnS O4・H2O0.15g, ZnS O40.14g,无水CaCl20.1g,H2O1000m l。
(2)染料培养基 在选择培养基的基础上添加染料。
(3)染料固体培养基 在染料培养基的基础上添加1.8%的琼脂。
(4)染料无机盐培养基 在染料培养基中加入0.5%的葡萄糖。
(5)牛肉膏蛋白胨培养基 牛肉膏 3.0g,蛋白胨10.0g,NaCl5.0g,琼脂16.0g(固体加入),H2O1000 m l。
1.2 方 法1.2.1 菌株的分离 取5.0g供试土样加入到含10 m l染料培养基(染料浓度50mg/L)的250m l锥形瓶中, 30℃、150r/m in富集振荡培养,7天后接种5m l培养液到相应染料培养基中(染料浓度成倍增大),培养4个周期使染料终浓度达到200mg/L。
以划线法接种第4次富集的培养液(染料浓度为200mg/L)于相应染料固体培养基上,30℃培养2天,分离得到单菌落。
将所有染料固体平板上的单菌落逐个分别接种到刚果红、孔雀绿、美蓝及活性艳蓝K N2R染料固体平板上(染料浓度均为200mg/L),同一单菌落在4种染料平板上的位置严格对应。
经培养获得1株在4种高浓度染料为唯一碳源的选择培养基平板上均能生长的细菌。
将其多次划线纯化后保存于牛肉膏蛋白胨固体斜面上。
1.2.2 菌株的鉴定 (1)形态及生理生化鉴定 参照文献[6]进行菌株形态观察;参照文献[728]进行菌株生理生化试验。
(2)16S r DNA序列系统分析 测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。
将XS MR的16S r DNA 在NCB I中与相关的16S r DNA序列进行同源性比较,在16S r DNA序列分析的基础上,采用MEG A程序构建系统发育树。
1.2.3 脱色能力及菌体干重的测定 接种菌株至牛肉膏蛋白胨液体培养基中,30℃、150r/m in振荡培养16h,细胞浓度约为3.8×108个/m l。
按5%的量接种菌悬液至含200m l染料无机盐培养基(染料浓度200mg/L)的500m l锥形瓶中,30℃、150r/m in振荡培养24h。
将培养液于5000r/m in离心15m in,上清液于染料的最大吸收波长下测定其吸光度A1,以不接菌悬液的染料无机盐培养基的吸光度A2为对照,计算脱色率。
脱色率(%)=(A2-A1)/A2×100%;沉淀用无菌生理盐水洗涤3次后,置于80℃烘箱中烘至恒重,所得干重减去吸附在菌体上的染料质量即被测菌体干重(g)。
1.2.4 最佳脱色反应条件试验 (1)温度对脱色率的影响 控制其他条件不变,考察温度对菌株脱色率的影响。
按5%的量接种菌悬液至染料无机盐培养基中,置于温度为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃,转速为150r/m in的摇床中培养脱色24h,测定并计算脱色率。
(2)pH对脱色率的影响 按5%的量将菌悬液分别接入pH为3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5的200m l 染料无机盐培养基(染料浓度200mg/L)中,在35℃、转速为150r/m in的摇床中培养脱色24h,测定并计算脱色率。
(3)接种量对脱色率的影响 分别按2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%的量接种菌悬液至200m l染料无机盐培养基(染料浓度200mg/L、pH为7.5)中,在35℃、转速为150r/m in的摇床中培养脱色24h,测定并计算脱色率。
(4)染料初始浓度对脱色率的影响 按4%的量将菌悬液分别接入染料初始浓度为50、100、150、200、250、300、400、500mg/L的200m l染料无机盐培养基(pH为7.5)中,在35℃、转速为150r/m in的摇床中培养脱色24h,测定并计算脱色率。
(5)培养时间对脱色率的影响 在最适脱色温度(35℃)、pH(7.5)、接种量(4%)及染料初始浓度下,定时取脱色液2份,其中1份5000r/m in离心15m in,上清液于相应染料最大吸收波长下测定吸光度值,计算菌株的脱色反应速率;另一份在波长660nm处测其OD 值,来衡量生物量。
1.2.5 脱色代谢产物分析 取最适脱色条件下经24h 脱色的脱色液100m l,5000r/m in离心15m in,取上清液进行紫外2可见光光谱扫描,计录吸收光谱的变化。
以不加菌液的染料无机盐培养基作为对照。
17中国生物工程杂志China B i otechnol ogy Vol .30No .620102 结果与分析2.1 脱色菌的分离 从印染废水污染的土壤中分离到1株能以高浓度刚果红、孔雀绿、美蓝及活性艳蓝4种结构不同的染料为唯一碳源的脱色细菌菌株,命名为X S MR 。
2.2 菌种鉴定2.2.1 形态特征及生理生化指标 X S MR 的细胞形态、菌落形态及部分生理生化特征见表1。
表1 X S M R 的形态特征及生理生化特征Table 1 The M orpholog i ca l,physi olog i ca l andb i oche m i ca l characters of stra i n X S M R鉴定特征X s m r形态特征菌落颜色黄色菌落形态较小,扁平,外缘缺刻,半透明,表面湿润细胞形态成对,短杆状鞭毛+革兰氏染色G -芽孢-生理生化特征石蕊牛奶试验-葡萄糖发酵产酸不产气甲基红实验-V.P 实验-吲哚实验-柠檬酸盐实验-淀粉水解+明胶液化实验+接触酶+氧化酶-需氧性好氧H 2S 气体产生-硝酸盐还原- Note:“+”and “2”indicated positive reacti on and negative reacti onres pectively2. 2.2 16Sr DNA 全序列系统学分析及同源性比较 X S MR 菌株的16Sr DNA 碱基长度为407bp 。
将X S MR 的16Sr DNA 测序结果与GenBank 中现有的菌种16Sr DNA 基因序列进行比对,发现菌株X S MR 与多株无色杆菌16Sr DNA 核苷酸序列的同源性高达99%以上,依据此结果,菌株X S MR 可归属于β变形菌纲伯克氏菌目产碱菌科无色杆菌属。
选择BLAST 比对结果中相似度最高的8条16Sr DNA ,利用MEG A4.1软件进行多重序列比对绘制进化树。