常用细菌染色技术
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三、结果:
阳性菌——紫色
阴性菌——红色
固定 初染
媒染 脱色 复染 革兰氏阳性菌,用符号“G+”或“GP” (Gram’s Positive)表示。 革兰氏阴性菌,用符号“G¯”或“GN” (Gram’s Negative)表示。
四、影响因素
1.操作:
涂片的厚薄,不宜过厚 染色时间的把握,尤其是脱色时间,脱色不宜过度 固定过程不可用酒精灯直接加热,避免过热使菌体变性而影
抗酸染色的意义: 用以鉴别抗酸菌(如结核杆菌和麻风 杆菌)和非抗酸菌。
荧光染色法
一、原理
抗酸杆菌用荧光燃料Auramine O(金胺O)染色后,用
含有紫外光源的荧光显微镜检查,将会发出闪亮的橘黄色。
标本涂布不能过厚,影响染色效果。 体液标本应浓缩集菌后取沉渣涂片。
普通染色法
革兰染色法(Gram Stain)
是最常用的鉴别染色法之一。此染色法是由丹麦细菌学 家 Christian Gram氏于1882~1884年发明的,至今已逾百 年,仍在广泛使用,是细菌学中最为经典的染色方法。
一、原理
体液标本:取标本10ml,3000rpm,离心30min,取沉渣涂片。 大小、厚度同痰涂片。
脑脊液:将脑脊液离心或甩片集菌后涂片备用。 大便:取粘液便或者血便少量均匀涂布玻片,不可过厚。
标本处理注意事项
标本应以打圈的方式反复涂抹均匀,避免标本涂布不均影响结果判读, 或使染色不均造成阴阳不定。
细菌经结晶紫初染染成蓝色。G+菌细胞壁肽聚糖层数多,且肽 聚糖为空间网状结构,再经乙醇脱水,网状结构更为致密,染料 复合物不易从细胞内漏出,仍为蓝色。而G-菌细胞壁脂类含量多, 肽聚糖层数少,且肽聚糖为平面片层结构,易被乙醇溶解,使细 胞壁通透性增高,结合的染料复合物容易泄漏,细菌被脱色为无 色,再经石炭酸复红稀释液复染成红色。
一种单一的颜色。故此法只能显示细菌的形态及大小,对
细菌的鉴别价值不大。
2.复染法(鉴别染色):
采用两种或两种以上的不同染料进行先后染色,使不
同种类的细菌、同种细菌的不同结构,分别染上不同的颜
色,以便鉴别细菌。
染色过程
涂片
干燥
固定
镜检
水洗、吸干
染色
细菌基本形态结构
基本形态
球菌 杆菌 弧菌
响染色效果。
2.染液
染液用完后应及时盖上盖子,以免挥发影响染色效果
3.细菌因素
被检菌的培养条件、培养基成分、菌龄的不同等原因会 影响染色结果,如培养时间过长革兰阳性菌可能染成阴性, 所以被检菌的菌龄一般最好在18~24h之内。
某些细菌存在染色困难、不易脱色等情况,可能会出现 染色不均,阴阳不定的现象。
二、步骤
标本处理
涂片固定
结晶紫初染
碘液媒染
乙醇脱色
复红复染
用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫(crystal violet)。 媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和力或附着力, 即以某种方式帮助染料固定在细胞上,使不易脱落。 不同类型的细胞脱色反应不同,有的能被脱色,有的则不 能,脱色剂常用95%的酒精(ethanol)。 复染液也是一种碱性染料,其颜色不同于初染液,复染的 目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色,而未被脱色 的细胞仍然保持初染的颜色,常用的复染液是番红。
五、临床意义
鉴别细菌:
用革兰氏染色法可将所有细菌分为阳性与阴性两类,可初步识别细菌,
以利进一步鉴定。
选择药物:
可根据革兰氏染色性的不同,供临床初步选择用药方向。
与致病性相关:
大多数革兰氏阳性菌的致病物质为外毒素,而大多数革兰氏阴性菌的
致病物质为内毒素。由此,可采取有针对性的治疗方案。
素的颜色(红色),也就易于鉴别。
二、步骤
标本处理
涂片固定
酸性复红初染
3%盐酸酒精脱色
美蓝复染
镜检
染色过程中的细菌颜色变化:
抗酸杆菌 非抗酸杆菌
三、结果: 抗酸菌———红色; 非抗酸菌——蓝色。
抗酸染色注意事项
每张玻片只能涂一个标本,以免染色过程中因冲洗使菌体脱 落,造成阴阳性结果混淆;
注意生物安全,自我防护; 脱色时间依据涂片厚薄适当调整,以无红色为止。
常用细菌染色技术
细菌染色方法
燃料与细胞 结合而染色
细菌染色
活菌染色
死菌染色
正染色
负染色
细胞不染色 而背景染色
普通染色特殊Biblioteka 色简单染色法复杂染色法
芽孢染色法
荚膜染色法 细胞壁染色法
抗酸染色 革兰氏染色
常用的染色方法
革兰染色:
最经典常用;革兰阳性、阴性菌;初步识别特殊
形态
抗酸染色:
抗酸性、非抗酸性细菌;用于结核病、麻风病等
特殊结构
芽孢:枯草杆菌、破伤风梭菌 荚膜:肺炎链球菌 鞭毛:变形杆菌
标本处理
痰液:用无菌棉签挑取干酪样或脓性痰部分0.05-0.1ml,涂 于载物玻片右2/3 处,均匀涂抹成卵圆形痰膜(约2cm长), 每张玻片只涂一份标本。
脓液: 同痰涂片法。
病灶组织或干酪块等:先用组织研磨器磨碎后再行涂片。大小、 厚度同痰涂片。
荧光染色:
敏感性强、效率高、易观察;用于结核分枝杆菌
等
其它:鞭毛染色鞭毛有无、位置、数量;
异染颗粒染色白喉棒状杆菌;
荚膜染色
常用燃料
碱性染料 带正电荷,易与带负电荷的被染物结合。常用的
染料有碱性复红、结晶紫、亚甲蓝等。
酸性染料:显色离子带负电荷,易与带正电荷的被染物结合。
通常用来染细胞质,而很少用于细菌的染色。常用的染料有伊红、 刚果红等。
革兰氏阴性杆菌例子 (大肠杆菌 x 1000)
抗酸染色法
一、原理
结核菌、麻疯杆菌、耻垢菌等抗酸性菌,因其菌体
表面有一层类脂或脂质之皮膜不易着色,但一经着色后
酸或乙醇的作用亦是不容易把它脱色。利用这特性并以
增强的染色液予染色,然后再以酸及乙醇加以处理,使
其脱色后再对比染色,此时抗酸性菌仍是固定着最初色
复合染料(中性染料):是碱性染料和酸性染料的
复合物,如瑞氏染料(伊红亚甲蓝)、姬姆萨染料(伊红天青)等;
荧光染料:如荧光标记的抗体,荧光素常用异硫氢基荧光素。
用于某些特殊的染色技术。
脂溶性染料 如Sudan black。
染色方法的分类
1.单染法:采用一种染料染色
如用美兰或稀释石炭酸复红等,使各种细菌均染成同