孔雀绿染料的微生物脱色研究
孔雀石绿的污染治理及样品中残留物的分离检测方法2
孔雀石绿的污染治理及样品中残留物的分离检测方法王邃、陈丹峰、李海龙（宁波市新型功能材料及制备科学国家重点实验室培育基地，宁波大学材料科学与化学工程学院浙江宁波 315211）摘要：孔雀石绿是一种三苯甲烷类化合物，作为一种重要的化工原料、碱性染料、杀真菌剂、生物染色剂得到了广泛的应用。
由于其毒性和可致癌性已经被禁止用于水产品生产和运输过程中。
本文综述了孔雀石绿污染物的治理和样品中孔雀石绿残留物的分离检测方法。
关键词：孔雀石绿，毒害物，处理，分离，测定The treatment of malachite green and the methods of separation anddeterminationCHEN Dan-feng、LI Hai-long、W ANG Mei-li、W ANG Sui* (State Key Laboratory Base of Novel Functional Materials and Preparation Science, Faculty of Materials Science and Chemical Engineering Ningbo University, Ningbo 315211)Abstract：Malachite green is a triphenylmathane compound which is widely used as an important chemical raw materials, basic dye, fungicide, colouringsubstance. Because of its toxicity and carcinogenicity ，it has been banned for aquatic production and transport. In this paper the treatment of malachite green and the methods of separation and determination are introduced.Keywords:malachite green, hazardous material, treatment, separation, determination作者简介：王邃（1971），男，副教授，从事富集分离高分子材料的合成及其在分析化学和环境领域的应用。
芽孢染色
细菌芽孢染色摘要：芽孢是芽孢杆菌和梭菌长到一定阶段后形成的一种具有很强抗逆性的休眠体结构。
对产生芽孢的菌体先后用孔雀绿染液和番红染液对菌体进行染色使菌体和芽孢的颜色各异，然后在油镜下对菌体的芽孢的形状、着生部位等特征进行观察。
关键词芽孢染色微生物制片镜检前言芽孢是芽孢杆菌和梭菌长到一定阶段后形成的一种具有很强抗逆性的休眠体结构，通常为圆形或椭圆形。
与正常的菌体相比，芽孢壁厚且通透性低，一般不宜着色，但芽孢一旦着色就很难脱色。
用着色能力强的孔雀绿染料在加热的条件下对芽孢进行着色，然后水洗脱掉菌体中的染料，再用着色能力较差、对比度大的复染剂对菌体进行染色后，菌体染上复染剂的颜色，而芽孢的颜色不变，这样就容易将两者区分开来。
通过对芽孢的染色观察，能区分细菌的类型，在细菌的分类及鉴定上具有一定的重要意义。
材料与方法1.1 材料1.1.1标准菌株枯草芽孢杆菌梭状芽孢杆菌1.1．2溶液和试剂蒸馏水香柏油 5%孔雀绿染液 0.5%番红水染液1.1.3仪器及其他用品载玻片试管夹光学显微镜胶头滴管酒精灯接种环1.2方法1.2.1压滴法观察细菌的运动性1）涂片1．将载玻片用自然水洗干净后，用纸吸除多余水分。
2．在载玻片上用记号笔圈出两个区域，并做好标记，用以区分左右。
3．用胶头滴管在每个区域内滴上半滴蒸馏水。
4．用接种环在酒精灯形成的无菌区域内分别在枯草芽孢杆菌营养琼脂斜面、梭状芽孢杆菌琼脂面上挑取适量的菌苔。
5．将沾有菌苔的接种环在滴有蒸馏水的区域内进行涂抹，使菌体悬浮在蒸馏水中，并记录下每个区域内所涂上的菌种来源。
2）加热干燥固定将涂好片的载玻片菌面朝上在酒精灯的火焰上方烤干，注意载玻片的温度要以不烫手为佳。
3）染色注意在加热的条件下用孔雀绿染液对菌体进行染色的过程中要随时补充染液，以防涂片干涸，对染色效果带来影响。
水洗的过程中，要使用较小的水流在没有涂菌的一面进行冲洗，以防菌体被水流冲走，使菌体能更好的更多的附着在载玻片上。
孔雀石绿降解方法的研究进展
养殖与饲料2017年第8期图1孔雀石绿、无色孔雀石绿及其脱甲基衍生物的结构式摘要孔雀石绿（C 23H 25N 2Cl ，Malachite Green ，MG ）是一种三苯甲烷类化工染料，因其外观颜色呈孔雀绿而得名，在动物体内，孔雀石绿通过生物转化成无色孔雀石绿蓄积于动物组织中。
自1933年起孔雀石绿开始作为驱虫剂、杀菌剂、防腐剂等在水产养殖中出现，而后因为具有价格低廉、效果显著等优点，被广泛应用于预防与治疗各类水产动物的水霉病和对原虫的控制，但随着研究的深入，孔雀石绿潜在的具有高毒素、高残留和致癌、致畸、致突变等毒副作用受到关注。
因此，对于如何清除水体中孔雀石绿残留以及改善水环境污染的研究显得极其重要，本文将阐述国内外对于孔雀石绿降解方法的研究进展。
关键词孔雀石绿；降解方法；研究进展孔雀石绿降解方法的研究进展赵桐桐1，2李文悦1，3李继丰1张建雄1周鑫1*1.河北省唐山市畜牧水产品质量监测中心，河北唐山063000；2.河北北方学院，河北张家口075000；3.天津师范大学生命科学学院，天津300387收稿日期：2017-05-04*通讯作者赵桐桐，女，1995年生。
1孔雀石绿的化学性质孔雀石绿（C 23H 25N 2Cl ，Malachite Green ，MG ）是一种三苯甲烷类化工染料，又称碱性绿、盐基块绿、孔雀绿，是一类具有较强杀菌能力的染料类药物[1]。
它是一分子苯甲醛与两分子二甲基苯胺在浓硫酸或氯化锌存在的条件下聚合而形成的深绿色晶体，因其外观颜色呈孔雀绿而得名。
分子式为C 23H 25N 2Cl ，相对分子质量为365，易溶于水和乙醇。
孔雀石绿多以草酸盐（malachite green oxalate ，C 23H 25N 2+HC 2O 4-）形式制备并在市面上出售，盐酸盐（malachite green chloride ，C 23H 25N 2+Cl -）比较少见。
图1列出了孔雀石绿、无色孔雀石绿及一系列脱甲基衍生物的结构式[2]。
染料废水脱色方法
染料废水脱色方法1 引言(Introduction)随着经济的快速发展，我国已成为染料生产大国，但随之而来产生了大量的染料废水.除了大量残留的染料外，染料废水中还含有其他有毒有害成分，如重金属离子.因此，染料废水具有成分复杂、色度、浓度高、难生物降解、水量水质变化大等特点，成为较难处理的工业废水之一。
孔雀绿是常见的三苯基甲烷类染料之一，常作为丝织品、毛织品、棉布等的染色剂.虽然孔雀绿具有高毒性、致突变性和较强的生物毒性等特性，但因其成本低廉、杀菌效果显著，因此，目前仍被广泛应用在纺织和水产养殖业.重金属通常应用于纺织染料工业的不同生产过程中，因此，染料废水中存在各种不同浓度的重金属，其中，Cr(Ⅵ)的含量最高，而Cu(Ⅱ)次之.研究发现，极少量的重金属离子就能产生明显的中毒反应，且通过食物链被较高级的生物成倍地富集在体内，且会使生物体内的酶、蛋白质等失活，同时它无法被微生物降解，最终累积在器官中，严重损害着人体健康和生态环境。
染料废水中残留染料与重金属离子经常并存，这种复合污染具有更高的生物、细胞毒性。
染料脱色一般分为物理化学法和生物法，物化法使用方便、见效快，但成本高、二次污染严重;生物法运行费用低，处理效果显著且不会造成二次污染，是环境友好的处理方法，因而受到广泛关注。
但重金属通过影响微生物体内酶的生成或酶的活性抑制微生物对染料的降解。
因此，如何提高染料与重金属构成的复合污染中染料的生物降解效率成为该类废水处理的难点之一.EDTA(乙二胺四乙酸二钠)是一种常见的鳌合剂，生成的络合物在中性或碱性条件下稳定系数非常大.在一般情况下，这些螯合物的配合比都是1:1(鞠峰等, 2011).EDTA与配位离子形成环状结构，金属离子取代配位原子上的氢而进入鳌合环中，使金属离子钝化，降低其毒害作用。
但目前关于采用环境中广泛存在的螯合剂减少与染料共存的重金属离子的毒性，提高染料降解效率的研究少有报道.根据之前的研究发现，某些微生物可能会将Cr(Ⅵ)还原成Cr(Ⅲ)，因此，本研究拟采用EDTA降低Cr(Ⅵ)的毒性，从而提高Cr(Ⅵ)共存时微生物降解孔雀绿的效率.采用筛选出的高效好氧菌Burkholderia cepacia C09G降解孔雀绿，研究EDTA对重金属共存时降解孔雀绿的影响，同时优化EDTA鳌合Cr(Ⅵ)的最佳浓度.通过此研究以提高在重金属共存时染料的去除效率，为复杂废水的治理奠定一定的理论基础.2 材料与方法(Materials and methods)2.1 试剂与仪器试剂：葡萄糖、KH2PO4、Na2HPO4·2H2O、MgSO4、FeCl3·6H2O、KNO3、孔雀绿(MG)、K2CrO7、EDTA等均为分析纯.仪器：SKY-2102型立式双层恒温培养摇床、SPX-2508-Z型生化培养箱、722N 型可见光光度计、PHS-3C型精密pH计、AA-240型原子吸收光谱仪.2.2 试验菌种与培养基本试验所用菌种为Burkholderia cepacia C09G(B. Cepacia C09G).LB培养基：牛肉膏5 g·L-1，蛋白胨10 g·L-1，NaCl 10 g·L-1，分装在100 mL的三角烧瓶中，每瓶装量为30.0 mL，121 ℃灭菌15 min.降解培养基：葡萄糖6.0g·L-1，KH2PO4 1.8 g·L-1，Na2HPO4·12H2O 3.5 g·L-1，FeCl3·6H2O 0.01 g·L-1，MgSO4 0.1 g·L-1，KNO3 3.5 g·L-1，调节至pH 6.0，分装于250 mL 的三角烧瓶中，121 ℃灭菌15 min.2.3 试验方法2.3.1 菌液的制备将菌株B. Cepacia C09G接种到灭菌后的LB培养基中，于30 ℃、150 r·min-1的恒温振荡培养箱中培养至对数期，并将所得菌液转移至50.0 mL离心管中，7000 r·min-1离心10 min，弃除上清液，用无菌水稀释成菌悬液，4 ℃保存备用.2.3.2 MG和Cr(Ⅵ)去除试验将已算好体积的药品加入降解培养基中，每支玻璃离心管(无菌)中加入15.0 mL的降解培养液，再加入菌液(初始OD600=0.7，体积比6%)，塞上棉花塞，放入摇床(150 r·min-1，30 ℃)培养0、12、24、36、48、60 h后分别测定OD600、MG和Cr(Ⅵ)浓度.上述每个试验均做3个平行，结果取其平均值，并计算标准偏差.2.4 生物量、MG及Cr(Ⅵ)的测定从恒温摇床中取出各时段的降解培养基，在最大吸收波长600 nm处用可见分光光度计测其吸光度，以波长600 nm处的光密度OD600表示细菌生长量.取上清液，孔雀绿(MG)采用分光光度计测定619 nm处最大吸收峰的吸光度值，以A619表示;利用原子吸收光谱仪测定溶液剩余Cr(Ⅵ)浓度.去除率R计算公式如下：(1)式中，C0表示初始时MG或Cr(Ⅵ)的浓度(mg·L-1);Ct表示t时MG或Cr(Ⅵ)的浓度(mg·L-1).2.5 表征扫描电子显微镜(SEM)观察：采用JSM-7500型扫描电子显微镜观察样品的表面形貌和微观形态;X射线能量色散谱(EDS)分析：利用与SEM联机的X射线能量散射仪分析样品表面的元素种类和含量;傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析：采用Thermo Nicolet 5700红外光谱仪，获取试样的FTIR谱图，溴化钾压片，扫描范围为4000~400 cm-1;X射线光电子能谱(XPS)分析：采用VG ESCALAB 250型X 射线光电子能谱仪对吸附孔雀绿和Cr(Ⅵ)后的Burkholderia cepacia C09G进行分析.3 结果与讨论(Results and discussion)3.1 不同条件对孔雀绿降解过程的影响所有实验均用Burkholderia cepacia C09G降解0.1 mmol·L-1孔雀绿，仅加入孔雀绿的为空白实验，其他实验再分别加入0.5 mmol·L-1 Cr(Ⅵ)、0.5 mmol·L-1 EDTA，以及同时加入0.5 mmol·L-1 Cr(Ⅵ)和0.5 mmol·L-1 EDTA，放入摇床中好氧培养0、12、24、36、48、60 h后取出测定OD600、A619、Cr 浓度.3.1.1 OD600如图 1所示，在空白实验中(没有重金属Cr(Ⅵ)或者EDTA存在的条件下)，即仅加入0.1 mmol·L-1的孔雀绿(MG)时，B. Cepacia C09G在前36 h快速生长，OD600接近了0.7，而后因为MG基本降解完，缺乏营养物质生物量增长缓慢，60 h后最终OD600值为0.78;仅加入0.5 mmol·L-1 Cr(Ⅵ)，对微生物的生长有很强的抑制作用，生物量很低，仅为0.15;仅加入0.5 mmol·L-1 EDTA，毒性虽然比Cr(Ⅵ)更小，但仍有一定的抑制作用，60 h时OD600为0.31.据报道，EDTA和EDTA-Metal对土壤微生物都是有毒的(Grcman et al., 2001).当同时添了EDTA和Cr(Ⅵ)时，OD600为0.42，大于单独加入Cr(Ⅵ)或者EDTA时，说明其生物毒性比单独加入Cr(Ⅵ)或EDTA有所降低，因此，可以推测EDTA可以有效降低Cr(Ⅵ)的毒性.图 1不同条件下孔雀绿(MG)的OD600值3.1.2 孔雀绿(MG)去除率图 2a为不同条件对孔雀绿的降解影响，在仅加入0.1 mmol·L-1 MG的情况下，MG在24 h的去除率达到96.2%;只添加0.5 mmol·L-1 Cr(Ⅵ)，60 h时MG的去除率均为6.7%，单独添加0.5 mmol·L-1 EDTA时，60 h时MG的去除率为48.4%，说明Cr(Ⅵ)和EDTA均会抑制B. Cepacia C09G对孔雀绿的降解.同时添加EDTA和Cr(Ⅵ)时，60 h MG的去除率上升到18.8%，相对于单独加Cr(Ⅵ)的降解率有所提高，可以看出，EDTA确实可以有效地降低Cr(Ⅵ)的抑制作用，从而提高对孔雀绿的降解效率.也有研究证实，加入EDTA可以降低5 μmol·L-1 Cd、Cu和Zn对细菌Escherichia coli的毒性(Campbell et al., 2000).图 2不同条件下孔雀绿降解率(a)和Cr去除率(b)3.1.3 Cr去除率图 2b为离心后的降解培养基中总Cr浓度，可能是由于EDTA可以有效螯合Cr，因此，减少了B. Cepacia C09G吸附Cr的效率，去除率从25.7%降低到15.2%.3.2 0.5 mmol·L-1 EDTA螯合的最佳Cr浓度将菌株C09G加入初始Cr(Ⅵ)浓度分别为0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mmol·L-1，EDTA浓度为0.5 mmol·L-1，MG浓度为0.1 mmol·L-1的降解培养基中，放入摇床中好氧培养0、12、24、36、48、60 h后取出测定OD600、A619、Cr的浓度.3.2.1 OD600如图 3a所示，随着加入Cr(Ⅵ)浓度的升高，生物量OD600先升高后降低，加入Cr(Ⅵ)浓度为0.7 mmol·L-1时达到最高.在加入的Cr(Ⅵ)浓度分别为0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mmol·L-1时，60 h时OD600分别为0.45、0.55、0.72、0.62、0.43，微生物生长良好，因此，EDTA可适度地降低Cr的毒性.但总的来说，Cr单独存在，或者与EDTA形成螯合物，对微生物都是有毒的，因而生物量都偏低.图 3不同初始Cr(Ⅵ)浓度下OD600值(a)、孔雀绿降解率(b)和Cr去除率(c)3.2.2 孔雀绿(MG)去除率由图 3b可知，除Cr(Ⅵ)浓度为0.7、0.8 mmol·L-1外，其余Cr(Ⅵ)浓度条件下的MG降解并不理想，均小于20%;而Cr(Ⅵ)初始浓度为0.7 mmol·L-1时，MG的去除率为35.3%，当浓度增加到0.8 mmol·L-1时，MG的降解率下降到了30.7%.因此，确定0.5 mmol·L-1 EDTA存在下，螯合的最佳Cr(Ⅵ)浓度为0.7 mmol·L-1. EDTA和重金属的螯合比例一般为1:1(鞠峰等, 2011)，Cr(Ⅵ)以阴离子存在，不能和EDTA螯合，但根据报道，Cr(Ⅵ)会被微生物还原成Cr(Ⅲ)(甘莉等, 2014).因此推测，部分Cr(Ⅵ)会被微生物还原成Cr(Ⅲ)，被还原的Cr(Ⅲ)跟EDTA螯合，减少了毒性.EDTA或者Cr(Ⅵ)过量，MG去除率都会降低.3.2.3 Cr去除率如图 3c所示，Cr(Ⅵ)初始浓度分别为0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mmol·L-1时，总Cr的去除率分别为15.8%、21.6%、24.6%、21.8%、20.9%.Cr去除率随着加入的Cr(Ⅵ)浓度增加而增加，当Cr(Ⅵ)为0.7 mmol·L-1时Cr去除率最高，之后开始下降，但降低幅度很小.可能是因为高浓度的Cr传质效果更好，因而更易于被微生物富集.相对于无EDTA存在情况下，B. Cepacia C09G对Cr吸附率略有下降，但在最佳的螯合浓度下，由于减少了Cr的毒性，增加了生物量，使得吸附率有所提高.但总的来说，在EDTA存在条件下，B. Cepacia C09G对Cr 吸附能力均较低.3.3 降解过程的表征3.3.1 XPS为了检测Cr(Ⅵ)价态变化，采用X射线光电子能谱(XPS)分析吸附孔雀绿和Cr(Ⅵ)后的Burkholderia cepacia C09G，图 4是菌体表面Cr的2p轨道核心区域的XPS光谱图及其拟合曲线.可以看出，Cr2p1/2的结合能在584.0 eV处，而Cr2p3/2的结合能在577.4 eV处，可知两个能值与Cr(Ⅲ)的结合能相对应，这说明在菌体表面应该存在Cr(Ⅲ)，而吸附前，培养基中只有Cr(Ⅵ)，因此，推测培养基中Cr(Ⅵ)在Burkholderia cepacia C09G的作用下被吸附到其表面后，利用菌体内的还原酶，Cr(Ⅵ)被还原为Cr(Ⅲ).其他文献也有类似报道，细菌可利用细胞NADH作为还原剂，在好氧或厌氧状态下，将高毒性的Cr(Ⅵ)直接还原成低毒的Cr(Ⅲ)(Lira-Silva et al., 2011)，如利用Burkholderia vietnamiensis C09V同时去除结晶紫和Cr(Ⅵ)时，该菌在降解结晶紫的同时将Cr(Ⅵ)还原成Cr(Ⅲ)(甘莉等, 2014).图 4吸附后Burkholderia cepacia C09G的Cr2p能谱图3.3.2 SEM由图 5a可知，当溶液中只有孔雀绿存在时，B. Cepacia C09G细胞形态几乎没有破损，细胞表面完整圆滑饱满、生长良好.当孔雀绿溶液中加入0.5 mmol·L-1 EDTA时，细胞形态有些略微的损伤(图 5b).当加入Cr(Ⅵ)后，微生物细胞表面严重受损，细胞表面凹凸不平且变得干瘪(图 5c).如图 5d所示，同时加入0.5 mmol·L-1 EDTA和0.5 mmol·L-1 Cr(Ⅵ)后，与只加EDTA相比，对细胞形态影响相对较小，与不加EDTA与Cr(Ⅵ)的细胞形态相比虽然能维持较完整的细胞形态，还是有略微损伤.从图 5中可以看出，EDTA与Cr(Ⅵ)都能破坏细胞的结构，从而降低微生物的活性，同时加入EDTA和Cr(Ⅵ)后，EDTA减少了Cr(Ⅵ)对B. Cepacia C09G的毒性.图 5降解后Burkholderia cepacia的SEM图(10000×)(a.0.1 mmol·L-1 MG, b. 0.1 mmol·L-1 MG+0.5 mmol·L-1 EDTA, c. 0.1 mmol·L-1 MG+0.5 mmol·L-1 Cr(Ⅵ), d.0.1 mmol·L-1 MG+0.5 mmol·L-1 EDTA+0.5 mmol·L-1 Cr(Ⅵ))3.3.3 EDS通过EDS确定菌株B. Cepacia C09G生物吸附MG、Cr(Ⅵ)或者EDTA后菌株局部所含元素，从图 6中可以看出，图中均含有C、K、O、Na、P，这些元素主要是来自于微生物自身;此外，图 6b和6c中还含有Cr，这表明菌株有效地吸附了Cr，来源于溶液中加入的K2Cr2O7.图 6b和6c中分别在0.48、5.40和5.96 keV 处出现峰，显示存在Cr元素，这就证明了C09G菌在去除孔雀绿的同时也可以吸附Cr.而且在图 6c与6b的对比中可以看出，当加入了EDTA后，Cr的含量明显减少，从0.59%降低到0.37%，说明EDTA相比于菌株对Cr的亲和力更强.图 6降解后Burkholderia cepacia的EDS图(a. 0.1 mmol·L-1 MG, b. 0.1 mmol·L-1 MG+0.5 mmol·L-1Cr(Ⅵ), c.0.1 mmol·L-1 MG+0.5 mmol·L-1 EDTA+0.5mmol·L-1 Cr(Ⅵ))3.3.4 FTIR图 7为菌株B. Cepacia C09G吸附孔雀绿及孔雀绿和Cr(Ⅵ)后的FTIR光谱图.由图 7可知，2939~2927 cm-1处的峰是—CH、—CH2及—CH3的不对称振动峰，在1655 cm-1和1546 cm-1处出现由氨基酸I的—NH2与氨基酸II的—COOH 形成的—NH/CO的伸缩振动吸收峰，1408~1405 cm-1处分别为孔雀绿及降解产物芳环上的C=C的伸缩振动峰和O—H的弯曲振动峰.图 7b相比于图 7a，在2452 cm-1和845 cm-1处的峰消失，1070 cm-1处峰的产生是由于氨基酸的—NH转变为C=N共轭键.这说明菌株C09G的去除过程主要是—OH、—COOH、—NH2、—NH/CO 等官能团与Cr相互作用(Nandi et al., 2009).图 7菌株B. Cepacia C09G吸附孔雀绿(a)及孔雀绿和Cr(Ⅵ) (b)后的FTIR光谱图4 结论(Conclusions)1) 0.1 mmol·L-1孔雀绿单独存在条件下，24 h的生物降解率达到96.2%;然而，在0.5 mmol·L-1 Cr(Ⅵ)共存时，60 h的降解率仅为6.7%;当加入0.5 mmol·L-1 EDTA螯合剂后，60 h时孔雀绿的降解率提高到18.8%.说明Cr(Ⅵ)、EDTA都会抑制孔雀绿的降解，加入0.5 mmol·L-1 EDTA螯合Cr后，可显著降低Cr的毒性.具体联系污水宝或参见更多相关技术文档。
绿脓假单胞菌对三苯甲烷染料的脱色机理初探
［ 词】 关键 绿脓假单 胞菌 ；三苯 甲烷染料 ；脱色机理
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微生物实验八：芽孢的染
芽孢示意图
三、实验材料
（一）菌种
枯草芽孢杆菌 大肠杆菌 自接菌种（可疑细菌） （二）药物 生理盐水 5%孔雀绿染液 0.5%的蕃红水溶液 绘图墨汁（上 海墨水厂 沪光绘图墨水） 甲基紫水溶液、纯甲醇 （三）其它物品 载玻片 盖玻片 无菌水 木夹子
四、实验内容
芽孢染色
将培养24小时左右的枯草芽孢杆菌涂片、干燥、固定。 滴加3—5滴孔雀绿染液于已固定的涂片上。用木夹夹住 载玻片在火焰上（微火）加热，使染液冒蒸汽但勿沸腾， 切忌使染液蒸干，及时添加少许染液。加热时间从染液 冒蒸汽时开始计算约5分钟。倾去染液，待玻片冷却后 水洗至孔雀绿不再褪色为止。用番红水溶液复染2-5分 钟，水洗。待干燥后，置油镜观察，芽孢呈绿色，菌体 呈红色。
芽孢的染色
一、目的要求
1、学习细菌的特殊染色方法——芽孢染色。
2、观察细菌的染色特征 。
二、实验原理
1、芽孢染色 芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲合力不 同的原理，用不同染料进行着色，使芽孢和菌体呈不同 的颜色而便于区别。芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均 较困难，因此，当先用一弱碱性染料，如孔雀绿在加热 条件下进行染色时，此染料不仅可以进入菌体，而且也 可以进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入 芽孢的染料则难以透出，若再用复染液（如番红液）处 理，则菌体和芽孢
实验四.细菌芽孢染色
实验四.细菌芽孢染色一. 目的要求：目的：掌握细菌芽孢染色方法内容：１．学习并掌握芽孢染色法２．初步了解芽孢杆菌的形态特征二. 基本原理：芽孢壁厚，透性低，着色脱色较困难。
因此先用着色力较强的孔雀绿，在加热的条件下染色，使染料不仅进入菌体也可以进入芽孢内，进入菌体内的染料经水洗脱色，而芽孢一经着色难以被水洗脱，当用对比度大的复染剂（如沙黄、番红、碱性复红）染色后，芽孢仍保留初染色剂的颜色，此时菌体被染成红色，芽孢呈绿色。
三. 器材1.菌种：培养了16-20小时左右的枯草杆菌（37℃）2.染色剂：5%的孔雀绿水溶液.0.5%番红水溶液石炭酸复红染液0.05%碱性复红蒸馏水3.仪器或其他用品：小试管.滴管.烧杯.试管架.载玻片.木夹子.显微镜等二甲苯.香柏油四. 操作步骤：一）方法1：1.取37℃培养了18-24小时的枯草杆菌作涂片，并干燥固定。
2.于载玻片上滴入3-5滴5%孔雀绿水溶液3.用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，自载玻片上出现蒸汽时，开始计时约5min ,加热过程中切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料4.倾去染液，待玻片冷却后，用自来水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。
5.用0.5%的番红溶液（或0.5%沙黄水溶液或0.05%碱性复红）复染2分钟，水洗.6.制片干燥后用油镜观察。
芽孢呈绿色，菌体呈红色。
二）方法2：1.加1-2滴自来水于小试管中，用接种环从斜面上挑取2-3环培养16—20小时的枯草杆菌于试管中，充分混匀打散，制成弄的菌悬液。
2.加5%的孔雀绿水溶液2-3滴于小试管中，用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。
3.将此试管浸于沸水浴中，加热20-30min .4.用接种环从试管底部挑取数环欲洁净的载玻片上，并涂布均匀，将玻片通过微火3次固定。
5.水洗至流出的水中无孔雀绿颜色为止。
6.加复染液染2-3分钟，水洗。
7.干燥后用油镜观察，芽孢绿色，菌体红色。
五.实验报告：1.绘图：枯草杆菌的芽孢形态，芽孢的着色位置。
微生物实验4 芽孢观察
微生物实验报告细菌的芽孢染色观察实验刘欣怡201100140057生命科学基地班组别：周一下午三组同组者：曹平平，周楠，刘艺，刘希伟实验时间：2012年10月22号一、实验目的1、学习并掌握芽孢染色法2、了解芽孢杆菌的形态特征3、巩固显微镜操作技术及无菌操作技术二、实验器材1、菌种枯草芽胞杆菌，梭状芽胞杆菌。
2、溶液和试剂5%孔雀绿水溶液，0.5%番红水溶液。
3、仪器和其他用品酒精灯，载玻片，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），显微镜、吸水纸、擦镜纸，接种环，载玻片夹子，无菌水等。
三、实验原理1、芽孢又叫内生孢子(endosopre)，是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体，通常呈圆形或椭圆形。
细菌能否形成芽孢以及芽孢的形状、芽孢在芽孢囊内的位置、芽孢囊是否膨大等特征是鉴定细菌的依据之一。
2、芽孢菌体的特点：a.芽孢的含水率低，38%～40%。
b.芽孢壁厚而致密，分三层：外层是芽孢外壳，为蛋白质性质。
中层为皮层，由肽聚糖构成，含大量2，6-吡啶二羧酸。
内层为孢子壁，由肽聚糖构成，包围芽孢细胞质和核质。
芽孢萌发后孢子壁变为营养细胞的细胞壁。
c.芽孢中的2，6-吡啶二羧酸（简称DPA）含量高，为芽孢干重的5%～15%。
吡啶二羧酸以钙盐的形式存在，钙含量高。
在营养细胞和不产芽孢的细菌体内未发现2，6-吡啶二羧酸。
芽孢形成过程中，2，6-吡啶二羧酸随即合成，芽孢就具有耐热性，芽孢萌发形成营养细胞时，2，6-吡啶二羧酸就消失，耐热性就丧失。
d.含有耐热性酶。
芽孢由于有以上四个特点，使得芽孢对不良环境如高温、低温、干燥、光线和化学药物有很强的抵抗力。
细菌的营养细胞在70～80℃时10分钟就死亡，而芽孢在120～140℃还能生存几小时，营养细胞在5%苯酚溶液中很快就死亡，芽孢却能存活15天，芽孢的大多数酶处于不活动状态，代谢活力极低，所以，芽孢是抵抗外界不良环境的休眠体。
3、芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理，用不同染料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。
实验五 细菌芽孢染色
实验五——细菌芽孢染色山东大学生命科学学院09级四班张行润200900140177 摘要细菌的芽孢具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽孢不着色（芽孢呈无色透明状）。
芽孢染色法就是根据芽孢既难以染色而一旦染上色后又难以脱色这一特点而设计的。
所有的芽孢染色法都基于一个原则：除了用着色强的染料外，还须要加热，以促进芽孢着色，再使菌体脱色，而芽孢上的染料则难以渗出，故仍保留原有的颜色，然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽孢呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽孢，便于观察。
关键词芽孢（gemma of a fungus）芽孢染色法（Spore staining）复染（counterstain）前言细菌的芽孢的某些细菌的特殊结构。
芽孢是某些细菌生长到一定阶段在体内形成的一个圆形或椭圆形的休眠体，它对不良环境具有很强的抗性。
在合适条件下，可吸水萌发，重新形成一个新的菌体。
芽孢的大小、形状及其在菌体内的位置是鉴定细菌的重要依据。
在一般实验室中通常用芽孢染色法来观察其形态。
此外，由于芽孢具有很强的抗性，因此在生产实践中都以是否有杀死抗性最强的芽孢来评定高温灭菌及某些化学杀菌剂的效果。
一、实验目的1.学习并掌握芽孢染色法2.了解芽孢杆菌的形态特征3.巩固显微镜操作技术及无菌操作技术二、实验原理芽孢是芽孢杆菌属和梭菌属细菌生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，液被称为内生孢子，通常呈圆形或椭圆形。
细菌能否形成芽孢及芽孢的形状，着生位置、芽孢囊是否膨大等特征都是鉴定细菌的重要指标。
与正常细胞或菌体相比，芽孢壁厚、透性低而不易着色，但是芽孢一旦着色就很难被脱色。
利用这一特点，首先用着色能力较强的染料，如孔雀绿（malachite green）或碱性品红（basicfuchsin）在加热条件下进行染色时，此染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出。
Trametes_hirsuta_漆酶的分离纯化及其对活性染料脱色研究
山东农业大学学报(自然科学版),2024,55(1):076-083Journal of Shandong Agricultural University ( Natural Science Edition )VOL.55 NO.1 2024 doi:10.3969/j.issn.1000-2324.2024.01.011Trametes hirsuta漆酶的分离纯化及其对活性染料脱色研究刘飞，李治宏，张仕豪，刘璇，郑晓晴，焦若若，朱友双*济宁医学院生物科学学院，山东日照 276800摘要：漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，在生物检测、工业染料脱色、有机农药降解、纸浆漂白及食品饮料等领域具有广泛的应用价值。
本研究使用实验室自主筛选鉴定的漆酶高产菌株粗毛栓菌（Trametes hirsuta），液态发酵后，培养液经硫酸铵分级沉淀、DEAE Sepharose FF 阴离子交换层析分离纯化，酶活总得率57.2%，纯化倍数6.0倍，比活力为758.5 U/mg，漆酶的分子量约为50 kDa。
利用粗毛栓菌粗酶液分别对结晶紫、溴酚蓝、孔雀石绿、詹姆斯绿B进行脱色，同时研究了染料浓度、脱色温度、pH和NaCl对溴酚蓝和孔雀石绿脱色率的影响。
结果表明，溴酚蓝和孔雀石绿浓度分别为40 mg/L 和50 mg/L时脱色率较高；在脱色温度为50 ℃时，漆酶对溴酚蓝和孔雀石绿的脱色率较高，最高脱色率分别为68.51%和83.06%；溴酚蓝在pH 3.5时脱色率最高达到72.61%，而孔雀石绿的脱色率在pH 4.5时最高达到83.49%；NaCl对Trametes hirsuta漆酶催化染料脱色有一定的抑制作用。
本研究表明Trametes hirsuta漆酶在染料脱色中具有较大的应用前景，在工业废水的处理中具有良好的应用潜力。
关键词：粗毛栓菌；漆酶；分离纯化；染料脱色中图法分类号：Q939.5文献标识码： A文章编号：1000-2324（2024）01-0076-08 Isolation and Purification of Laccase from Trametes hirsuta and Its Application in Reactive Dye DecolorizationLIU Fei, LI Zhi-hong, ZHANG Shi-hao, LIU Xuan, ZHENG Xiao-qing,JIAO Ruo-ruo, ZHU You-shuang*School of Biological Science/Jining Medical University, Rizhao 276800, ChinaAbstract: Laccase is a copper-containing polyphenol oxidase with a wide range of application, including bio-detection, industrial dye decolorization, organic pesticide degradation, pulp bleaching, and the food and beverage industries. We utilized a high-yield laccase strain of Tramete hirsuta identified in the laboratory. The laccase was separated and purified through ammonium sulfate precipitation and DEAE Sepharose FF anion exchange chromatography. The enzyme activity yield was 57.2%, with a purification fold of 6.0 and a specific activity of 758.5 U/mg. The molecular weight of laccase was about 50 kDa. The crude enzyme solution from Tramete hirsuta was used to decolorize crystal violet, bromophenol blue, malachite green, and Janus green B. The effects of dye concentration, temperature, pH and NaCl on the decolorization rate of bromophenol blue and malachite green were also investigated. The decolorization rates were higher when the dye concentration was 40 mg/L for bromophenol blue and 50 mg/L for malachite green. The decolorization rates of laccase on bromophenol blue and malachite green were 68.51% and 83.06%, respectively, at the temperature of 50℃. Bromophenol blue exhibited the highest decolorization rate of 72.61% at pH 3.5, while malachite green showed the highest decolorization rate of 83.49% at pH 4.5. NaCl had an inhibitory effect on the dye decolorization catalyzed by Trametes hirsuta laccase. Our study showed Trametes hirsuta laccase has a great application potential in dye decolorization and industrial wastewater treatment.Keywords: Trametes hirsuta; laccase; isolation and purification; dye decolorization漆酶是一种古老的含铜多酚氧化还原酶，最早发现于日本漆树中(Rhusvernicifera)[1]，属于铜蓝氧化酶。
细菌的芽孢染色
若涂片中观察到的只是大量游离芽孢， 若涂片中观察到的只是大量游离芽孢 ， 很少看到芽孢囊及营养细胞， 很少看到芽孢囊及营养细胞，你认为这是什么 原因? 原因
（五）注意事项
• 1、 供芽孢染色用的菌种应控 、 制菌龄， 制菌龄，使大部加热过程要及时补充 、 染液，切勿让涂片干涸。 染液，切勿让涂片干涸。
（六）实验作业
绘出表示芽孢杆菌的形态特征， 绘出表示芽孢杆菌的形态特征，注 芽孢杆菌的形态特征 意芽孢的形状、 意芽孢的形状、着生位置及芽孢囊的形 态特征。 态特征。
中央芽孢偏端芽孢游离芽孢末端芽孢芽孢壁厚透性低着色和脱色均较困难当用弱碱性染料孔雀绿在加热的情况下进行染色时使染料不仅进入菌体也可进入芽孢内进入菌体的染料经水洗后被脱色当用对比度大的复染色剂蕃红液染色后芽孢仍保留初染剂的颜色是芽孢和菌体更易区分
细菌的芽孢染色
（一）实验目的
1、继续学习微生物标本的制作方法； 继续学习微生物标本的制作方法； 2、掌握芽孢染色的基本原理及方法; 掌握芽孢染色的基本原理及方法;
（三）实验器材
• 1、菌种： 、菌种： • 2、 染色液和试剂 ： 5％ 孔雀绿水溶液 、 、 染色液和试剂： ％ 孔雀绿水溶液、 0.5％蕃红溶液等； ％蕃红溶液等； • 3、 器材 ： 试管夹 、 酒精灯 、 接种针 、 载 、 器材： 试管夹、 酒精灯、 接种针、 玻片、显微镜、擦镜纸等。 玻片、显微镜、擦镜纸等。
又称内生孢子是某些细菌 革兰氏染色阳性杆菌） （ 革兰氏染色阳性杆菌 ） 生长到 一定时间（ 对数期后期） 一定时间 （ 对数期后期 ） ， 在细 胞内形成一个圆形、 胞内形成一个圆形 、 椭圆形或圆 柱形的结构。 柱形的结构。
芽孢有的长在中央或近中央， 芽孢有的长在中央或近中央 ， 圆形或 椭圆形，芽孢的大小，位置， 椭圆形 ， 芽孢的大小 ， 位置 ， 在分类鉴定 上有一定的意义，它仅仅是芽孢细菌生活 上有一定的意义， 史的一个环节， 史的一个环节 ， 它还是检验培养基灭菌彻 底不彻底的依据。 底不彻底的依据。
环境中孔雀石绿的研究进展
环境中孔雀石绿的研究进展陶雁斌;杨绍贵【摘要】孔雀石绿(Malachite green,MG)因其对水产品疾病防治的高效性和低廉的价格而被广泛用于水产养殖,但也带来了水产品食用的健康风险,并且污染水体环境.本文综述了孔雀石绿在不同环境介质(水体、水产品和底泥)中的检测方法和前处理技术研究进展,自然降解情况以及降解孔雀石绿的方法研究现状,旨在对环境中孔雀石绿的残留检测新方法的建立与选择以及孔雀石绿的污染治理提供参考.【期刊名称】《四川环境》【年(卷),期】2015(034)005【总页数】7页(P123-129)【关键词】孔雀石绿;自然降解;检测方法;降解方法【作者】陶雁斌;杨绍贵【作者单位】污染控制与资源化研究国家重点实验室,南京大学环境学院,南京210023;污染控制与资源化研究国家重点实验室,南京大学环境学院,南京210023【正文语种】中文【中图分类】X8351 引言孔雀石绿 (Malachite green，MG)是一种三苯甲烷类染料和药物，母体及其代谢产物无色孔雀石绿 (Leucomalachite green，LMG)有高毒性、高残留的性质，可产生致畸、致癌、致突变等副作用［1］，已被包括中国在内的大部分国家列为禁药。
孔雀石绿对公众暴露途径主要是通过食用含有孔雀石绿的鱼、虾等水产品，可怕的是低浓度水平下，孔雀石绿就对有孕生命有敏感毒害性［2］。
由于没有更为廉价而有效的替代药物，孔雀石绿仍被频繁使用，在环境中被频频检出。
从2005年英国《星期日泰晤士报》报道了在英国一家知名超市出售的鲑鱼体内发现孔雀石绿后，我国加大了对孔雀石绿污染的重视，之后分别在全国多个省市的水产养殖场、鱼药商店和某些鱼类食品中检测到孔雀石绿，严重威胁生态环境和人类健康。
如何有效快速地检测孔雀石绿在环境中的污染水平?孔雀石绿在自然条件下能否降解?目前已有哪些高效而无害的降解方法?本文对这几个方面进行了一个总结，最后提出了孔雀石绿检测方法和降解方法的研究方向和趋势。
微生物分离实验报告
微生物分离实验报告实验仪器及材料土样：18号土样试剂及培养基培养基：果胶酶筛选培养基；几丁质酶真菌筛选培养基；果胶酶划线分离培养基；几丁质酶划线培养基；细菌半固体培养基；淀粉培养基；葡萄糖酵解培养基；乳糖酵解培养基；蛋白胨水培养基a)试剂：草酸铵结晶紫染液、番红复染液等各种染料以及卢戈氏碘液、95% 乙醇、5%孔雀绿水溶液、无菌水等仪器锥形瓶（500mL×2；300mL×2；100mL×3）、培养皿（20套）、试管（20支）、移液管（3支）、烧杯、玻璃棒、载玻片、盖玻片、光学显微镜、涂布棒、U型管、德汉氏小管、酒精灯、漏斗、接种环、滤纸、棉塞、牛皮纸、无菌操作台、灭菌锅、纱布等细菌的筛选，分离纯化及鉴定细菌的筛选土样处理配制生理盐水：在烧杯中配置200ml0.85％的生理盐水，用移液管各移取9ml于五支洁净试管，再移取90ml配置好的生理盐水于三角烧瓶，并放入少许玻璃珠，包好灭菌；加土样：冷却后准确称取10g土样放入盛有90ml无菌生理盐水并带有少许玻璃珠的三角烧瓶中，充分震荡摇匀，然后放在30℃恒温培养箱中静置15min。
果胶酶菌种筛选梯度稀释：用一支无菌吸管吸取1ml土壤悬液加入到盛有9ml无菌水的试管中充分混匀，此为10-1稀释液，以此类推制成10-2、10-3两种稀释度的土壤溶液（如下图）；涂布：配制果胶酶筛选培养基，110度灭菌20-30分钟，冷却后倒平板在培养皿盖周边用记号笔做好标记，分别写上10-1、10-3两种稀释度字样，每稀释度标记三皿，然后用无菌吸管分别由10-3、10-1两管土壤稀释液中吸取适量对好放入已写好稀释度的平板中央位置，每皿准确放入0.2ml，用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，其方法是将菌液先沿一条直线轻轻地来回推动，使之均匀分布，然后改变方向90度沿另一垂直线来回推动，平板内边缘处改变方向用涂布棒再涂布几次；培养：将平板倒置于30℃恒温箱中培养1-2天；果胶酶透明圈平板检测：取10-1涂布平皿，用0.5％的刚果红染色15-20min 后，倒掉刚果红，用1mol/L的NaCl脱色几分钟至观察到透明圈，则说明水解圈内的菌有水解果胶的能力；菌落描述：取此菌进行菌落形态描述，就菌落的大小（大、中，小），颜色（白，黄，粉红等），干湿（干、湿），边缘（整齐，不整齐），表面（光滑，粗糙，有无突起等）分别进行阐述并详细记录；细菌的分离纯化划线分离：制备果胶酶划线培养基，灭菌后倒平板，挑取具有水解圈的菌种，第一次划线分离培养1-2天后取分离所得单菌落再进行第二次划线分离，划线分离的具体方法是：先在平皿上划定区域，然后将接种针在火焰上进行灭菌操作，取含菌种的培养皿，在火焰上方（注意：不能离火焰太近）打开培养皿盖，先拿接种针在上盖处划线以降温，然后用接种针轻挑所选菌落一到两下，将平皿盖上放好，再取刚刚冷却了的干净平皿在1区进行划线接种操作。
霉菌菌丝球WL对孔雀绿染料脱色性能研究
ｄ ｃ ｌ ｒｚ ｔ ｎ ｅｆｃ ｓｏ Ｇ ｅ ｆｒ ｅ ｖ ｎ ｂ ｔｅ ， ｈ ｗｅ ｅ ｅ ｏｏ ｉａｉ ｆｅ ｔ ｆＭ ｏ ｐ ｒｏｍ ｄ ｅ ｅ ｅ ｔｒ ｏ ｖ ｒ，ｕｎ ｅ ｏ ｎ ｔｉｉｎ ｌｅ ｖ ｒ ｍｅ ｔｉ ｅｆ ｒ ｄ ｐ ｏ ｌ ｄ ｒ ｎ ｎ－ ｕ ｒｔｏ ａ ｎ ｉｏｎ ｎ ｔｐ ｒｏ ｍｅ ｏ ｒｙ，
王 国惠
（ 山 大 学 环 境 科 学 与工 程 学 院 ， 东 广 州 中 广 ５０７ ） １２ ５
摘 要 研 究 了菌 丝 球 ＷＬ对孔 雀绿 的 脱 色性 能 及 对 实 际 染 料 废 水 的脱 色效 果 。 结 果 表 明 ， ＷＬ对 孔 雀 绿 具 有很 高 的 去 除 活 性 。３ ℃ ，０ ｒｍｉ， 色 ４ ， 雀 绿 浓 度 分 别 为 １０２ ０ ３ ０ ５０ｎｇＬ时 ， 脱 色率 分 别 Ｏ ９ ／ ｎ 脱 ８ｈ 孔 ０ 、０ 、５ 、０ ｌ ／ 其 达 １０ 、９ ７ 、６ １ 、０ １ 。在 营 养 环 境 中 ， 球 ＷＬ对 孔 雀 绿 表 现 出 良好 的脱 色效 果 ； 在 非 营 养 条 ０ ％ ９ ． ％ ９ ．％ ９ ． ％ 茵 而 件下 ， ｗＬ对 孔 雀 绿 的 脱 色效 果 很 差 ， 高 脱 色率 只 有 １ ．％ 。甘 蔗 汁 可 作 为 ＷＬ的 良好 碳 源 。 当 以甘 蔗 汁作 最 ８３ 碳 源 时 ， 雀 绿 的 脱 色 率 为 ９ ． ％ 。 豆 浆 和 牛 奶 作 氯 源 时 ， 色 效 果 也 非 常 明 显 ， 色率 分 别 达 ９ ． 孔 ７１ 脱 脱 ３ ４和
广谱染料脱色细菌的分离鉴定及脱色特性初探
快速拉动了国内染料消费 的增长． 染料工业生产的
各 类染 料 、 光增 白剂 及有 机 颜 料 等 广 泛应 用 于 纺 荧
料的有氧降解有重要的理论价值和实际应用价值．
本试 验 以偶 氮 、 醌 、 环 、 苯 甲烷 不 同结 构 蒽 杂 三 类 型 的 ４种合 成染 料 为筛 选 底 物 ， 印染 厂 排 出 的 从 废 水 中分 离 出多株 对不 同结 构类 型 的染 料具 有脱 色 作 用 的细菌 ． 进一 步对 这些菌 株进 行生 理生化 鉴 定 ，
染 料从 结构 上 可分 为 偶 氮 、 醌 、 环 、 苯 甲 蒽 杂 三 烷等 ， 多是 难 以降 解 的芳 香 族 化合 物 Ｊ 目前 印 染 ． 废 水 的处理 方 法 主 要 有 化 学 混 凝 法 、 化 法 、 附 氧 吸
法、 内电解法、 物絮凝 、 生 生物 吸附等 ， Ｊ 而生 物降
中 图分类 号 ：５８ Ｑ Ｑ３； ７
文献标 识码 ： Ａ
文章编 号 ： ０ — ３ （０２ ０－ ８－ １ １ ３７ ２１ ）２ ０９ ７ ０ ５ ０ － ０
进 入新 世纪后 ， 中国纺织 和 印染等 行业 的发展 ，
生 长 、 以不 同结 构 的染 料 为 唯 一 碳 源 的细 菌 涂料、 油墨等各个领域． 在
发 展经 济便 利生 活 的 同时 也 造成 了环 境 污染 ， 大 其 量 排放 的废水 ， 不仅 Ｃ Ｄ、 Ｏ 盐度 和 酸 度 高 ， 而且 色 度
真菌M2对染料脱色的研究
了不同脱色条件下 Ｍ ２对孔雀绿脱色效果． 结果表 明， ２对染料 的脱 色过程是 先吸 附 Ｍ
然后逐渐降解． 在添加 ０ １％吐温 一 ０ 导荆时， ．５ ８诱 培养 ４ ， ｄ 该茵脱 色率 由无诱 导剂 时
的 ７％ 提 高到 ９ ％ ． ６ ６ 在保 证 良好 的 降解 效 果 的前 提 下 ， ２能耐 受 ６ 的 盐度 ． Ｍ ％ 而辅 助
作者简介 ： 张丽芳（９５ ）女 ， １７一 ， 辽宁东港 人， 讲师 ， 博士研究生
实验用真菌菌株是从土壤 中反复分 离、 纯化
维普资讯
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８ ４・
沈 阳 理 工 大 学 学 报
２０ 年 ０６
获得并保存在 Ｐ Ａ培养基上 ， Ｄ 然后将真菌分别点 种于含 甲基橙 、 刚果红 、 中性红 、 孔雀绿 染料筛选 培养基上，ｄ ７ 后观察菌落周围脱色圈的大小＋ 真菌 产木质素酶特性的检测参见文献［ ］ ５．
维普资讯
２ ６ 月 年ｌ ０ ０ ２
第２ ５卷 第 ６期
沈 阳 理 工 大 学 学 报
ＨＥ ＯＮＧ Ｕ ＶＥ Ｉ ＮＩ ＲＳ ＴＹ Ｔ ＡＮＳ Ｔ ＯＮＳ ０Ｆ Ｓ ＮＹＡＮＧ Ｕ Ｇ Ｒ ＡＣ Ｉ
Ｖ０ １． ２ ５ Ｎ０ ． ６ Ｄｅ ． ２ ０ ０ ６ ｃ
Ｓ ４ ． ｇＬ， ａ １ｌ／ ， ｅ Ｏ ． ｇ Ｌ 酒 石 酸 铵 Ｏ ５ ／ Ｎ Ｃ ｇ Ｌ Ｆ Ｓ ４ １／ ， ０ ０
０ ２／ ， ．ｇＬ 染料 ５ ｍ ／ ， ０ ｇＬ 葡萄糖 ５ｇ Ｌ ／ ．
收 稿 日期 ：０ ６—０ ２０ ３—１ ４ －
１３ 高效 脱色菌 的 筛选分 离 ．
吸附 、 离子交换 、 超滤、 渗析 、 化学氧化 、 光氧化 、 电 主要药品 ： 葡萄糖 、 酒石酸铵 、 ｇＯ ７ 、 Ｍ Ｓ ・ Ｈ ０ 解、 萃取法等 ． Ｊ然而， 这些方法 去除各 种染料适 Ｋ Ｏ 、 Ｐ Ｈ Ｐ Ｋ Ｈ Ｏ 等均为分析纯． 试验中使用 的染
微生物实验芽孢观察
微生物实验报告细菌的芽孢染色观察实验刘欣怡2生命科学基地班组别：周一下午三组同组者：曹平平，周楠，刘艺，刘希伟实验时间：2012年10月22号一、实验目的1、学习并掌握芽孢染色法2、了解芽孢杆菌的形态特征3、巩固显微镜操作技术及无菌操作技术二、实验器材1、菌种枯草芽胞杆菌，梭状芽胞杆菌。
2、溶液和试剂5%孔雀绿水溶液，0.5%番红水溶液。
3、仪器和其他用品酒精灯，载玻片，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），显微镜、吸水纸、擦镜纸，接种环，载玻片夹子，无菌水等。
三、实验原理1、芽孢又叫内生孢子(endosopre)，是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体，通常呈圆形或椭圆形。
细菌能否形成芽孢以及芽孢的形状、芽孢在芽孢囊内的位置、芽孢囊是否膨大等特征是鉴定细菌的依据之一。
2、芽孢菌体的特点：a.芽孢的含水率低，38%～40%。
b.芽孢壁厚而致密，分三层：外层是芽孢外壳，为蛋白质性质。
中层为皮层，由肽聚糖构成，含大量2，6-吡啶二羧酸。
内层为孢子壁，由肽聚糖构成，包围芽孢细胞质和核质。
芽孢萌发后孢子壁变为营养细胞的细胞壁。
c.芽孢中的2，6-吡啶二羧酸（简称DPA）含量高，为芽孢干重的5%～15%。
吡啶二羧酸以钙盐的形式存在，钙含量高。
在营养细胞和不产芽孢的细菌体内未发现2，6-吡啶二羧酸。
芽孢形成过程中，2，6-吡啶二羧酸随即合成，芽孢就具有耐热性，芽孢萌发形成营养细胞时，2，6-吡啶二羧酸就消失，耐热性就丧失。
d.含有耐热性酶。
芽孢由于有以上四个特点，使得芽孢对不良环境如高温、低温、干燥、光线和化学药物有很强的抵抗力。
细菌的营养细胞在70～80℃时10分钟就死亡，而芽孢在120～140℃还能生存几小时，营养细胞在5%苯酚溶液中很快就死亡，芽孢却能存活15天，芽孢的大多数酶处于不活动状态，代谢活力极低，所以，芽孢是抵抗外界不良环境的休眠体。
3、芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理，用不同染料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。
外源因子添加对Irpex lacteus XX-5降解孔雀石绿的影响
外源因子添加对Irpex lacteus XX－5降解孔雀石绿的影响□徐丽【摘要】本文采用静置开放式培养法研究碳源、氮源、磷源、多因素影响下对Irpex lacteus XX－5降解孔雀石绿的影响。
结果表明，I．lactus XX－5脱色最适合条件为果糖4g/L，尿素3．0g/L，焦磷酸盐0．3g/L。
分别研究C/N，N/P对I．lactus XX－5降解孔雀石绿的影响。
在上述各培养条件下，对浓度为100mg/L不灭菌的孔雀石绿溶液静止培养5d，脱色率达95%以上。
此外，通过对降解前后的孔雀石绿溶液进行紫外扫描，发现在72小时后波线图平稳，说明降解完毕。
I．lactus XX－5对处理印染废水具有较好的应用潜力。
【关键词】孔雀石绿；降解技术；紫外扫描【作者单位】徐丽，湖南农业大学生物科技学院当前，环境污染已经称为世界最大的热点问题之一，而水污染尤为严重。
世界染料年产量约为800 900kt，并以0．15%的速度增长。
废水中的染料能吸收光线，降低水体透明度，影响水生生物和微生物生长，不利于水体自净，同时易造成视觉上的污染。
严重污染的水体会影响到人类的健康。
因此，对染料的排出必须严格控制。
染料品种繁多，结构多样。
如蒽醌染料、偶氮染料、三芳基甲烷染料、酞菁染料等，这些染料大多数是具有毒性、致突变、致癌的特性。
目前我国对印染废水采用物理化学法、化学法、生物处理法等进行处理。
物理化学法主要包括：吸附法（如活性炭吸附）、絮凝沉降法、膜过滤法、化学氧化法（如Fenton氧化法、O3氧化法）、辐照法、离子交换法、电解法等。
一般来讲物理化学法能够获得较高的处理效率，但是存在的主要问题是处理量较小、处理费用较高，投加的化学药品还会引起二次污染。
相比之下，生物法具有运行费用低且处理量较大的特点。
本研究通过对分离菌种进行染料降解筛选及其降解条件的优化，探讨各种因素对该菌种降解效果的影响，为实际应用提供一定的技术支持。
一、材料与方法（一）材料。
桔青霉降解三苯甲烷染料孔雀绿的研究
２ ０１ ３ 年 ４ 月
辽 宁工业 大学学报 （ 自然科 学版）
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孔雀石绿染料的微生物脱色研究
孔雀石绿（Malachite green）别名碱性绿、盐基块绿、孔雀绿、苯胺绿、维多利亚绿或中国绿，亦为一种生物染色剂染料。
孔雀石绿过去常被用于制陶业、纺织业、皮革业、食品颜色剂和细胞化学染色剂，1933 年起其作为驱虫剂、杀虫剂、防腐剂在水产中使用，后曾被广泛用于预防与治疗各类水产动物的水霉病、鳃霉病和小瓜虫病。
从上世纪90 年代开始，国内外学者陆续发现，孔雀石绿及其代谢产物无色孔雀石绿具有高毒素、高残留、高致
癌和高致畸、致突变等副作用[1]。
许多研究表明，微生物具有极高的降解有机染料的能力，目前分离到的脱色微生物主要有真菌、藻类和细菌[2]。
但目前已报道的脱色菌的效率不高，且耐受孔雀绿染料的范围较低[3,4]。
本试验以高浓度孔雀绿染料为筛选底物，从活性污泥中分离出脱色菌，，能耐受并脱色降解较高浓度的孔雀绿染料，脱色能力强，且脱色速率高.
1 实验设计方案与思路
1.1 活性污泥分离纯化
1.2 单菌种的扩大培养，在三角瓶中液体培养基培养
1.3 不同单菌种对染料的降解实验：在三角瓶的液体培养基中加少量染料溶液(1000mg/L）和活性污泥，摇床培养，测定脱色率。
确定高效脱色菌种。
1.4 对菌种进行初步鉴定（菌种的形状、革兰氏染色）
2 实验方法[5]
2.1 活性污泥分离纯化
配培养基配方：牛肉膏3g，蛋白胨10g，蒸馏水1000mL，NaCl 5g，pH:7.0~7.2，15-25g/l 琼脂，配置的时候先配液体培养基，再加琼脂配固体培养基，然后分装成六个液体培养基（每个约100ml）和一个固体培养基，塞上棉塞，包扎好，待灭菌。
把实验要用到的实验仪器用报纸包好，用细线扎好，连同培养基一起放入高压蒸汽灭箘法灭菌。
倒平板经灭菌后的固体培养基冷却至50摄氏度左右倒入3个无菌培养皿中，冷凝成平板。
稀释样品将1瓶90 ml和5管9 ml的无菌水排列好，按10-1、10-2、、、10-6依次编号。
在无菌条件下，用10 ml的无菌移液管吸取10 ml活性污泥，至于90 ml无菌水（内含玻璃珠）中，将移液管吹洗3次，用手摇10 min 将颗粒状样品打散；用1 ml 无菌移液管吸取1 ml 10-1浓度的菌液于9 ml的无菌水中，将移液管吹洗三次，摇匀，即为10-2浓度菌液。
同法依次稀释到10-6。
涂布用无菌移液管吸取5ml浓度为10-4、10-5、10-6稀释样品液于平板上，用三角刮刀在平板上旋转涂布均匀。
培养将已涂布的平板置于恒温培养箱培养，正置培养两天。
2.2 对菌种进行初步鉴定
结果观察观察培养出的3种菌落
镜检将培养出的3种菌落进行革兰氏染色，并判断它们的菌属
2.3 单菌种的扩大培养
将沾有上述3种菌种的接种环分别送入3个液体培养基中（锥形瓶编号1-3），使环上的菌种全部进入培养基中，抽出接种环并灼烧。
轻轻摇动，使菌体在液体培养基中分布均匀，
送培养箱37度摇床培养六天。
2.4 不同单菌种对孔雀绿的降解效率测定
配制1000mg/L孔雀绿染料，在617nm下测定孔雀绿染料的吸光度A0
分别取少量（数滴）孔雀石绿染料溶液加入上述3个液体培养基中，再把三个培养基放入恒温振荡器摇床培养两天。
每个培养基分别取混合液50 ml于离心管进行离心分离15min，再分别测定降解后孔雀石绿染料的吸光度A1-A3，计算染料溶液的降解率。
3 结果与讨论
3.1 降解后孔雀石绿的吸光度
3.2 菌种的初步鉴定结果
3.4 结果讨论
由上述结果与分析可知，对于少量高浓度孔雀石绿，菌种A和C的脱色作用相对来说较强。
菌种对于高浓度孔雀石绿的脱色作用不是很明显，后续的实验可适当降低浓度以更符合实际情况。
后续实验可研究pH、温度和脱色时间对菌种脱色作用的影响，使得菌种的脱色效率更好。
4 参考文献。