紫外诱变选育高产酒精及酸的酿酒酵母

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万古霉素高产菌株选育及发酵配方优化

万古霉素高产菌株选育及发酵配方优化作者：王会会程启东戴梦赵建强任风芝葛鹍鹏张志江来源：《河北工业科技》2022年第03期摘要：為了提高东方拟无枝酸菌产万古霉素的发酵单位，降低生产成本，采用紫外诱变、常压室温等离子体诱变对东方拟无枝酸菌出发菌株V19-02进行诱变处理，通过筛选链霉素抗性突变菌株，选育高产菌株;通过对发酵培养基中碳源和氮源进行筛选，选取葡萄糖、淀粉、低温豆粉、酵母粉4个因素进行均匀设计。

结果表明，获得的高产菌株V19-1-07摇瓶发酵单位提高33.7%，且具有良好的传代稳定性;优化后的培养基配比质量分数为葡萄糖8.0%、淀粉1.0%、低温豆粉1.0%、酵母粉4.0%、氯化钠1.0%、磷酸二氢钾0.1%;小试结果证明，优化配方可使50 L罐发酵单位平均达到14 110 μg/mL，比原始配方提高了28.9%。

因此，研究获得的高产菌株V19-1-07可应用于万古霉素工业化发酵生产，以帮助企业降低成本，进一步提高竞争力。

关键词：发酵工程;万古霉素;复合诱变;菌种选育;均匀设计;东方拟无枝酸菌中图分类号：TQ465.9 文献标识码：ADOI： 10.7535/hbgykj.2022yx03011Breeding of high vancomycin producing strains and optimization of fermentation formulaWANG Huihui1，2，3，CHENG Qidong4，DAI Meng1，2，3，ZHAO Jianqiang4，REN Fengzhi1，2，3，GE Kunpeng1，2，3，ZHANG Zhijiang4（1.New Drug Research & Development Company，NCPC，Shijiazhuang，Hebei 052165，China;2.National Engineering Research Center of Microbial Medicine，Shijiazhuang，Hebei 052165，China;3.Hebei Industry Microbial Metabolic Engineering & Technology Research Center，Shijiazhuang，Hebei 052165，China;4.Huasheng Company，NCPC，Shijiazhuang，Hebei 052165，China）Abstract：In order to increase the yield of vancomycin by Amycolatopsis orientalis and reduce the cost，the original strain Amycolatopsis orientalis V19-02 was treated by UV and atmospheric and room temperature plasmas（ARTP）.High yield strains were selected by screening streptomycin resistance treatment.Meanwhile，the carbon sources and nitrogen sources of fermentation medium were optimized and four factors including glucose，starch，low-temperature soybean powder and yeast powder were selected for uniform design experiment.The results show that the yield of vancomycin fermentation of the high-yield mutant strain Amycolatopsis orientalis V19-1-07 is increased by 33.7% in flask culture.In addition，the strain has an excellent propagating stability.The optimal fermentation medium is as follows：glucose 8.0%，starch 1.0%，low-temperature soybean powder 1.0%，yeast powder 4.0%，NaCl 1.0%，KH2PO4 0.1%.The experimental results show that the production of vancomycin reachs 14 110 μg/mL under the op timal conditions by the strain V19-1-07 in 50 L fermentor，which is 28.9% higher than the original formula.After applied to large-scale production，it is conductive to reduce the cost and improve the competitiveness of enterprises further.Keywords：fermentation engineering;vancomycin;complex mutagensis;strain breeding;uniformdesign;Amycolatopsis orientalis万古霉素（vancomycin）由东方拟无枝酸菌发酵所得，其通过抑制细菌的生长和繁殖来杀死细菌[1]，是临床上用于治疗由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）引起的严重感染疾病的重要药物[2]。

紫外线诱变育种综述

紫外线诱变育种摘要：紫外线诱变操作简单、对实验设备要求低，是目前被广泛运用的一种物理诱变剂，人们利用紫外线诱变得到了大量的优秀菌种。

本文论述了紫外线诱变的原理、操作流程、其适用范围及研究进展。

关键词：紫外线诱变育种微生物目前微生物发酵技术被广泛的应用到许多生产行业，如生产啤酒、白酒、乳制品、酶制剂、抗生素等行业，同时微生物在解决人类的粮食能源、健康、资源和环境保护等问题中正显露出越来越重要且不可替代的独特作用[1]。

但就目前被投入工业化使用的工业菌大多在生长周期、培养基、产率等方面不能满足工业生产的需求。

理想的工业菌种必须具备: 遗传性状稳定、纯净无污染、能产生许多繁殖单位、生长迅速、能于短时间内生产所要的产物、可以长期保存等特性。

诱变是最早在抗生素上应用的一种育种技术, 它通过物理、化学、生物因素作用于抗生菌, 人为的使其遗传物质发生变异, 从中选育高产菌株[2]。

紫外线诱变属于一种物理诱变剂，它是在微生物发酵技术育种中最早使用的一种诱变方法。

紫外线诱变可以用于大量不同的菌种育种中，如芽孢杆菌、链霉菌、镰刀菌等，通过紫外线对微生物进行诱变，得到了大量比较优秀的工业菌种。

由于紫外线诱变育种简便易行、对条件和设备要求较低并能较好地提高代谢产物的产量，故在微生物育种中仍广泛应用［3］。

本文对紫外线诱变的原理、操作流程、其适用范围、研究进展进行了概述。

一、紫外线诱变的原理紫外线属于一种物理诱变剂，它能使被照射的物质的分子或原子中的内层电子提高能级。

主要生化反应：1.DNA链和氢键的断裂 2.DNA分子间（内）的交联 3.嘧啶的水合作用 4.形成胸腺嘧啶二聚体 5.造成碱基对转换 6.修复后造成差错和缺失。

紫外线诱变处理的有效波长为200 - 300×10nm，最适为254nm(此为核酸的吸收高峰)。

DNA和 RNA的嘌呤和嘧啶吸收紫外光后，DNA 分子形成嘧啶二聚体，即两个相邻的嘧啶共价连接，二聚体出现会减弱双键间氢键的作用[4]，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡.另外二聚体的形成，会妨碍双链的解开，因而影响DNA 的复制和转录.总之紫外辐射可以引起碱基转换、颠换、移码突变或缺失，即是所谓的诱变[5]，从而引起上述的生化反应。

紫外诱变原生质体选育高产L-乳酸菌株的研究

菌中的乳酸菌；一类是真菌中的根霉菌．另在工业生产中，目前大多采用前者［．文以干酪乳杆菌的原生３本］质体为材料，进行紫外诱变处理，以期望得到高产量Ｌｇ酸的突变菌株．－Ｌ
１材料与方法
１１菌种．
干酪乳杆菌Ｚ — （ａｔｂｃｌｓｃｓｉ，安徽工程大学生物与化学工程学院保藏．ＺＬＬｃｏａｉｕ．ａｅｌ）
１２培养基与试剂．
种子培养基（良的ＭＲ改Ｓ培养基）蛋白胨１／酵母提取物５ｇＬ、檬酸二铵２ｇＬ、萄糖：０ｇＬ、／柠／葡
斜面培养基：在种子培养基的基础上，添加琼脂２／．０ｇＬ筛选培养基：良的ＭＲ改Ｓ培养基中加入００溴钾酚绿．．１高渗再生培养基：采用双层琼脂法，０７ｍｏ／Ｎａ１制ＭＲ用．ｌＬＣ配Ｓ培养基，层含２琼脂，层含上下
的形成率为８．，生率为４．％，到最佳水平．对原生质体进行了紫外诱变育种．过平板和静置发９５再７７达并通酵实验．选得到８株突变株产量比出发菌株高的突变株。中菌株Ｚ－６的Ｌ乳酸产量达７．／，出筛其Ｚ０＿８６ｇＬ比
３的琼脂．发酵培养基：萄糖９／，牛肉膏１／葡０ｇＬ２ｇＬ，麦芽汁１／２ｍｌＬ，ＭｇＯＳ・７Ｏ０６ｇＬ，ａＯＨｚ．／ＣＣ

紫外线诱变选育高产醋酸的醋酸菌研究

Ａｓａｔ【ｂｃｖ】ｈｕｐｓｏｔｓｔｙａｔｂｅｄｃｔｉｂｃｒｉｉ — ｉｄｃｔｂｔｃ：ＯｊｔｅＴｅｒｏｉｓｄｓｏｒｅｃｃａｔａｔｈｈｙｌａｅｃｒｅｉｐｅｆｈｕｗｅａｉａｄｅｗｈｇｉｅｉａｉｆｒｉｉｇｒｒｐｃｔｒｓ【ｔｏ】ｈｒｔｃｒｆｃｔｃａｔａＣ＿ｗｓｃｒｅｎｖｅａｆｍａｒｏｄｅ．ＭｅｄＴｅｇｗｕｖｏａｅｃａｉｂｃｒｌａｄｏｂｗｇｎｏｉｇｈｏｈｅｉｄｅｉ０
ｐａｅａｔｒｉｗａｃｂｔｄｆｒ２，ａｄ，ｈｅａａｅｗｓ８．２．Ｔｒｅｈｇｈｓｆｓｉｕａｅ４ｈｎｔｅｌｔｌｔａ８７％ｅｔｎｏｈｒｈｅｉｈ—ｙｅｄｍｕａｔｏｌ１，ｉｌｔｎｓｆＣ１
菌株Ｃ．产酸量分别提高４５、．％、．％，．。．％８６２６且遗传稳定性较好。关键词：紫外线诱变；选育；醋酸菌；突变株中图分类号：Ｓ６．５Ｔ２４１文献标识码：Ａ文章编号：０ — ３０２１）６—１２０１１４３（０２００１０— ７
ｄｔｒｎｄ，ｔｅｅｓｒｉｆｅｅｍｉｅｈｎｔｔｎｏ０ｗａｔｔｄｂｌａｉｌｔｉａｉｔｏ．ＡｎｅｌｔａａｅｏｔｎｔｓｈａＣ１ｓｍｕａｅｙｕｔｖｏｅｒｄａｉｎｒｒｄｔｅｌｒｔｆｍｕａｓｗａｈｈ

高产谷胱甘肽酿酒酵母的选育及发酵工艺的研究

ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＳｔｒａｉｎ
ＬＩＵＺｈｅ，ＺＨＡＮＬｉａｎｇ－ｊｉｎｇ，ＺＨＡＮＧＸｉｎ・ｙｉ，ＷＡＮＧＸｉｎ－ｒｏｎｇ
（Ｓｉｃｈｕａｎｌｎｓｔ．ｏｆＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓｌｎｄｕｓｔ．，ＣｈｉｎａＧｅｎ．Ｃｏｎ．ｏｒｆＭｅｄｉｃｉｎｅＧｒｏｕｐ．Ｃｈｅｎｇｄｕ６１００５２）
ＡｂｓｔｒａｃｔＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＳＣ— Ｏ０１ｗａｓｔａｋｅｎａｓａｓｔａｒｔｉｎｇｓｔｒａｉｎｔｏｃａｒｒｙｏｕｔＵＶｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈ
ｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｂｅｓｔｐｒｅｃｕｒｓｏｒａｍｉｎｏａｃｉｄｓａｄｄｉｔｉｏｎｓｔｒａｔｅｇｙｗａｓ４１ｍｍｏｌ／Ｌｃｙｓｔｅｉｎｅａｄｄｅｄａｔｔｈｅｉｎｉｔｉａｌｍｅｄｉｕｍ．４２ｈ
ｔｏｏｂｓｅｒｖｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｓａｎｄｐｒｅｃｕｒｓｏｒａｍｉｎｏａｃｉｄｓａｄｄｉｎｇｍｏｄｅｏｎｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＧＳＨｂｖＳＣ— Ｏ０１２４ｉｎ１０Ｌｆｅｒｍｅｎｔｅｒ．Ａｎｄｉｔｗａｓｃｏｎｉｒｆｍｅｄｔｈａｔｔｈｅｂｅｓｔｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｗａｓｆｅｄ— ｂａｔｃｈｅｒｆｍｅｎｔａ —

紫外线诱变选育酸性α-淀粉酶菌株

Ｋｅｒｓｂｃｌｓｓｂｉｓａｉ一ａｌｓ；ｌａ—ｖｏｅａ；ｔｔｎｙＷｏｄ：ａｉｕｕｔｉ；ｃｄｌｌｍｙａｅｕｔｒｉｌｔｙｍｕａｉｒｏ
它在淀粉深Ｄ＿酒精、品、料和医药等领域Ｈ［、－食饲
Ｕ｝舀】ＪＩ
中图分类号：Ｓ０．Ｔ２１３文献标识码：Ｂ
Ｂｒｅｉｇｏｇａｉ一ａｙａｅｐｒｄｉｇｓｒｉｔｌｒ —ｖｏｅｕｔｉｎｅｄｎｆｈｉｈｃｄｍｌｓｏｕｃｎｔａｎｗｉｈｕｔａｉｌｔｍａｔｏ
要是芽孢杆菌和曲霉Ｊ国外已有利用黑曲霉。发酵生产酸性仅一淀粉酶的报道Ｊ但我国尚未，实现耐酸性一淀粉酶工业化。本实验以枯草芽
精』。酸性一粉酶的优点是能在酸性条件下淀
发挥催化作用，从而实现淀粉同步液化与糖化，简
摘要：了提高菌株产酶能力，究了紫外线处理对枯草芽孢杆菌Ｂ６８产酸性０一淀粉酶的影响。结为研Ｆ７５【
果表明：采用３紫外线照射９获得较好的突变效果，用变色圈法初筛结合摇瓶发酵复筛，０ｗ０Ｓ利筛选得到一株理想的突变株ｕＶ一１，２其酶活为３１．／Ｌ，４８８Ｕｍ比出发菌株提高了５．％。对ｕ９７Ｖ—ｌ２进行紫外线二次诱变，酶活提高不显著，表现出一定“ 抗性” 。关键词：枯草芽孢杆菌；酸性ｅ一淀粉酶；ｔ紫外线；变诱

微波诱变选育低产高级醇啤酒酵母菌株

产高级醇啤酒酵母的新菌株。关键词：啤酒酵母；波诱变；高级醇微
中图分类号：２１１；３．７ＴＳ６．１Ｑ９９９文献标识码：Ａ
啤酒是以大麦麦芽为主要原料，酒花经啤酒酵母发酵酿制而成，加具起泡性、芽香、花爽口的苦味，麦酒含二氧化碳、生素和１维７种氨基酸的低酒精度的发酵酒口。影响啤酒风味的物质主要有高级醇、类、乙］酯双酰及二氧化硫等。高级醇对啤酒风味有一定的影响，啤酒中高级醇含量过高时，饮后会使人产生头晕、头痛、上头的感觉，失了啤酒原有的饮后舒服愉快的感觉＿。对于啤酒中高级醇的控制，响因素包括很多方丢２］影面，比如：菌种、温度、氧、拌、通搅接种量等，啤酒酵母是源头，株优良的酵母菌才是优质啤酒酿制的前而一
１２６发酵度测定．．
１表观发酵度取对数期生长的啤酒酵母菌悬液，１接种量接种于装有１０ｍＬ麦芽汁的三角）按０５瓶中，５℃恒温发酵；８ｈ摇动一次三角瓶，６ｈ后滤去酵母菌，发酵液的比重。平行实验３次。表观２每９测发酵度的计算公式为
第２卷第２６期
２０１１年６月
青岛大学学报（程技术版）工ＪＵＲＡＮＤＯＵＮＶＲＩＹ（ＯＮＬＯＦＱＩＧＡＩＥＳＴＥ＆Ｔ）

原生质体紫外诱变选育纤维素酶高产菌株

摘要：以绿色木霉Ｔ为出发茵株，其进行原生质体紫外诱变，过刚果红透明圈平板初筛和油菜籽皮固态发酵０对通
复筛，到株稳定性好的纤维素酶高产茵株Ｕ，ＣＭＣ酶活达到了１２．４Ｕ・ｇ。比出发茵株Ｔ提高了得ＶＴ其００２＿，０
维普资讯
圈开发应用
２８ｏ５ｏ亿ｅｓ０。Ｉ．Ｃｍ与生物Ｚ程０Ｖ．Ｎ８ｉ２ｈｔ
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原生质体紫外诱变选育纤维素酶高产菌株
胡婷婷。雁临邱（北工业大学生物工程学院，湖湖北武汉４０６）３０８
ＫＨ２Ｏ４０４，Ｓ．４，ａ１００，量．ＭｇＯ４００ＣＣ２．５装Ｐ
５。
ｍａ是产纤维素酶最高的菌种［］目前，少学者利７。不
用各种诱变剂处理孢子来选育高纤维素酶活的突变
按牛酶、．溶蜗溶壁酶，高渗缓冲溶液中充分溶解，１０于经０００ｒ・ｍｉ－离心１ｎ后，上清液置３紫外灯下处ｎ１０ｍｉ取０ｗ理３ｎ倒人已灭菌的带有小玻璃珠的小三角瓶０ｍｉ，
株，但是通过原生质体诱变选育优良菌株的报道还很
少。由于去除了细胞壁，生质体对诱变剂更加敏感，原更容易得到优良的突变株，因此，者对出发菌株Ｔ作。进行原生质体紫外诱变，得了较好的效果。取

酵母紫外线诱变后培养温度与酒精发酵性状变异相关性研究

ａｏｒｓａｅｗａ．５ｆｒｔｅｆｗｗａｄｍｕａｉｎｓｒｉｓａ０ｔａｓｄｆｎｄａｔｎｓｔａｒｃｓｅｎ｜ｉｅｒｔｓ８７％ｏｈｏｒ— ｔｔｔａｎｔ４ ℃ ｈｔｗａｅｉｅｓｍｕａｔｈｔｐｏｅｓｄａｏ
ＤＡＩＣａｂｈｏｏ。
Ｘｕｃａｇ，ＹｅｈｎＡＮｊａＬｉｉｏ
（ｌｇｆＬｉｃｅｃ，Ｚｅｉｎｉｅｓｔ，Ｈａｇｈｕ３０５，Ｃｈｎ）ＣｏｌｅｏｆＳｉｎｅｈｊｇＵｎｖｒｉｙｅｅａｎｚｏ１０８ｉａ
ｔｅｏｉｉａｔａｎｒｅｔｄｂｈｒｇｎｌｓｒｉｓｗｅｅｔｓｅｙＲＡＰｏｏａＤＮＡｔｐｉｒ．ＩｗａｈｗｅｈｔｈａｉｔｎｃｕｒｄＤｆｔｔｌｗｉｈ１ｒ５ｍｅｓｔｓｓｏｄｔａｅｖｒａｉｓｏｃｒｅｔｏｉｈｈｏｓｍａｎｔｅｃｒｍｏｏ１ＤＮＡｆｔｅｙａｔｓｒｉｓｇｏｔ４ ℃ ｗｅｅｍｏｅｔａｈｔａ１Ｃ．Ｔｈｓｍｅｈｄｅｈｎｅｏｈｅｓｔａｎｒｗｎａ０ｒｒｈｎｔａｔ３ｉｔｏｎａｃｄ
ＡｂｔａｔＳａｃｈａｒｍｙｃｓｃｒｖｓａｅｓ７ａｓｒｎｅｅｆｒｔｔｅｔｄｂｙｅｓｒｃ：ｃｏｅｅｅｉｉＨ２ｔａｉｓｗｒｉｓｒａｅｘｐｏｕｒＯＵＶａｉｔｏｓｅｔｒｄａｉｎ，ａｄｔｎｉｃａｎｈｅｎｕｂ —

紫外诱变吸水链霉菌选育高产农用抗生素菌株

ｔｋｎａｔｅｏｇａｔｉａｅｓｈｒｉｌｓｒｎ．１ｅｕｔａｉｌｔｍｕａｅｅｉ，ｐｉｓｒｅｉｇａｅｏｄｒｃｅｎｎｉｎａｈｌｖｏｅｒｔｇｎｓｓｒ“ ｃｅｎｎｎｄｓｃｎａｙｓｒｅｉｇｗｅｌｄｎｓｒｉ５０ｂｓｎｇｒｂｏｋｍｅｏｅｒｎａｅｏｔａｎ５１ｙｕｉｇａａｌｃｈｔｄａｄｓａｉａｋｓｃｎａｙｓｒｅｉｇｍｅｏｓｎｈｋｎｆｅｏｄｒｃｅｎｎｔｄｒｐ．ｔｒｅｅｈｇ－ｉｌｔａｎ．１ｅｅｅｔｆｐｖｌｅａｄｃｔｒｉｆｆｒｎａｉｎｍｅｉｍｎｔｅｇｌｓｈｅｏｂｅｄｔｉｙｅｄｓｒｉｈｈｈｆｓｏＨａｕｎｕｕｅｔｃｌｍｅｏｅｍｅｔｔｄｕｏｏｈ
１ｐｉｍＨａｕｓ６．ｈｅｏｔｍｕｐｖｌｅｗａ０．１ｉｒｏｅｍｅｔｔｎｌｕｄｃｕｄｒｉｔｉｎａｓａｌａｇｆｒ２ｈａｄｔｅｏｔｍｅｍｎｎａｉｎｔａ６ｈ．ｈｅｔｅｆｆｒｎａｉｉｉｏｌｍｎａｎｉｔｂｅｒｎｅａｔ７ｎｌｐｉｔｏｑｅｌｍｕｆｒｅｔｔｉｗｓ９ｏｍｅ＇ｏｇｉｓｏｏｔｎｏｓｕｔｖｏｅｔｇｎｓｓｈｅａｌｙｏｒｄｃｎｎｉｉｔｙｔｉｓｒｉｓｃｅｓｄｂｒａ０．６％ｔａｈｔｆｅＩｕｈ２ｔ￣Ｆｍｅｆｃｎｉｕｕｌｒｉｌｔａｍｕａｅｅｉ．ｔｂｉｔｆｐｏｕｉｇａｔｏｉｂｌｓｔａｗａｉｒａｅｙｍｏｔｎ３０ｉｂｃｌｎｎｅｈｈｎｔａｔｏｈｏｉｉａｔａｎ．Ａｆｅｅｏｍｉｅｔａｎｒｏｔｎｏｓｙｓｂｕｕｒｄｏｅｓａｔｎ￣ｕｎｆｒ５ｇｎｒｔｎ，ｉｓｉａｔｂｅｇｎｔｈｒｃｅｉｔｓｒｇｎｌｓｉｒｔｒｔｂｎｄｓｒｉｓｗｅｃｎｉｕｕｌｕｃｈｅｎｔｌｎｌｈｅｈｌｅｅａｉｓｔｔｌｈｄｓａｌｅｅｉｃａａｔｒｓｉ．ｏｏｌｃｃ

酿酒酵母的选育及其应用研究进展

酿酒酵母的选育及其应用研究进展0前言酿酒酵母（Saccharomyces Cerevisiae ）一直作为面包和馒头以及酿造葡萄酒和啤酒等产品的发酵菌株.随着石油资源的日益枯竭以及环境的持续恶化，能源和环境问题成为了全球关注的焦点.为了缓解能源危机给经济和环境带来的影响，各国一方面提高能源的利用率，另一方面大力开发新型能源.由于生物能源具有绿色性和可再生性，因此成为研究的热点与重点.研究发现[1]，通过酿酒酵母发酵代谢生产乙醇，然后将乙醇进一步脱水后再加上适量的变性剂就可获得变性燃料乙醇.因此，利用酿酒酵母发酵技术将甘蔗、玉米、木薯和纤维类废弃物等转化为燃料乙醇，已成为解决世界能源危机和开发生物能源的重要手段.燃料乙醇俗称酒精，是国民经济中十分重要的工业产品，用途十分广泛，如在食品行业用于配制各类白酒、果酒、药酒等；在化工行业用于合成化工产品（橡胶、苯胺、乙二醇等）；在燃料方面用于替代日益匮乏的石油资源，可有效减少环境污染，市场前景广阔；在医药工业用于提取医药制剂和作为消毒剂；染料生产、国防工业等也需要大量酒精；同时酿酒酵母中还含多种生理活性物质和营养成分，可用于食品和动物饲料的添加剂，不仅能提高其营养价值，而且还具有医疗保健功能，治疗机体因消化不良或维生素缺乏而引起的一些疾病.此外，酿酒酵母与动、植物同为真核生物，具有很多相同的细胞结构，并且具有生长繁殖快、代谢周期短、易于分离和培养等特点，在生命科学研究中被用作真核生物研究的模式生物.选育出优良的酿酒酵母菌种不仅能提高产品的产量和质量、降低生产成本、增加企业的利润和市场竞争力，还能缓解能源危机、减轻环境污染.因此，对酿酒酵母进行研发与利用具有重要的经济价值和科研意义.人们急切盼望获得具有多种优良特性的酿酒酵母菌株，尤其是转化乙醇能力强的酿酒酵母，其研究意义十分深远.1酿酒酵母研究进展酿酒酵母是人类使用较早的微生物之一，广泛用于食品和医药等领域.酿酒酵母是单细胞生物，同时也是一种典型的真核细胞模型和重要的模式生物，其生长繁殖快、代谢周期短、易于分离和培养等特性使酿酒酵母更方便于进行基因工程和遗传学研究.酿酒酵母作为传统的乙醇代谢菌株，具有耗糖快、遗传背景清晰、发酵工艺成熟和体内重组能力高效等特点，因此是生物质能源发酵的首选菌株.酿酒酵母全基因组测序早在1996年已完酿酒酵母的选育及其应用研究进展王卫国，张仟伟，赵永亮，李瑞静，林强，李晓丹，陶宜辰，王卫（河南工业大学生物工程学院，河南郑州450001）摘要：酿酒酵母中含有蛋白质、氨基酸、维生素、可食纤维以及微量元素等多种生理活性物质和营养成分，具有营养、保健和医疗等功能.此外，酿酒酵母还是酒精酿造的主要菌种，而酒精又是食品、医药、化工、燃料等工业的主要原料，因此，酿酒酵母在酿造、食品、医药保健、饲料、能源化工、环境保护和生命科学研究等领域中应用广泛，是一种十分重要的工业微生物资源.但由于目前很多企业缺少优良的酿酒酵母菌株，导致发酵的产品成本高、质量差.因此选育出具有多种优良特性的酿酒酵母具有巨大的经济价值和研究意义.综述了酿酒酵母菌种的筛选、育种及鉴定方法和目前的研究应用概况.关键词：酿酒酵母；菌种选育；菌种鉴定；应用概况中图分类号：TS201.3文献标志码：A河南工业大学学报（自然科学版）Journal of Henan University of Technology （Natural Science Edition ）第36卷第6期2015年12月Vol.36，No.6Dec.2015收稿日期：2015-06-18基金项目：河南省产学研合作项目（132107000061）作者简介：王卫国（1962-），男，河南汝州人，教授，研究方向为生物工程与生物制药.文章编号：1673-2383（2015）06-0104-09网络出版网址：/doc/b615913606.html,/kcms/detail/41.1378.N. 20151223.1630.038.html 网络出版时间：2015-12-2316:30:32 DOI:10.16433//doc/b615913606.html,ki.iss n1673-2383.2015.06.019第６期王卫国，等：酿酒酵母的选育及其应用研究进展成，是第一个完成基因组测序的真核生物.它包含16条染色体，全长为12068kb.编码专一性蛋白质的ORF（开放阅读框）有5885个，平均每个长度约为1450bp，只有极少数长度超过4500bp，最长的ORF约为14730bp，位于Ⅻ号染色体上，其功能尚不清楚[2].另外，酿酒酵母基因组的测序显示：其基因重组频繁地发生在高GC含量区.随着酿酒酵母全基因组测序的完成，对其基因的功能分析进入了一个新的阶段，相应的各种研究技术也随之迅速发展起来，如酿酒酵母表达系统的建立、酿酒酵母基因敲除技术、酿酒酵母基因定位技术、酿酒酵母双杂交技术、酿酒酵母功能基因芯片技术等，为研究酿酒酵母体内代谢合成乙醇机制以及分子传导通路等提供了便捷、高效的技术手段.但采用酿酒酵母菌株发酵也存在一些问题，如酒精耐受性低、不耐高温等.我国农产品资源丰富，但是利用率很低，如何提高生物能源乙醇的产率是当前亟需解决的问题.目前世界上90%的乙醇是通过酿酒酵母发酵生产的[3]，因此构建高转化率乙醇发酵菌株是燃料乙醇生产的重中之重.利用基因工程或代谢工程手段修饰或阻断酿酒酵母副产物的合成，提高乙醇产率是构建工程菌的主要策略.目前，酿酒酵母相关研究的主要方向是：⑴优良菌株的选育.工业上乙醇发酵的主要菌株是酿酒酵母，选育出发酵性能强、繁殖速度快、耐高浓度乙醇、适应性强的菌株是研究的主要方向.⑵发酵工艺优化.⑶基因工程菌的构建，通过生物工程技术选育和构建大量耐高温、耐乙醇等适应性强、高乙醇产量的菌株，如敲除酿酒酵母副产物代谢关键基因，促进乙醇的合成.酿酒酵母菌种质量的好坏对发酵工业的影响巨大，如何获得耐高渗透压且酒精发酵速率快、耐酒精和耐高温等特性的酵母菌种是目前研究热点.2酿酒酵母的选育酿酒酵母的选育包括筛选和育种两个部分.酿酒酵母菌株的筛选主要是通过杜氏管发酵试验，在高酒精度、渗透压、二氧化硫以及低温等条件下，根据产气量的多少和快慢来对酿酒酵母的耐酒精性、耐渗透压性、耐二氧化硫性、耐低温性等几个重要指标进行评价，从而对酿酒酵母进行特定筛选.随着分子生物学和基因工程技术的不断发展，酿酒酵母的育种方法也在不断更新，自然选育、诱变育种、杂交育种、原生质体融合、基因工程育种都是目前常用的育种手段，但各有利弊.在菌种的选育时需要多种不同的育种方法配合使用，才能达到理想的效果[4-7].2.1自然选育自然环境中存在多种低剂量的诱变物质，如宇宙射线和各种短波辐射等，可使野生酿酒酵母菌株发生低频率的基因突变.在不经过人工处理的情况下直接对酿酒酵母菌群进行筛选的育种方法叫做自然选育.Li等[8]从葡萄汁样品中分离出32株酿酒酵母，分别对其发酵特性进行评价，结果显示其中一株命名为MMf9的野生酿酒酵母不仅发酵速率快、产甘油快，而且对高温、乙醇、渗透压、pH耐受性好.由此看来，自然界中确实存在着优良酿酒酵母的野生菌株，通过人工的分离和筛选，有可能获得具有优良性状的野生酿酒酵母菌株.自然选育是一种简单易行的选育方法，可以达到纯化菌种、防止菌种衰退、稳定生产、提高产量的目的.但是自然选育的最大缺点是效率低、进展慢，从自然界直接筛选的野生酿酒酵母，很难具有理想的特性.然而，近年来为了获得安全、无外源遗传损伤且有地域风格的菌株，很多国家开始重新重视自然选育.2.2诱变育种诱变育种是指用物理、化学诱变剂和生物诱变剂作用于酿酒酵母细胞，使其基因的突变率大大提高，然后筛选出符合人们特定需求的优良酿酒酵母菌株，进而培育出新品种的育种方法.根据诱变方式的不同可分为3种[9-11]：物理诱变、化学诱变和航天诱变.2.2.1物理诱变紫外线、微波、超声波以及能引起电离辐射的射线或快中子等物理诱变因素都会增大酿酒酵母菌株DNA的碱基发生错配率，从而提高酿酒酵母的基因突变率.Son等[12]对一株啤酒酵母进行紫外线诱变筛选抗老化能力的菌株，筛选获得一株A27菌株，其发酵能力比诱变前提高了15.8%.Bourens 等[13]以絮凝性弱而其他发酵指标皆可的啤酒酵母菌为出发菌株，以激光-氯化锂为复合诱变剂诱变啤酒酵母得到一株絮凝性适中的啤酒酵母，絮凝性为37.9%，比原菌株提高了1.61倍.物理诱变具有操作简单、高效、无污染、变异率高和易推广等优点.但有些物理诱变方法如高压、超声波和高能离子束以及X射线等方法虽诱变效果很好，但电离性和穿透力都很强，如果不是专业的技术人员在相应的设备中操作，危险性较大.2.2.2化学诱变用化学诱变剂处理酿酒酵母，从而使酿酒酵母的基因突变率大幅提高，然后根据育种目标培育出新品种.Theis等[14]以啤酒酵母X为出发菌105第３６卷河南工业大学学报（自然科学版）株，用亚硝基胍（NTG）和甲基磺酸乙酯（EMS）连续诱变，通过初筛及复筛，得到一株产蛋白酶A活力低的啤酒酵母突变株GM235.与出发菌株X相比，GM235发酵的啤酒正丙醇含量高于出发菌株，蛋白酶A活力降低了19.83%，异戊醇和总高级醇分别降低了5.03%和4.87%.化学诱变育种是一种经济方便的育种方法，并且不同化学诱变剂对染色体、基因等的诱变还具有专一性.但是化学诱变剂大多是致癌物质，使用者必须做好防护措施.2.2.3航天诱变航天诱变育种是指利用高空气球或往返式航天器等能达到的空间环境对酿酒酵母的诱变作用而进行育种的方法.Vigentini等[15]对经航天诱变的啤酒酵母菌进行复壮，并对复壮后的酵母菌株从细胞大小、菌落形态、发酵力以及增殖情况等几方面进行了筛选.试验结果表明，诱变后菌株的发酵力、生长速度均优于出发菌株.航天诱变育种是集航天、生物、育种等技术为一身的尖端育种方法，具有育种周期短、突变率高、安全无污染等优点. 2.3原生质体融合育种原生质体融合是指将两个不同的酿酒酵母细胞通过酶解脱壁，在高渗条件下形成球形原生质体，然后由聚乙二醇（PEG）促融.原生质融合育种是利用两株酿酒酵母细胞质间相互融合时两套基因组会发生接触与交换，导致基因组间进行遗传重组，从而获得融合了两亲本优良性状的新酿酒酵母菌株的一种育种方法.Stanley等[16]将生产用的两种啤酒酵母分别进行单倍体化，再利用PEG 进行融合.经试验证明融合子是一株口味独特、发酵度高、絮凝性强、遗传性能稳定的啤酒酵母新菌株.Clemente等[17]用F-20-7与酒类酒球菌SD-2a 进行融合，获得的融合子降解苹果酸的能力高达85%，比已有报道的最高降酸率高出7%，与酒球菌的降酸能力不相上下.由此可知，原生质体融合育种可使基因重组的频率大幅提高.此外，原生质体融合育种还克服了远缘杂交不亲和等难题.2.4杂交育种杂交育种是指将具有不同优良性状的酿酒酵母个体间进行杂交，使控制优良性状的遗传物质进行重新组合，然后在其杂种后代中分离挑选出具有双亲优良性状纯合子的育种方法.Pawel等[18]用选自乳清的酿酒酵母与葡萄汁酵母为亲本进行杂交，获得的杂合子同时具有分解苹果酸能力强和生成乙酸能力弱的特点，其降酸能力提高了20%左右.Kapsopoulou等[19]曾将一株絮凝性强酵母与一株不产SO2的酵母杂交获得了一株絮凝性比较强且不产SO2的酵母，并用于生产中.杂交育种不仅扩展了变异范围，而且克服了酿酒酵母菌株在经历长期诱变剂处理后造成的菌株生长活力降低、生长周期变长、孢子量锐减、代谢缓慢、产量和性状难以继续提高等缺陷，并且杂种后代的生活能力、适应性和抗逆性都很强.但杂交育种还存在着不易产生新的基因且操作方法复杂、对技术和设备要求高、优良性状的分离和育种的周期长等不足.2.5基因工程育种基因工程不仅能改变原有的基因，甚至能创造新的物种.基因工程在微生物育种方面的技术目前已经相当成熟[20-24].基因工程就是在分子水平上将具有某种优良性状的外源目的基因（遗传物质片段）在体外经限制性内切酶与连接酶的“剪接”作用后，再与特定载体构成重组分子，然后插入酿酒酵母菌基因的特定位置中，并使这个目的基因能在酿酒酵母细胞内进行稳定的复制、转录、翻译和表达的一种育种技术.Caruso等[25]从S. cerevisae和S.nvarum品系中克隆编码乙醇乙酰转移酶的基因，转导至酵母细胞中，乙醇乙酰转移酶表现出高活性，提高了啤酒中乙酸戊乙酯和乙酸乙酯等产香气物质的生成，啤酒的香味更强烈.基因工程育种最大的优点是不受种属限制、可按照人们的需要对菌种进行定向改造.但是，基因工程育种对技术要求高，且外源基因的表达可能影响酿酒酵母的酿造特性，还有可能引起生态危机.2.6代谢工程育种代谢工程是指通过基因工程的手段改变酿酒酵母细胞的代谢途径[26].利用代谢工程方法对酿酒酵母进行改造育种时，首先要分别从酿酒酵母细胞的基因、RNA、蛋白质、代谢物、代谢通量等多个层次对酿酒酵母的代谢流量及代谢控制进行定量且系统的分析，寻找出最佳的代谢途径，然后再利用DNA重组技术和相关遗传学手段对酿酒酵母的细胞进行遗传修饰，例如改变酿酒酵母基因的结构、删除不良基因或加入新的优良基因等，从而合理设计出细胞的代谢途径.Hontz等[27]利用构建酵母菌-大肠杆菌穿梭质粒，将柄状毕赤酵母依赖木糖还原酶和木糖醇脱氢酶基因导入酿酒酵母菌体内，获得的转化子能同时有效的将木糖和葡萄糖转化为乙醇.代谢工程育种能扩展代谢途径、重新分配代谢流、转移或构建新的代谢途径，从而改变酵母菌种的底物利用，提高生产可操作性，减少有害副产物产生.106第６期3酿酒酵母的鉴定方法3.1传统鉴定传统的酿酒酵母的分类鉴定主要根据细胞繁殖类型，产孢子状况，菌落的颜色、大小和形态等，以及生理生化试验，再参照《酵母菌的特征和鉴定手册》和《微生物分类学》，进行相关菌种的鉴定.传统鉴定不仅工作量大、周期长、操作复杂且鉴定结果的重复性差[28-30].3.2现代分子鉴定现代分子鉴定法主要以核酸作为研究对象，研究的是基因型，而非表现型，因此能反映其遗传本质[31-33].现代分子鉴定法具有稳定性好、易确定同源关系、便于计算机分析等优点，不仅提高了鉴定的准确度，而且缩短了鉴定时间.近年来，随着分子生物学的高速发展，兴起了很多新的酿酒酵母鉴定方法，接下来对几种常见的酿酒酵母现代分子鉴定方法进行简单介绍.3.2.1DNA同源性分析不同酿酒酵母菌株之间的亲缘关系越远，那么它们之间共有的相同核苷酸序列就越少.研究表明[34]，同源率在70%以上代表同一种，同源率在40%～70%之间的代表同一种内亲缘关系比较远的菌株，在40%以下则被认为代表不同的种.采用分子杂交的方法就可以找到两株酿酒酵母之间的DNA同源序列，进而可知道同源百分率的高低. DNA 同源性分析方法不仅可以区分不同的酵母菌种，而且还能区分酿酒酵母种内不同菌株的亲缘关系远近.3.2.2脉冲电场凝胶电泳核型分析酿酒酵母的核型是指染色体的条数及大小，核型间接地反映了酿酒酵母所含有的遗传物质的多少及其组织形态，且会随物种的分化而变化[35-37].脉冲凝胶电泳核型分析是利用琼脂糖凝胶电泳可在凝胶中分离出完整的酿酒酵母染色体DNA，之后便可测定酿酒酵母细胞染色体条数及每条染色体DNA分子的大小.Andrea等[38]通过脉冲电场凝胶电泳分析并发现，在电泳核型上，酿酒酵母、贝酵母和巴氏酵母与少孢酵母具有很显著的差异.此方法是一种快捷、方便、有效的辅助手段.但在进行分类鉴定时必须以形态、生理、生化等指标为基础.3.2.3核糖体DNA序列分析酿酒酵母的核糖体RNA中包括26S、18S、5.8S 和5S4种不同沉降系数的核糖体RNA片段，其对应的基因片段在遗传上既相对稳定性又有一定的突变性.大亚基上的26S rDNA分子可分为D1、D2、…、D12等多个区域，但D1/D2区域序列的长度适中，适于酿酒酵母的鉴定.此外，酿酒酵母的ITS基因具有进化速度快、多态性等特点，适合亲缘关系较近菌株间的鉴定[39-42].Escot等[43]从酿酒葡萄产区采集了99份葡萄果粒利用菌落特征、细胞形态、生理生化特征结合26S rDNA D1/D2序列进行鉴定，成功将菌株鉴定.Romano等[44]通过26S rDNA D1/D2区域分析的方法，分析鉴定了自甘肃莫高葡萄酒厂分离的29株非酿酒酵母菌.核糖体DNA序列分析法在酿酒酵母菌种分类鉴定中效果很好.3.2.4PCR-RFLPDNA限制性内切酶作用片段多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）是指每种DNA限制性内切酶都有特定的作用位点，酿酒酵母5.8S rRNA基因及两侧的转录间隔区（ITS）具有显著的种间差异性，将PCR扩增的基因组DNA用特定的限制性内切酶酶解后电泳分离可获得高度多态性的图谱，通过与模式菌株的图谱比较从而对菌株进行鉴定.Patel等[45]用5.8S-ITS 区域的PCR-RFLP方法结合ITS序列分析，得到东北山葡萄酒发酵酵母的19种酶切图谱，进行的分子鉴定的结果与已知的酵母种类完全一致.由此说明此方法鉴定结果准确、简便、快捷.除上述几种方法外，DNA G+C摩尔百分含量分析、等位酶分析、线粒体DNA限制性酶切分析、DNA微卫星分析、DNA的RAPD分析、巢式PCR 扩增、rDNA序列分析、可溶性蛋白酶分析、显微傅里叶变换红外光谱分析等[46-49]也是酿酒酵母现代分子鉴定的常用方法.4酿酒酵母的应用概况酿酒酵母虽然形态简单但其代谢产物多、生理结构复杂且富含多种生理活性物质和营养成分，在酿造、医药保健、饲料、能源化工以及生命科学研究等领域中广泛应用.4.1酿酒酵母在酿酒工业中的应用由于酿酒产业是我国的支柱产业之一，因此酿酒酵母在国民经济中有着举足轻重的作用[50].酿酒酵母所酿酒的种类繁多，如白酒、啤酒、黄酒和果酒等，并且形成了各种类型的名酒，如贵州茅台酒、绍兴黄酒、青岛啤酒和张裕解百纳等.一般来说，酒的品种不同，所用的酿酒酵母以及酿造的工艺也不同.但就算是同一类型的酒，不同的地区也有独特的酿造工艺和不同的风味[51].王卫国，等：酿酒酵母的选育及其应用研究进展107第３６卷河南工业大学学报（自然科学版）4.2酿酒酵母在医疗保健中的应用我国古代就有用酿酒酵母来治疗疾病的记载[52]，中医将其称为“神曲”.现代医药上将酿酒酵母制成酵母片，即市售的食母生片，可用于提高新陈代谢机能，治疗消化不良症、肝脏疾病和药物中毒以及白血球减少症和肝炎等疾病.另外，酿酒酵母还可作为一些微量元素的载体，如在酵母培养过程中，添加硒可用于治疗克山病、大骨节病和防止细胞衰老，添加铬的酿酒酵母可用于治疗糖尿病等.在医药生产中，可从酿酒酵母细胞中提取凝血脂、麦甾醇（纤维素的前体）、卵磷脂、核酸、核苷酸、多糖、氨基酸、谷胱甘肽和核苷类药物等多种生化药物[53].此外，利用现代分子生物学技术可以制备相应的基因重组酵母育苗，为攻克及预防相关疾病提供试验支撑.4.3酿酒酵母在饲料生产中的应用酿酒酵母蛋白质含量高达50%以上，在畜牧业中一直作为单细胞蛋白的主要来源而被广泛使用.单细胞蛋白是从含蛋白的微生物中提取的蛋白质，具有促进动物的生长发育、缩短饲养期、增加肉量和蛋量、改善肉质和提高瘦肉率、改善皮毛的光泽度和增强幼禽的抗病能力的作用.此外，酿酒酵母还存在于动物肠道中，不仅可以提高反刍动物对饲料干物质、纤维素、半纤维素、蛋白等有机物和磷酸的消化率，增强机体的免疫力，还能提高饲料中矿物质利用率，有助于动物充分利用饲料中的养分.随着家畜摄入酿酒酵母量的增加，酿酒酵母会在家畜的肠胃道上大量繁殖，可有效改善家畜肠胃的菌群结构，增强家畜的免疫力和抗病力.4.4酿酒酵母在能源化工中的应用酿酒酵母在能源化工中主要用于生产酒精，酒精除了可作为“绿色”燃料外还是许多化工行业中不可缺少的基础原料和溶剂，如合成橡胶、聚丙乙烯、乙二醇、冰醋酸、苯胺、聚氯乙烯、乙醚、脂类、环氧乙烷和乙基苯等化工产品.另外，酒精还是香料、染料、油漆、树脂等工业生产部门必不可少的有机溶剂，还可作为珠宝、钟表等的洗涤剂.酒精也是生产和加工油漆和化妆产品中不可缺少的溶剂.我国农副产品资源丰富，把农副产品用于工业酒精生产也是农产品深加工和保护环境的一条有效途径[54].4.5酿酒酵母在生命科学研究中的应用酿酒酵母与动、植物同为真核生物，且全基因组比较小、遗传背景相对清楚，因此被广泛作为真核模式生物[55].通过对酿酒酵母基因进行连锁分析、定位克隆和测序验证等一系列检测后就可获得与人类某些疾病相关的基因序列，使构建精细的遗传图谱成为可能，可大大提高人类基因遗传性疾病（如糖尿病、小肠癌等）的诊断和治疗水平.酿酒酵母作为真核生物的模式菌株，与分子生物学技术结合后会使人类对真核生物的功能基因组信息、生物信息学、蛋白组学、DNA芯片、基因敲除、药物基因等方面的研究更加深入，同时还有助于菌株的改良.5存在的问题和解决办法5.1存在的问题目前酿酒酵母在选育和研究应用中还存在以下问题：⑴酿酒酵母各种耐受性的机理还不清楚，有关耐低温、耐酒精、耐高渗等的研究很多，虽然在应用研究上，通过添加培养基成分、改变培养条件以及菌种选育等方式已使酿酒酵母各种耐受性大大提高，但耐受性的机理还不清楚.⑵研究和应用还局限于传统领域，还需扩展.⑶缺少酿酒酵母在工业生产中不同胁迫因素之间相互影响的研究，酿酒酵母在工业生产中除了受乙醇的毒性影响外，还受到高温、高渗透压等胁迫因素的影响，目前的研究大都是单一胁迫因素对乙醇发酵性能的影响，很少研究各胁迫因素之间的联系.⑷已取得研究成果未能在生产中应用，例如啤酒废酵母对重金属的生物吸附应用没能在实际生产生活中大规模。

一种高产角鲨烯的酿酒酵母菌、应用及其选育方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202111273469.9(22)申请日 2021.10.29(83)生物保藏信息CCTCC NO M20211191 2021.09.17(71)申请人湖北冠众通科技有限公司地址 434400 湖北省荆州市石首经济开发区金平工业园粟田大道129号(72)发明人陈强　刘登辉　向景　刘传春　(74)专利代理机构武汉知产时代知识产权代理有限公司 42238代理人万文广(51)Int.Cl.C12N 1/18(2006.01)C12N 13/00(2006.01)C12N 15/01(2006.01)C12N 1/36(2006.01)C12N 1/02(2006.01)C12P 5/02(2006.01)C12R 1/865(2006.01)(54)发明名称一种高产角鲨烯的酿酒酵母菌、应用及其选育方法(57)摘要本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种高产角鲨烯的酿酒酵母菌、应用及其选育方法。

酿酒酵母GS ‑A3(Saccharomyces cerevisiae)保藏编号为CCTCCNO M20211191，于2021年9月17日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。

本发明的酿酒酵母GS ‑A3在发酵生产角鲨烯中的应用，产量高，周期短，具有产业化潜力。

权利要求书1页说明书4页序列表1页附图2页CN 114058522 A 2022.02.18C N 114058522A1.一株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，其特征在于，酿酒酵母GS ‑A3保藏编号为CCTCC NO M20211191，于2021年9月17日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。

2.权利要求1所述酿酒酵母GS ‑A3在生产角鲨烯中的应用。

3.如权利要求2所述酿酒酵母，其特征在于，酿酒酵母GS ‑A3角鲨烯干重产量为5.36mg/g DCW。

抗老化啤酒酵母的选育

抗老化啤酒酵母的选育
李崎;顾国贤;柏竹安;章克昌;潘学启
【期刊名称】《食品与生物技术学报》
【年(卷),期】1998(017)004
【摘要】以无锡轻工大学生物工程学院保藏的一株啤酒酵母为发菌株，经紫外线诱变及蛋氨酸连续驯养后，选育得到一株抗老化性能较为优良的菌株Ｍ４，在１ｍ＾３发酵罐中的中试结果表明，与出发菌株相比，其羰基化合物（ＴＢＡ）含量降低１９．１％，谷胱甘肽（ＧＳＨ）含量增加２９．６％，在不改变其它生产条件的情况下，啤酒风味稳定性提高９２％，工业应用前景良好。

【总页数】4页(P46-49)
【作者】李崎;顾国贤;柏竹安;章克昌;潘学启
【作者单位】无锡轻工大学生物工程学院;青岛啤酒股份有限公司科研中心
【正文语种】中文
【中图分类】TS262.5
【相关文献】
1.抗老化啤酒酵母菌株的诱变选育 [J], 赵换英;陈叶福;王晓琼;秦伟军;郭学武;肖冬光
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3.构建高产谷胱甘肽啤酒酵母基因工程菌提高啤酒抗老化能力的研究 [J], 蒋凯;李崎;顾国贤
4.选育抗老化啤酒酵母提高啤酒风味稳定性的研究 [J], 李崎;潘学启;顾国贤
5.低乙醇脱氢酶Ⅱ活性的抗老化啤酒酵母工程菌的构建 [J], 蔡勇;母茜;王肇悦;张博润;晏本菊
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紫外线诱变选育酸性α-淀粉酶高产菌株

紫外线诱变选育酸性α-淀粉酶高产菌株
游玟娟
【期刊名称】《江苏调味副食品》
【年(卷),期】2010(027)003
【摘要】为了提高菌株产酶能力,研究了紫外线处理对枯草芽孢杆菌BF 7658产酸性α-淀粉酶的影响.结果表明:采用30 W紫外线照射90 s获得较好的突变效果,利用变色圈法初筛结合摇瓶发酵复筛,筛选得到一株理想的突变株UV-12,其酶活为3418.8 U/mL,比出发菌株提高了59.7%.对UV-12进行紫外线二次诱变,酶活提高不显著,表现出一定"抗性".
【总页数】3页(P9-11)
【作者】游玟娟
【作者单位】湖南化工职业技术学院,湖南株洲412004
【正文语种】中文
【中图分类】TS201.3
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2.酸性α-淀粉酶高产菌株的原生质体诱变选育 [J], 褚清龙;刘新育;吕向云;陈红歌
3.N+离子注入诱变选育耐酸性α-淀粉酶高产菌株 [J], 蔡兴旺;杜连祥;路福平
4.紫外线与硫酸二乙酯复合诱变选育酸性蛋白酶高产菌株 [J], 温拥军;冯刚利;鄢东
5.河内白曲霉酸性α-淀粉酶高产菌株的诱变选育 [J], 张玉然;张晓云;郭兰英;张海林
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高产酒率酿酒酵母单倍体分离和杂交育种

单倍体的获得
诱导孢子形成的方法将酿酒酵母菌株于YPD固体斜面上28℃培养48h活化，活化两次后接入产孢培养基，25℃培养3一7天，在显微镜下观察子囊孢子形成情况，计算一个视野内酵母总数和子囊孢子数，并计算产孢率。产孢率(%)=子囊孢子数量/总细胞数子囊孢子分离和单倍体的获得菌株活化后接入产孢培养基，3天后镜检观察，无菌水(2ml)倾于斜面上，用接种环刮下菌体，收集菌悬液于7ml离心管中，6000rpm离心 10min收集菌体。0.85%生理盐水悬浮洗涤1~2次，分别加入 0.7mlTris一Hcl(pH8.0， 0.01M);200ul 10%蜗牛酶(终浓度为0.02):l00ul 10%琉基乙醇(终浓度为 0.01)，120rpm(缓慢振荡)培养16h破子囊壁，使孢子释放。利用孢子比营养细胞耐热特性，采用58℃高温致死处理营养细胞，离心收集孢子，并用Tris 一HCI(pH8.0，0.01M)洗涤两次。取适当稀释倍数，涂布于YPD平板上，28℃ 培养2一3d。单倍体的鉴定培养后挑取小菌落，镜检观察是否为单倍体。将获得的疑是单倍体再接入产孢培养基，培养7天左右观察子囊形成，以确定是否为真正的单倍体。有子囊形成者基本确认为二倍体，不形成子囊者基本确认为单倍体。把确定为单倍体的菌株分别保种(YPD斜面、甘油管)。
→
长期以来，提高酵母酒精发酵的得率不外乎探索新发酵工艺和选育高产酿酒酵母菌株。高产菌株的选育主要是从自然界或已知能产酒精的酵母中分离筛选。从自然界筛选的野生酵母一般很难具有用于发酵工业生产的理想特性，需要进一步的驯化培养和利用育种技术进行改良，使其达到工业大生产的要求。诱变育种是菌种选育的重要方法之一，通过各种物理和化学因子诱变，能够得到性能增强的酵母菌株。随着原生质体融合和基因工程技术的不断成熟，采用原生质体融合和重组DNA技术实现高产酒率酿酒酵母菌株的构建，其研究报道屡见不鲜。通过代谢工程手段阻断酿酒酵母甘油的合成或降低甘油的合成的报道。可见工业微生物优良菌株的选育从自然选择、驯化育种、诱变育种、杂交育种、代谢调节育种发展到基因工程育种，在减少盲目性、省时、降低工作量、提高选育效率等方面已取得长足的进步。工业微生物遗传育种，选用哪种或先后采用哪几种方法为宜，应根据所用菌株的特性，目的产物生成的代谢途径与调控模式、工业化实际应用时的工艺条件等因事制宜，具体把握。酿酒酵母属真核生物，结构组成与代谢调控体系复杂。酿酒酵母酒精发酵的代谢，属细胞基础代谢范畴，酵母细胞高效率吸收利用可发酵性糖生长代谢生成乙醇的效率受细胞全能性调控网络协调控制，属本源性多基因、多步骤、全局性高度协调的基因表达调控模式。因此，要人为地方向明确地提升其代谢水平，又要使其良好适应环境多变的大规模工业生产条件并收到实效，技术难度极其大。作者所在实验室曾用高温热击、多级诱变为主的技术途径，在技术创新上有所突破，成功选育耐高温、高转化率酒精生产菌株，并在酒精工业上实际应用，取得较显著的经济与社会效益。该技术体系虽目前与今后仍不失为一种行之有效的高产酵母选育方法，但该研究成果的问世几近十年，工耗大、费时多、周期长和效率低。

高产酒精酵母菌种的选育

失重 (g)
310 318 315 218 513 412
产 CO2 量 (mL) 产酒精度 %(V/ V)
116
1011
118
1015
214
1112
211
1112
218
1118
118
1115
L Y- 15 菌株经过多次分离纯化 ,酒精发酵产酒度稳定在 1115 %(v/ v) 以上 ,经初步鉴定该菌株属于酿酒酵母属 ,以 L Y- 15 菌株为出发菌株进行诱变育种。 21112 菌种的诱变
11115 分析方法
1111511 突变株发酵性能的测定
菌株经扩大培养后 , 接种发酵培养基 ,32 ℃培养 60 ～
68h ,测定酒精度、残还原糖、真正糖、外观糖、酸度等。
1111512 酵母发酵力测定
酵母发酵力测定采用发酵栓法。100mL 三角瓶中装麦
芽汁 50mL ,灭菌后接入 015mL ,在 28 ℃生理盐水中饥饿 2h 的
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·58 ·
酿酒 2003
处理 ,然后稀释涂布平板 ,32 ℃培养 2～3d ,挑取单菌落。
将斜面菌种一支接一瓶 ,移种到 50mL/ 100mL 三角瓶中 , 称取重量 ,32 ℃静止发酵 48h 称重 ,计算减重 ,选取失重量大的菌株。 1111313 最低乙醇致死浓度实验
艾氏发酵管灭菌以后 ,装入无菌麦芽汁 ,然后添加 95 % 的乙醇和无菌水 ,使各管的乙醇浓度分别为 12 % ,13 % ,14 % ……等 ,各管的糖度保持一致 ,然后接种基本相同的菌种浓度 ,置 32 ℃培养 ,观察菌种生长和产气情况 ,确定各菌株的乙醇致死最低浓度。 1111314 耐乙醇度实验

耐高温酿酒酵母的选育及其在乙醇发酵生产中的应用

耐高温酿酒酵母的选育及其在乙醇发酵生产中的应用齐显尼;甘雨满;王钦宏【摘要】酿酒酵母是乙醇发酵工业的生产菌株,增强菌株的耐温性可以减少乙醇生产中降温带来的成本等问题,保证工业发酵能在高温下正常进行.介绍了耐高温酿酒酵母的常用的和新兴的育种技术方法及主要进展,以及在以玉米、甘蔗、木薯及纤维素为原料的乙醇高温发酵生产中的应用,并讨论了耐高温酿酒酵母的选育工作的挑战和乙醇工业应用前景.【期刊名称】《生物产业技术》【年(卷),期】2018(000)004【总页数】6页(P84-89)【关键词】酿酒酵母;耐高温;育种;高温发酵;乙醇生产【作者】齐显尼;甘雨满;王钦宏【作者单位】中国科学院天津工业生物技术研究所,中国科学院系统微生物工程重点实验室,天津 300308;中国科学院天津工业生物技术研究所,中国科学院系统微生物工程重点实验室,天津 300308;中国科学院天津工业生物技术研究所,中国科学院系统微生物工程重点实验室,天津 300308【正文语种】中文酿酒酵母是被人类开发利用最早的，在酿酒工业、乙醇生产及食品工业等行业应用广泛的重要发酵微生物[1]。

但在工业生产过程中，酿酒酵母经常会面对多种环境因素的胁迫作用[2]，包括高温、渗透压和乙醇胁迫等。

这些胁迫会诱导基因调节作用，会改变细胞的许多重要生理功能，从而影响生物转化过程的效率。

传统的酿酒酵母乙醇发酵的最适温度在28～33℃，一般不会超过35℃。

在我国南方及盛夏时的北方，气温常达到40℃以上（甚至45～50℃），这会严重抑制酵母菌的生长、代谢，进而影响产品质量和产量，阻碍乙醇工业发展。

另外，乙醇发酵生产过程为放热反应，在标准压力、标准温度下，乙醇的标准摩尔生成焓是-227.69kJ/mol，生产1t乙醇共释放1 728 260kJ热量，为维持酵母的最适生长温度（30℃）需要额外提供68.9t冷却水并配置相应的冷却设备。

升高发酵温度可以减少冷却水的使用，降低生产成本。

发酵制药技术-应用紫外线诱导筛选耐高糖的谷氨酸高产菌株

发酵制药技术-应用紫外线诱导筛选耐高糖的谷氨酸高产菌株
试验目的
通过紫外线诱变筛选耐高糖的谷氨酸高产菌株
试验原理
• 紫外线是一种最常用的物理诱变因素。 • 主要作用是使DNA双链之间或同一条链上的
两个相邻的胸腺嘧啶形成二聚体，阻碍双链的分开、复制和碱基的正常配对，从而引起突变。
• 操作在红光下进行，并且将照射处理后的微生物放在暗处培养。
• 加菌悬液 • 紫外线照射
对紫外线照射时间做水平试验，40s、60s、 80s、100s、120s 照射计时从培养皿开盖起，加盖止；从紫外线照射处理开始，直到涂布完平板的所有操作都必须在红灯下进行。 • 稀释菌液及涂布选择性培养基
• 稀释分离
纯种分离方法
倾注平板法
涂布平板法
培养
• 将涂布好的平板用黑纸包好，倒置，于32 摄氏度培养48h
• 选择培养基是指根据某种微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基。其功能是使混合菌样中的劣势菌变成优势菌，从而提高该菌的筛选效率。
意义
• 耐高糖菌种的选育对发酵工艺上提高发酵培养基初糖浓度具有积极的意义。
操作步骤
• 菌悬液的制备
诱变处理
• 预热紫外灯预热20min，使紫外线强度稳定
• 谷氨酸棒杆菌是谷氨酸生产菌种，是生物素缺陷型菌株。
• 生物素缺陷型菌株是指只有在加入了生物素的培养基中才能生长的菌株。
• 生物素（Biotin）为B族维生素之一，又称维生素H、维生素B7、辅酶R等。
• 菌种通过紫外线诱变处理后利用含有茚三酮的高糖选择性平板培养，耐高糖、产酸的菌株不但能够在平板上长出菌种，而且菌落周围呈现红色。根据平板上菌种生长请款可以得到耐高糖产酸的突变株，再经过摇瓶初筛、复筛可获得耐高糖、高产的突变株。

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紫外诱变选育高产酒精及酸的酿酒酵母王犁烨S陈新军2,卢丕超2,刘维兵S高飞1，马珊3,张颖4,武运^(1.新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐830052;2.新疆中信国安葡萄酒业有限公司，新疆昌吉832200;3.新疆维吾尔自治区科技项目服务中心,新疆乌鲁木齐830011;4.吐鲁番市质量与计量检测所，新疆吐鲁番838000)摘要:利用紫外辐照的方式对从葡萄表面筛选的菌株¥6进行诱变，选育出产酒精能力强、产酸能力高并且发酵性能稳定的酿酒酵母菌株。

通过单因素试验选择酵母菌株距30 W紫外灯30 cm照射100 s，致死率为75.62%为最佳诱变条件。

采用三苯基氯化四氮唑(TTC) 法和溴甲酚绿法以及杜氏小管筛选出产酒精和产酸强的目标菌株Y6-5,并对其遗传稳定性进行研究。

结果表明，诱变菌株Y6-5与出发菌株Y6相比较，其产酒精、产酸能力分别提高了28.13%和201.41%，并且遗传稳定性良好。

关键词:紫外诱变;酿酒酵母;产酸;产酒精中图分类号:TS261.1 文章编号:0254-5071 (2019)01-0104-05 doi:10.11882/j.issn.0254-5071.2019.01.021引文格式:王犁烨，陈新军，卢丕超，等.紫外诱变选育高产酒精及酸的酿酒酵母[J].中国酿造，2019,38(1): 104-108.Breeding of Saccharomyces cerevisiae with high-yield alcohol and acid by ultraviolet mutation WANG Liye1, CHEN Xinjun2, LU Pichao2, LIU Weibing1, GAO Fei1, MA Shan3, ZHANG Ying4, WU Yun1* (l.C ollege o f F ood Science and Pharmacy，Xinjiang Agricultural University，Urmuqi 830052, China; 2.CITIC Guoan Winery Co.，Ltd.，Changji 832200, China; 3.Science and Technology P roject Service Center o f X injiang Uygur A utonomous Region，Urmuqi 830011，China;4.Turpan Quality and Quantity I nspection Institute, Turpan 838000, China)Abstract： The strain Y6 screened i^om the grape surface was mutagenized by ultraviolet irradiation, and the Saccharomyces cerevisiae strains with high alcohol production ability, high acid production ability and stable fermentation performance were screened. The optimal mutagenesis condition of yeast strain was 30 W, 30 cm, 100 s by single factor tests and the lethality rate was 75.62%. The mutant strain Y6-5 with strong alcohol and acid production was screened by triphenyltetrazolium chloride (TTC) method, bromocresol green method and Duchenne tubule. At the same time, the genetic stability of t he mutant strain was studied. The results showed that compared with the original strain Y6, the alcohol and acid-producing ability of m utant strain Y6-5 was increased by 28.13% and 201.41%, respectively, and the genetic stability of t he mutant strain was good.Key words： ultraviolet mutagenesis; Saccharomyces cerevisiae; acid production; alcohol production酵母菌是泛指能发酵糖类的各种单细胞真核微生物，主要分布在含糖质较高的偏酸性环境[1]。

酵母菌与人类关系密切，是人类实践中应用较早的一类微生物，被运用于酿造、食品、医药等方面[2]。

通常从自然界分离得到的野生菌株在发酵性能和功能上都具有一定的局限性，因此研究人员通过对已知菌株进行诱变，从基因层面上改变酵母菌的性质及功能，从而达到生产需要[36]。

目前，常用的诱变方式包括物理方式和化学方式，紫外线诱变(ultraviolet mutagenesis，UV mutagenesis)是常见的物理诱变方式，广泛用于微生物菌种的诱变处理，并且有着悠久的历史[7-8]。

紫外线能量低，对核酸造成的伤害比较单一，具有操作简便、效率高、安全性好、诱变效率高等优点，在避光条件下诱变结束后已产生突变的性状不易恢复，因此应用较广泛[9-10]。

新疆地区生态环境独特，区位优势明显，是发展酿酒葡萄的理想产区[11]。

但由于新疆夏季光照时间长，光照强度大，所以葡萄酸度低，对葡萄酒的品质产生一定影响。

试验以从葡萄表面筛选的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株Y6为出发菌，通过紫外诱变对其发酵性能进行改造，以期获得高产酒精及酸且发酵性能稳定的目标酿酒酵母菌株，通过微生物代谢来增加葡萄酒的酒精度和酸度，以期提高新疆葡萄酒品质。

1材料与方法1.1材料与试剂1.1.1菌株出发酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株Y6:新疆农业大学食品科学与药学学院微生物实验室提供。

1.1.2化学试剂收稿日期：2018-08-13 修回日期：2018-11-05基金项目：新疆维吾尔自治区重大科技专项(2017A01001-2)；新疆农业大学大学生创新项目作者简介:王犁烨(1993-),女，硕士研究生，研究方向为食品营养与安全。

*通讯作者:武运(1965-),女，教授，硕士，研究方向为食品营养与安全。

酵母浸粉、蛋白胨、琼脂粉：北京奥博星生物技术有限责任公司；葡萄糖、无水乙醇：天津市致远化学试剂有限公司；2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC):上海蓝季生物科技发展有限公司；溴甲酚绿:天津市北联精细化学品开发有限公司；马铃薯葡萄糖琼脂：青岛高科园海博生物技术有限公司；磷酸二氢钾 (KH2P〇4)、硫酸镁(MgSOWHO):天津市光复科技发展有限公司；实验所用试剂均为分析纯或生化试剂。

1.1.3培养基TTC上层培养基:0.05 g TTC,0.5 g葡萄糖,2 g琼脂，100 mL蒸馈水，121 °C灭菌 15min。

TTC下层培养基：10 g/L葡萄糖，2 g/L蛋白胨，5 g/L 酵母浸粉，1g/L KHPO4,0.4 g/L MgSO,7H20,20 g/L琼月旨，1000 mL蒸馈水，调pH值为5.5〜5.7,121 C灭菌15 min。

马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar，PDA)培养基:6 g/L马铃薯浸粉，20 g/L葡萄糖，20 g/L琼脂，1000 mL 蒸馈水，调pH值为5.6〜5.8,115 C灭菌20 min。

酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose，YPD)培养基:20 g/L葡萄糖，20 g/L蛋白胨，10 g/L酵母浸粉，20 g/L琼脂，1000 mL蒸馈水，121 C灭菌15 min。

溴甲酚绿培养基:6 g/L马铃薯浸粉，20 g/L葡萄糖，20 g/L 琼脂，0.1 g/L溴甲酚绿，1 000 mL蒸馏水，调pH值为6.0, 115 C灭菌20 min。

1.2仪器与设备FA2014N分析天平:北京东南仪诚实验室设备有限公司；LDZX-50KBS立式高压灭菌器：上海申安医疗器械厂；HR40-A2生物安全柜：青岛海尔特种电器有限公司；MJX-160-Z霉菌培养箱:上海博讯实业有限公司医疗设备厂;TU-1810紫外可见光光度计:北京普析通用仪器有限责任公司；FE20 PLUS pH计:梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司;PAL-1型手持糖度计:北京阳光亿事达科技有限公司;Y15全自动分析仪:美国Biosystem公司。

1.3试验方法1.3.1酵母菌的活化和菌悬液的制备将菌株Y6接种于YPD液体培养基中，于28 C条件下培养24 h；然后以2%的接种量接入YPD液体培养基中，于28 C 条件下培养24 h后，接种到YPD固体培养基中；其次挑选出菌落大，表面光滑，呈乳白色的单菌落为出发菌，接种到YPD固体培养基斜面上，在冰箱中保存;最后将斜面上的出发菌接种到YPD液体培养基，在28 C条件下培养24 h，重复两次制得菌悬液。

1.3.2Y6酵母生长曲线的测定将在YPD液体培养基中活化好的菌株Y6菌悬液以5%的接种量接种到YPD液体培养基中，在28 C条件下培养，每间隔2 h取一次样，在波长600 nm处测定吸光度值，以空白培养基为对照，根据测得的吸光度值绘制菌株Y6的生长曲线，确定菌株Y6的生长对数期。

1.3.3紫外诱变试验吸取4 mL处于对数生长期的菌悬液放入培养皿中，将培养皿放在距30 W的紫外灯30 cm处进行照射，照射时间分别为40 s、60 s、80 s、100 s、120 s、140 s、160 s，同时做空白对照组。

照射结束后，分别将每个平板中的菌悬液稀释 1011倍并涂布在3个YPD固体培养基上，在28 C避光条件培养48 h，防止光复活，平板计数，计算致死率，并随机选取诱变后的酵母菌斜面保藏，进行发酵实验[12]。