耐酒精酵母的筛选

摘要：从野外葡萄园土壤中采集土壤样品，在实验室中通过微生物培养，微生物的富集，菌种的分离、纯化，筛选出纯的酵母菌。

将筛选出的纯的酵母菌分组分别进行培养，进行耐酒精能力的比较。

培养到最佳时期的时候，分别测定各组酵母菌株培养基中酒精含量，筛选出耐酒精性能最好的菌株。

该超强耐酒精能力的优良菌株的成功筛选为酵母菌能高效利用发酵培养液提供了菌种来源，同时也为发酵后的酒精分离降低了难度和成本。

关键词：微生物；耐酒精；酵母；筛选；性能测定前言：随着化石能源的日趋匮乏及环境污染的加剧，开发一种绿色能源势在必行。

乙醇作为一种生产工艺成熟、生产原料来源广的替代能源日益受到人们关注。

尤其是燃料酒精作为清洁能源，原料资源可以再生，大大的刺激了酒精行业的发展。

用微生物法生产酒精的历史由来已久，并且生产工艺早已成熟。

目前乙醇的生产原料为玉米、小麦等粮食产品为主。

尽管用粮食生产酒精成本昂贵，但由于用纤维素作原料生产酒精的方法还不成熟，工艺过程很不完善，所以怎样提高粮食生产酒精过程中原料的利用率，是目前酒精发酵过程研究的一个重要方向，也是降低发酵生产酒精的重要措施。

因为酒精是酵母菌糖代谢产物，对酵母菌的发酵有一定抑制作用，当酒精成分达到10%左右时，酵母菌就停止繁殖，发酵过程也随之放慢。

在酒精发酵过程中，由于一般酒精酵母的耐酒精能力不强（耐酒精度一般为10%），导致酵母菌不能充分利用发酵原料，造成了原料的浪费，同时由于发酵液中酒精含量低，使得酒精后期的分离纯化过程复杂，从而大大增加了生产成本。

因此，耐高酒精度的酒精酵母的筛选具有非常重要的意义。

耐高酒精度的酒精酵母能够减缓产物的抑制作用，提升酒精酵母产酒精的潜力【1】。

耐酒精酵母可以在发酵液中较高浓度的酒精中不会死亡，并且仍然具有利用培养液发酵酒精的能力，从而提高酒精原料的利用率。

同时和一般酵母发酵相比，发酵产物中酒精的含量能达到18%左右，产物中原料和杂质的含量下降，产物中酒精的纯度增加，也使得酒精的分离提纯更加容易进行，从而使粮食生产酒精成本降低。

因此高耐性酒精酵母这一领域的研究工作一直在深入的进行，并且有了可喜的成果【2】。

耐酒精酵母的应用，使相同原料的酒精产量大大提高，从而使我国的酒精生产总量增加，改善我国酒精产品供应不足的状况，更好的为我国的国民经济服务。

酒精成本的降低，使得酒精能源能够得以广泛使用，缓解能源的危机，降低化石燃料的使用，减少日益严重的环境污染，改善我国恶劣的环境状况。

对我国经济的可持续发展有着深远的影响。

在查阅了大量文献资料的前提下，本文拟从自然界分离筛选一株耐酒精产酒精能力强的酵母菌株，使其应用于工业酒精发酵，提高酒精发酵的产率和质量，降低酒精生产的成本。

实验部分：1材料与试验方法：1.1材料：1.1.1样品来源：野外葡萄园中的土壤样品。

1.1.2菌株来源：从葡萄园中土壤样品中分离酵母菌株。

1.1.3培养基：1.1.3.1富集培养基：葡萄糖50 g,KH2PO42.5 g,Na2HPO4 0.5 g,(NH4)2SO4 1 g，尿素1 g,MgSO·47H2O 0.5 g，酵母膏0.5 g,FeSO4 0.1 g，孟加拉红（1%水溶液）3.3 mL，水定容至1000 mL。

若配制液体培养基，将其pH调至4.5；若配制固体培养基，则加琼脂15 g，然后调pH至5.5～6。

在112℃下灭菌30 min【3】。

1.1.3.2分离培养基：YPD(葡萄糖30g、蛋白胨15g、酵母膏15g)培养基【4】。

1.1.3.3初筛培养基：即TI'C显色培养基。

上层培养基为TTC 0.5 g，葡萄糖5 g，琼脂15 g，水1000 mL，自然pH[7]；下层培养基为葡萄糖10 g，蛋白胨2 g，酵母膏1.5 g，KH2PO4 1 g,MgSO4·7H2O0.4 g，琼脂20 g，水1000 mL，pH值5.5～5.7【4】。

复筛培养基：葡萄糖30％，酵母膏0．5％，蛋白胨0．5％，氯化铵0．15％，磷酸氢二钾0．15％，硫酸镁0．1％，氯化钙0．28％，0．06MPa灭菌15min【4】。

发酵培养基：玉米淀粉适度糖化后添加部分营养元素。

1.1.4实验仪器：高压灭菌锅；恒温培养箱；摇床；超净工作台；干热灭菌箱；全套接种工具；培养所用的玻璃器具。

1.1.5酶制剂：淀粉酶；糖化酶。

1.2试验方法：1.2.1菌种的富集培养：富集培养法可以创造一些条件只让所需微生物生长，在这些条件下，所需的微生物能有效地与其他微生物进行竞争，在生长能力方面远远超过其他微生物。

所创造的最适条件包括选择最适的碳源、能源、温度、pH等。

在相同的培养基和培养条件下，经过多次重复移种，最后富集的菌株很容易在培养基上长出单菌落【5】。

将配制好的富集培养基装入用干热灭菌箱灭菌后的三角瓶中，用高压灭菌锅进行彻底灭菌后冷却。

将采集到的样品加入到富集培养基中，于最是的温度条件下，放在摇床上（将培养基放在摇床上培养的目的是为了是菌体与培养基充分接触，使培养的菌种充分利用培养基的成分，同时使培养基中的菌种分布均匀。

）进行富集培养48小时，观察有无酵母菌细胞的存在，并且使培养基中酵母细胞增殖。

同时移种重复富集培养多次，使所需分离的酵母菌在固体培养基中长出单菌落。

1.2.2菌种的分离和纯化：1.2.2.1菌种得分离：从富集培养基上挑取酵母单菌落，在超净工作台的无菌环境中，在分离培养基上划线，将菌种接种到分离培养基上。

将分离培养基中添加适量的青霉素抑制细菌的生长，32℃培养48小时。

所得的酵母菌纯度已经很高。

然后进行酵母的纯化试验，得到纯种的酵母菌株。

1.2.2.2菌种得纯化：在超净工作台上，从分离培养基上挑取单菌落，接种到初筛培养基，通过染色，镜鉴获得纯种（不含任何杂菌）酵母菌株。

具体方法如下：个体形态观察：用美蓝染色法取对数生长期的菌体制片,在放大400倍及1000倍的显微镜下观察酵母形态,用测微尺测量酵母细胞的大小,并进行死活鉴别。

液体培养特征观察：用三角瓶装PD液300 mL，灭菌后，接种分离的酵母菌，于28℃培养并观察其特征。

菌落特征观察：将分离的酵母菌接种在PDA平板上，28℃保温培养48 h后观察菌落特征【5】。

（酵母菌的菌落形态特征细胞个体大，湿润，表面光滑，多数不透明，黏稠，菌落颜色单调，多数呈乳白色，少数红色，个别黑色。

酵母菌生长在固体培养基表面，容易用针挑起，菌落质地均匀，正、反面及中央与边缘的颜色一致。

不产生假菌丝的酵母菌菌落更隆起，边缘十分圆整；形成大量假菌丝的酵母，菌落较平坦，表面和边缘粗糙。

酵母菌细胞的形态通常有球形、卵圆形、腊肠形、椭圆形、柠檬形或藕节形等。

比细菌的单细胞个体要大得多，一般为1~5微米′5~20微米。

酵母菌无鞭毛，不能游动。

酵母菌具有典型的真核细胞结构,有细胞壁、细胞膜、细胞核、细胞质、液泡、线粒体等，有的还具有微体。

酵母菌的细胞形态酵母菌的细胞形态酵母菌细胞结构的显微照片酵母菌的菌落。

大多数酵母菌的菌落特征与细菌相似，但比细菌菌落大而厚，菌落表面光滑、湿润、粘稠，容易挑起，菌落质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜色都很均一，菌落多为乳白色，少数为红色，个别为黑色。

酵母菌菌落特征是分类鉴定的重要依据。

）通过细胞形态观察，挑去初筛培养基中具有典型酵母形态的细胞，在无菌条件下，划线接种到复筛培养基中，经过24小时的培养增殖，从而得到纯种的酵母菌菌落。

从而获得纯种的不含杂菌的酵母菌株，以便为后期筛选耐酒精酵母提供需要。

1.2.2耐酒精酵母的筛选1.2.2.1耐酒精能力的试验从复筛培养基中得到的分离纯化后的纯种酵母菌，在酵母菌株挑取对数期（对数期的菌种细菌代谢旺盛，个体的形态和生理特性比较稳定，细胞各成分平衡生长，生长速率恒定且最高，是发酵工业中用做种子的最佳材料。

）时的单菌落，在无菌条件下，接种到灭菌后的发酵培养基上，分别接种十二组酵母菌中进行耐酒精能力实验。

酵母菌中在发酵培养基上，吸收培养基的营养成分，首先进行菌种得繁殖。

等到菌种繁殖到足够数量的时候开始利用发酵培养基中原料进行发酵产生酒精。

等到大部分菌种到稳定期（有害代谢产物积累，新增细胞数目与死亡细胞数目达到动态平衡，次级代谢产物大量积累，形成芽孢。

此时期酵母细胞的发酵已基本停止，产生的酒精量达到最大值）的时候发酵停止，然后进行各个发酵培养基中酒精含量和酵母菌的存活率的测定。

1.2.2.2耐酒精能力的测定1.2.2.2.1酒精度的测定在各个培养基中各取100mL成熟发酵醪,加入100mL蒸馏水,置1000W 电炉上蒸馏出100mL液体,摇匀后用酒精计测定其酒度,然后查表校正为20℃酒精浓度【6】。

然后比较不同组分培养液中酒精的含量。

耐酒精能力的比较比较十二组试验中各组分中，培养基中酒精的含量，挑选出酒精含量最高的那组。

酒精含量高的培养基，可以说明该酵母的产酒精能力比一般的酒精酵母高。

1.2.2.2.2酵母存活率的测定：酵母细胞鉴定程序【7】。

（[7]欧阳谅．微生物学实验法[M]．南昌：江西人民出版社，1980．）酵母菌细胞数与死亡率的测定【8】：采用Neubauer血球计数板法计数。

[8]程丽娟.微生物学实验技术[M].天则出版社,1993选择出酵母存活率最高的那组菌株。

酵母存活率高，证明该酵母菌的耐酒精能力比一般酵母强。

1.2.2.3测定结果：通过各个发酵培养基中酒精含量和酵母菌的存活率的测定。

测定结果表明酒精含量最高的培养液和酵母成活率最高的培养液是同一培养液。

2结果与分析：2.1实验结果：2.1.1酵母菌中的分离纯化结果：实验结果表明，通过酵母菌的富集培养，分离培养，初筛培养和复筛培养，可以将野生酵母菌经过菌种的分离纯化得到纯种的用于耐酒精实验所需的酵母菌株。

2.1.2耐酒精酵母菌筛选结果：通过十二组发酵培养基中酵母菌的发酵实验，各个发酵培养基中酒精含量和酵母菌的存活率的测定，得到耐酒精能力远远高于一般酒精酵母的耐酒精酵母，筛选得到的这株耐酒精酵母的耐酒精含量可以达到18%。

根据上文的实验结果，表明酒精含量最高的培养液和酵母成活率最高的培养液是同一培养液。

由于耐酒精能力强的和产酒精量高的菌株是同一菌株，证明本实验的方法是正确的，获得了理想的酵母菌株。

2. 2实验分析：2.2.1正确实验思路和合理的实验步骤是整个实验过程的关键。

整个实验过程最重要操作是无菌操作，避免杂菌的污染是实验成功的关键。

无菌操作包括培养基的灭菌，实验器具的灭菌，菌种接种培养过程的无菌操作。

同时培养基的选择也很重要，菌种得分离，纯化，耐高温筛选都需要各自不同的培养基，进行各自的操作。

2.2.2同时酵母菌的生长时期的选择和控制也是非常重要的【8】。

迟缓期酵母菌接种至培养基后，对新环境有一个短暂适应过程（不适应者可因转种而死亡）。