孔雀绿染料的微生物脱色研究

孔雀石绿染料的微生物脱色研究

孔雀石绿（Malachite green）别名碱性绿、盐基块绿、孔雀绿、苯胺绿、维多利亚绿或中国绿，亦为一种生物染色剂染料。孔雀石绿过去常被用于制陶业、纺织业、皮革业、食品颜色剂和细胞化学染色剂，1933 年起其作为驱虫剂、杀虫剂、防腐剂在水产中使用，后曾被广泛用于预防与治疗各类水产动物的水霉病、鳃霉病和小瓜虫病。从上世纪90 年代开始，国内外学者陆续发现，孔雀石绿及其代谢产物无色孔雀石绿具有高毒素、高残留、高致

癌和高致畸、致突变等副作用[1]。

许多研究表明，微生物具有极高的降解有机染料的能力，目前分离到的脱色微生物主要有真菌、藻类和细菌[2]。但目前已报道的脱色菌的效率不高，且耐受孔雀绿染料的范围较低[3,4]。本试验以高浓度孔雀绿染料为筛选底物，从活性污泥中分离出脱色菌，，能耐受并脱色降解较高浓度的孔雀绿染料，脱色能力强，且脱色速率高.

1 实验设计方案与思路

1.1 活性污泥分离纯化

1.2 单菌种的扩大培养，在三角瓶中液体培养基培养

1.3 不同单菌种对染料的降解实验：在三角瓶的液体培养基中加少量染料溶液(1000mg/L）和活性污泥，摇床培养，测定脱色率。确定高效脱色菌种。

1.4 对菌种进行初步鉴定（菌种的形状、革兰氏染色）

2 实验方法[5]

2.1 活性污泥分离纯化

配培养基配方：牛肉膏3g，蛋白胨10g，蒸馏水1000mL，NaCl 5g，pH:7.0~7.2，15-25g/l 琼脂，配置的时候先配液体培养基，再加琼脂配固体培养基，然后分装成六个液体培养基（每个约100ml）和一个固体培养基，塞上棉塞，包扎好，待灭菌。把实验要用到的实验仪器用报纸包好，用细线扎好，连同培养基一起放入高压蒸汽灭箘法灭菌。

倒平板经灭菌后的固体培养基冷却至50摄氏度左右倒入3个无菌培养皿中，冷凝成平板。稀释样品将1瓶90 ml和5管9 ml的无菌水排列好，按10-1、10-2、、、10-6依次编号。在无菌条件下，用10 ml的无菌移液管吸取10 ml活性污泥，至于90 ml无菌水（内含玻璃珠）中，将移液管吹洗3次，用手摇10 min 将颗粒状样品打散；用1 ml 无菌移液管吸取1 ml 10-1浓度的菌液于9 ml的无菌水中，将移液管吹洗三次，摇匀，即为10-2浓度菌液。同法依次稀释到10-6。

涂布用无菌移液管吸取5ml浓度为10-4、10-5、10-6稀释样品液于平板上，用三角刮刀在平板上旋转涂布均匀。

培养将已涂布的平板置于恒温培养箱培养，正置培养两天。

2.2 对菌种进行初步鉴定

结果观察观察培养出的3种菌落

镜检将培养出的3种菌落进行革兰氏染色，并判断它们的菌属

2.3 单菌种的扩大培养

将沾有上述3种菌种的接种环分别送入3个液体培养基中（锥形瓶编号1-3），使环上的菌种全部进入培养基中，抽出接种环并灼烧。轻轻摇动，使菌体在液体培养基中分布均匀，

送培养箱37度摇床培养六天。

2.4 不同单菌种对孔雀绿的降解效率测定

配制1000mg/L孔雀绿染料，在617nm下测定孔雀绿染料的吸光度A0

分别取少量（数滴）孔雀石绿染料溶液加入上述3个液体培养基中，再把三个培养基放入恒温振荡器摇床培养两天。每个培养基分别取混合液50 ml于离心管进行离心分离15min，再分别测定降解后孔雀石绿染料的吸光度A1-A3，计算染料溶液的降解率。

3 结果与讨论

3.1 降解后孔雀石绿的吸光度

3.2 菌种的初步鉴定结果

3.4 结果讨论

由上述结果与分析可知，对于少量高浓度孔雀石绿，菌种A和C的脱色作用相对来说较强。菌种对于高浓度孔雀石绿的脱色作用不是很明显，后续的实验可适当降低浓度以更符合实际情况。

后续实验可研究pH、温度和脱色时间对菌种脱色作用的影响，使得菌种的脱色效率更好。

4 参考文献