细菌染色技术

.
墨汁染色法
标本：脑脊液 处理方法：离心或用细胞离心机离心浓缩 染色方法：墨汁染色（负染色） 结果：
.
.
.
在细菌检验工作中，除异染颗粒染色法较常用 外，由于其它特殊结构染色法操作费时，费用较 高、染色过程要求非常严格，而普通染色法虽不 能使特殊结构本身着色，但菌体着色后，荚膜和 芽孢部分由于不着色也能显示出来，再加上特殊 染色法比较复杂，故日常工作中较少使用这些特 殊结构染色法。
一、原理
结核菌、麻疯杆菌、耻垢菌等抗酸性菌，因其菌体表面 有一层类脂或脂质之皮膜不易着色，但一经着色后酸或乙醇的 作用亦是不容易把它脱色。利用这特性并以增强的染色液予染 色，然后再以酸及乙醇加以处理，使其脱色后再对比染色，此 时抗酸性菌仍是固定着最初色素的颜色（红色），也就易于鉴 别。
.
二、步骤
标本处理
.
二、步骤
标本处理
涂片固定
结晶紫初染
碘液媒染
乙醇脱色
复红复染
.
用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫(crystal violet)。 媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和力或附着力， 即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落。 不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不 能，脱色剂常用95％的酒精(ethanol)。 复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的 目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色 的细胞仍然保持初染的颜色，常用的复染液是番红。
➢ 标本涂布不能过厚，影响染色效果。 ➢ 体液标本应浓缩集菌后取沉渣涂片。
.
.
普通染色法
.
革兰染色法（Gram Stain）
是最常用的鉴别染色法之一。此染色法是由丹麦细 菌学家 Christian Gram氏于1882～1884年发明的，至今 已逾百年，仍在广泛使用，是细菌学中最为经典的染色方 法。
➢ 特殊结构
芽孢：枯草杆菌、破伤风梭菌 荚膜：肺炎链球菌 鞭毛：变形杆菌
.
标本处理
➢ 痰液：用无菌棉签挑取干酪样或脓性痰部分0.05-0.1ml，
涂于载物玻片右2/3 处，均匀涂抹成卵圆形痰膜（约2cm 长),每张玻片只涂一份标本。
➢ 脓液： 同痰涂片法。 ➢ 病灶组织或干酪块等：先用组织研磨器磨碎后再行涂片。
复合染料（中性染料）：是碱性染料和酸性染料的复
合物，如瑞氏染料（伊红亚甲蓝）、姬姆萨染料(伊红天青)等；
荧光染料：如荧光标记的抗体，荧光素常用异硫氢基荧光素。
用于某些特殊的染色技术。
脂溶性染料 如Sudan black。
.
染色方法的分类
1.单染法:采用一种染料染色 如用美兰或稀释石炭酸复红等，使各种细菌均染成同
.
.
革兰氏阳性葡萄球菌例子 (金黄 色葡萄球菌 x 1000)
.
革兰氏阳性链球菌例子
.
革兰氏阴性杆菌例子 (大肠杆菌 x 1000)
.
革兰氏阴性弧菌例子
.
革兰氏阳性产芽孢杆菌例子
.
革兰氏阳性短杆菌例子 (李斯特 菌 x 1000)
.
革兰氏阴性弯曲菌例子
.
革兰氏阳性棒状杆菌例子
.
抗酸染色法
麻风病等
荧光染色：敏感性强、效率高、易观察；用于结核
分枝杆菌等
其它：鞭毛染色鞭毛有无、位置、数量； 异染颗粒染色白喉棒状杆菌； 荚膜染色
.
常用燃料
碱性染料 带正电荷，易与带负电荷的被染物结合。常用的染料
有碱性复红、结晶紫、亚甲蓝等。
酸性染料:显色离子带负电荷，易与带正电荷的被染物结合。
通常用来染细胞质，而很少用于细菌的染色。常用的染料有伊红、 刚果红等。
.
负染色法
所谓负染色法是指使背景着色而细菌本身不着色的一 种染色方法。常用的有墨汁染色法。也可用酸性染料如刚 果红或水溶性苯胺黑等进行染色。因酸性染料带负电荷， 而细菌本身在近乎中性的环境中也带负电荷，同种电荷相 排斥，故染色时菌体不着色，而只能使背景着色。实践中 常用墨汁负染色法配合单染色法（如美兰染色法）检查细 菌的荚膜，使背景成黑色；菌体呈蓝色；而荚膜不着色， 从而使荚膜包绕在菌体周围成为一层透明的空圈。
一种单一的颜色。故此法只能显示细菌的形态及大小，对 细菌的鉴别价值不大。
2.复染法（鉴别染色）: 采用两种或两种以上的不同染料进行先后染色，使
不同种类的细菌、同种细菌的不同结构，分别染上不同的 颜色，以便鉴别细菌。
.
染色过程
涂片
干燥
固定
镜检
水洗、吸干
.
染色
细菌基本形态结构
➢ 基本形态
球菌 杆菌 弧菌
金胺O染色 时间可稍微延长，但不可少于规定时间
盐酸酒精脱色 脱色时间依片子厚薄适当调整
复染
镜检
.
复染时间不可过长 荧光显微镜观察有无黄绿色荧光
三、结果:
阳性—明亮橘黄色荧光； 阴性—无荧光
.
三、临床应用：
荧光染色法敏感性强，效率高而且容易观察结果，在临床 细菌鉴定中有很大的实用价值。主要用于结核分枝杆菌、麻风 分枝杆菌、白喉棒状杆菌及痢疾志贺菌等的检测。
响染色效果。
.
2.染液
染液用完后应及时盖上盖子，以免挥发影响染色效果
3.细菌因素
➢ 被检菌的培养条件、培养基成分、菌龄的不同等原因会 影响染色结果，如培养时间过长革兰阳性菌可能染成阴性， 所以被检菌的菌龄一般最好在18~24h之内。
➢ 某些细菌存在染色困难、不易脱色等情况，可能会出现 染色不均，阴阳不定的现象。
大小、厚度同痰涂片。
➢ 体液标本：取标本10ml，3000rpm,离心30min，取沉渣涂片。
大小、厚度同痰涂片。
➢ 脑脊液：将脑脊液离心或甩片集菌后涂片备用。 ➢ 大便：取粘液便或者血便少量均匀涂布玻片，不可过厚。
.
标本处理注意事项
➢ 标本应以打圈的方式反复涂抹均匀，避免标本涂布不 均影响结果判读，或使染色不均造成阴阳不定。
.
.
特殊染色
鞭毛染色
.
质量控制
每批或每天染色时应同步进行质控，质控方法如下：
染色方法
质控菌株
阳性
革兰染色 抗酸染色 荧光染色
Sau ATCC25923 Eco ATCC25922
H37RV Eco ATCC25922
H37RV Eco ATCC25922
紫色 红色 橘黄色荧光
阴性
红色 蓝色 无荧光
.
常见细菌图例
肺炎链球菌
.
无乳链球菌
.
化脓链球菌
.
缺陷乏养菌
.
脑膜炎奈瑟氏菌
.
淋病奈瑟菌
.
产单核李斯特菌
.
红斑丹毒丝菌
.
奴卡氏菌
.
豚鼠/嗜水气单胞
.
类鼻疽单胞菌
.
巴斯德菌属
.
阴道加特纳菌
.
军团菌
.
产气荚膜梭菌
.
巴斯德菌
.
霍乱弧菌
.
新型隐球菌
.
布鲁氏菌
.
谢谢!！!
.
细菌染色技术
.
细菌染色方法
燃料与细胞 结合而染色
细菌染色
活菌染色
死菌染色
正染色
负染色
细胞不染色 而背景染色
普通染色
特殊染色
简单染色法 复杂染色法 芽孢染色法 荚膜染色法 细胞壁染色法
抗酸染色 革兰氏染色
.
常用的染色方法
革兰染色：最经典常用；革兰阳性、阴性菌；初步
识别特殊形态
抗酸染色：抗酸性、非抗酸性细菌；用于结核病、
.
五、临床意义
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ➢ 鉴别细菌：
用革兰氏染色法可将所有细菌分为阳性与阴性两类，可初步识别细菌， 以利进一步鉴定。
➢ 选择药物：
可根据革兰氏染色性的不同，供临床初步选择用药方向。
➢ 与致病性相关：
大多数革兰氏阳性菌的致病物质为外毒素，而大多数革兰氏阴性菌的致 病物质为内毒素。由此，可采取有针对性的治疗方案。
.
抗酸染色的意义： 用以鉴别抗酸菌（如结核杆菌和麻风 杆菌）和非抗酸菌。
.
荧光染色法
一、原理
抗酸杆菌用荧光燃料Auramine O(金胺O)染色后，用 含有紫外光源的荧光显微镜检查，将会发出闪亮的橘黄色。 这种方法可用较低倍镜头镜检，因此能快速找出抗酸杆菌。
.
二、步骤：
标本处理 涂片固定
涂布均匀，不可过厚
四、注意事项：
荧光染色法可以作为分枝杆菌的初筛实验，初筛阳性的须做 抗酸染色确认。
.
特殊结构染色法
.
细菌的某些基本结构如细胞壁、核质、胞浆颗粒和特 殊结构如荚膜、芽孢、鞭毛等，用普通染色法不易着色， 须用一些特殊染色法才能染上颜色。特殊染色法主要有荚 膜染色法、鞭毛染色法、芽孢染色法、异染颗粒染色法等 。这些染色法不仅能使特殊结构着色，还可使特殊结构染 成与菌体不同的颜色，有利于观察和区别。
.
一、原理
细菌经结晶紫初染染成蓝色。G+菌细胞壁肽聚糖层数多， 且肽聚糖为空间网状结构，再经乙醇脱水，网状结构更为致密， 染料复合物不易从细胞内漏出，仍为蓝色。而G-菌细胞壁脂类含 量多，肽聚糖层数少，且肽聚糖为平面片层结构，易被乙醇溶解， 使细胞壁通透性增高，结合的染料复合物容易泄漏，细菌被脱色 为无色，再经石炭酸复红稀释液复染成红色。
.
三、结果:
阳性菌——紫色 阴性菌——红色
.
固定
初染 媒染 脱色 复染 革兰氏阳性菌，用符号“G+”或“GP”
（Gram’s Positive）表示。 革兰氏阴性菌，用符号“G¯”或“GN”
（Gram’s Negative）表示。
.
四、影响因素
1.操作：
➢ 涂片的厚薄，不宜过厚 ➢ 染色时间的把握，尤其是脱色时间，脱色不宜过度 ➢ 固定过程不可用酒精灯直接加热，避免过热使菌体变性而影
涂片固定
酸性复红初染
3%盐酸酒精脱色
美蓝复染
镜检
.
染色过程中的细菌颜色变化：
抗酸杆菌 非抗酸杆菌
.
三、结果: 抗酸菌———红色； 非抗酸菌——蓝色。
.
抗酸染色注意事项
➢ 每张玻片只能涂一个标本，以免染色过程中因冲洗使菌体脱 落，造成阴阳性结果混淆；
➢ 注意生物安全，自我防护； ➢ 脱色时间依据涂片厚薄适当调整，以无红色为止。