染料脱色菌的筛选及脱色特性研究

染料脱色菌的筛选及脱色特性研究

1 前言

水是人类生存之源，发展之本，是环境构成中最活跃的因素。我国常年水资源总储量为2.81万亿m3，居世界第6位，而年总用水量为5 500亿～5 600亿m3，整体上能够满足需求。但由于我国人口众多，人均水资源占有量不足2 150 m3，为世界人均水资源占有量的1/4，位列世界110位，是联合国认定的“水资源最为紧缺”的13个国家之一。而且，随着人口的增长，工业化、城市化以及灌溉对水的需求量日益增加，加之水资源时空分布不均、水污染、水生态系统失衡等问题加剧了当前水资源供需矛盾，使我国水资源危机越发凸显，进而成为我国经济发展的严重制约因素之一。据美国对外关系委员会亚洲研究中心的报告，中国668个城市中440个已出现长期缺水问题。20世纪90年代以来，国家累计投入600亿元治理江河污染，相关部门也大力采取防污治污的措施，使得河流、湖泊、水库的水质基本保持稳定，局部有所改善。但据《中国环境状况公报》显示，2007年我国水污染形势依然严峻，监测的197条河流的407个断面中，Ⅰ～Ⅲ类、Ⅳ～Ⅴ类和劣Ⅴ类水质的断面比例分别为49.9 %、26.5 %和23.6 %。因此，防治水资源污染，提高水环境质量，已成为当务之急。

印染产生的废水主要特点有：①水量大；②浓度高，大部分废水呈碱性,COD 值较高，色泽深；③水质波动大，印染厂的生产工艺和所用染化料，随纺织品种类和管理水平的不同而异，而对于每个工厂，其产品都在不断变化，因此，废水的污染物成分浓度的变化与波动十分频繁；④以有机物污染为主，除酸、碱外,废水中的大部分污染物是天然或合成有机物；⑤处理难度较大，染料品种的变化以及化学浆料的大量使用，使印染废水含难生物降解的有机物，可生化性差。

⑤印染废水的色泽深，严重影响着水体外观。造成水体有色的主要因素是染料。可见印染废水是较难处理的工业废水之一。目前全世界染料年总生产量在60 万t 以上，其中50 %以上用于纺织品染色；而在纺织品印染加工中，有10 %～20 %的染料作为废物排出。印染废水的色度严重，用一般的生化法难以去除。染料废水的污染，势必影响到人畜饮水安全、水体养殖生产、农业种植等各方面，应采取得力措施进行防控和处理染料污水。根据环境污染治理专家研究发现，治理染

料污水最有有效的方法是生物法，生物法除了效果明显，也是对环境危害最小，是一种环境友好的除污方法。

本实验即是从生物防治染料污水的角度出发，从污水中提取脱色细菌，并对其进行一系列实验，包括①染料脱色菌的富集、分离②染料脱色菌的驯化培养③染料脱色菌脱色能力的测定④染料脱色菌生长曲线的测定。

2 实验器材

2.1 材料

2.1 菌种来源：各组自选污水

2.2 染料

孔雀石绿，最大吸收波长为617nm

2.3 培养基

富集培养基：KH

2PO

4

1g， (NH

4

)

2

SO

4

1g，MgSO

4

·7H

2

O 0.5g，NaCl 0.5g，

牛肉膏1g，水1000ml，pH值为7.0，121℃下灭菌20min。

基础培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g, NaCl 5g, 水1000ml，pH值为7.0, 121℃下灭菌20min。

脱色培养基：孔雀石绿的质量浓度为100mg/L。

2.4 主要仪器

电热恒温培养箱、光照培养箱、台式高速离心机、752型紫外可见分光光度计、台式压力蒸气灭菌锅、冰箱、电子天平、恒温振荡器、培养皿、试管、玻璃棒、烧杯、电炉、250ml锥形瓶、接种环、酒精灯、移液管、涂布棒、摇床等。

3 方法

3.1 染料脱色菌的筛选和纯化

染料脱色菌的富集：从求索溪中取适量污水，用无菌纱布过滤后取出10g，接入含150ml富集培养基的锥形瓶中，在37℃振荡条件培养2d后观察现象，取出颜色有明显变化的锥形瓶，进行下一步的实验。

菌种的分离筛选及纯化：在无菌条件下，用移液管从培养的锥形瓶中吸取

0.2ml菌液，将其移至加有孔雀石绿的脱色培养基培养皿上，在37℃恒温培养箱中培养1d后，待菌落长出后，拍照。以脱色圈大小、菌落大小作为指标，初步筛选出有效菌株，选取长势好、菌落下培养基脱色圈明显的菌落，用接种环挑取菌落接种至倒好的斜面培养基上，放入37℃恒温培养箱中培养，进行纯化。

3.2 染料脱色菌生长曲线的测定

采用比浊法测定菌株的生长曲线，由于细菌悬液的浓度与光密度（OD值）成正比，因此可利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度，并将所测的OD值与其对应的培养时间作图，即可绘出菌株在30℃液体培养下的生长曲线。测定菌株的生长曲线具体步骤如下：

(1)种子液制备。取斜面菌种各1支，以无菌操作挑取1环菌苔，接入无菌牛肉膏蛋白胨培养液中，30℃震荡培养18h作种子培养液。

(2)标记编号。取盛有10ml无菌牛肉膏蛋白胨培养液的试管，在每支上分别编号为0、2、4、6、8、10、12、14h 。

(3)接种培养。用1ml无菌吸管分别准确吸取0.2ml种子液加入已编号的试管中，于30℃下振荡培养。然后分别按对应时间将试管取出，立即放4℃冰箱中贮存，待培养结束时一同测定OD值。

(4)生长量测定。将未接种的牛肉膏蛋白胨培养基倾倒入比色杯中，选用600nm波长，分光光度计上调节零点，作为空白对照，并对不同时间培养液从0h 起依次进行测定，对浓度大的菌悬液用未接种的无菌牛肉膏蛋白胨液体培养基适当稀释后测定，使其OD值在0.10～0.65以内，经稀释后测得的OD值要乘以稀释倍数，才是培养液实际的OD值。

(5)绘制生长曲线。记录测定的各OD值，以上述时间标志为横坐标，相应的OD（600nm）值为纵坐标，绘制菌种的生长曲线。

3.4 染料脱色菌脱色能力的测定

将分离纯化的菌株分别接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃，150r/min 振荡培养24h。取新鲜制备的菌悬液5mL，加入到含100ml脱色培养基的锥形瓶中，