高产透明质酸菌种FJ_23的诱变选育2_冯建成

trans lation ini tiation factor 5A gene peak at early G(1)phase of the cell cycle in the dinoflagellate Crypthecodinium cohnii [J ].Appl Environ Microbiol .,2002,68(5):2278-2284.

[5]Caraglia M,Tagliaferri P,Budill on A,e t al.Post-trans lational modifica -tions of eukaryotic i nitiati on factor-5A as a ne w target for anti-cancer therapy [J].Adv Exp Med Biol .,1999,427:187-198.

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[7]Chou W C,Huang Y W,Tsay W S,et al.Expressi on of genes encoding the rice translation initiation factor eIF-5A is involved in developmental and envir -onmental responses[J].Physiol Plant ,2004,121(1):50-57.

高产透明质酸菌种FJ-23的诱变选育

冯建成,张容鹄,罗素兰

*

(热带生物资源教育部重点实验室,海南大学生物技术实验中心,海南海口570228)

摘要:目的:高产透明质酸菌种的选育是提高透明质酸产量和质量的关键。方法:以马疫链球菌S H-0为出发菌,对其进行紫外诱变和NTG 诱变选育。结果:筛选出溶血素和透明质酸酶双缺陷型突变菌株FJ-23,其透明质酸产量提高了7倍;突变株经6次传代,其产酸量及HA 的相对分子量保持稳定,为今后进一步研究发酵法生产透明质酸打下基础。

关键词:马疫链球菌;诱变;选育

中图分类号:Q933 文献标识码:A 文章编号:1004-311X(2006)03-0028-03

Selection of A S treptococcus equi Mutant FJ -23for

the High Production of Hyaluronic Acid

FE NG Jian-cheng,Z HANG Rong-hu,LUO Su-lan

*

(Key Laboratory for Tropical Biol ogical Resources,(MOE);Center for Experi mental Biotechnology,Hai nan University,Hai kou 570228,China)

Abstract :It was very critical for i mproving the quality and q uantity of HA to select a high hyaluronic acid -producing stain.A selected mutant,desi gnated as Streptococcus equi FJ-23was selected from wild-type Streptococcus equi SH-0by UV and NTG ind uci ng mutagenesi s,which did not produce streptolysin or hyaluronidase.The mutant could p roduce HA seven ti mes as much as the original strain.Hyaluronic acid productivity and i ts relative molecular wei ght of the mutant kept stable after 6generations of reproduction,which displayed perfect genetic stabili ty.The re -search laid a good foundation for the further study on p roducing HA by fermentation.Key words :Stre ptococcus equi ;mutagenesis;selection

收稿日期:2006-02-12;修回日期:2006-03-28

基金项目:国家自然科学基金资助项目(No.30260066);海南省自然科学基金资助项目(30111);海南大学科研基金(Kyjj0545)

作者简介:冯建成(1972-),男,硕士,讲师,研究方向:微生物发酵工程,E-mail:fjc197228@;*通讯作者:罗素兰,Tel:0898-********,E-mail:luosul an2003@ 。

透明质酸(Hyaluronic acid,简称HA)又名玻璃酸,是一种由D-葡糖醛酸和N-乙酰葡糖胺,以B -1,3和B -1,4糖苷键相连的重复的二糖结构单位形成的一种链状高分子粘多糖。1934年由美国哥伦比亚大学医学院Meyer 和Palmer 首次从牛眼玻璃体中分离出[]。由于其特殊的生理作用和极强的保湿能力,透明质酸在日化工业、医学研究和食品健康等领域有着

广泛的应用[2]

。

目前,透明质酸生产方法主要有动物组织提取法和微生物发酵法。微生物发酵法生产透明质酸较之动物组织提取法具有原料易得,成本低,有更高的分子量和产量,使其成为透明质酸发展的方向。

国外这方面的研究主要集中在日本,其他国家也有少量报道,但多见于专利;由于在菌种选育、发酵工艺和HA 的提取纯化等方面的/瓶颈0有待突破,使我国在这方面的研究进展缓慢,与国外存在相当大的差距。国外研究的焦点已集中在医药级的HA 的研发上,国内必须加大在药用级HA 研发上的投入,尽快赶上国外先进水平。

高产透明质酸菌种的选育是提高透明质酸产量和质量的先决条件。本研究以马疫链球菌SH-0为出发菌,通过物理诱变和化学诱变相结合的方法对出发菌株进行诱变选育,筛选出一株高产透明质酸的突变菌FJ-23,为今后进一步研究发酵法生产透明质酸打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 出发菌种:菌种Streptococcus equi SH -0(实验室保藏号)。

1.1.2 马丁肉汤培养基(g P L ):马丁肉汤30,蛋白胨20,NaCl 3,Na HCO 32,Na 2HPO 41,葡萄糖2,琼脂粉18。

1.1.3 血琼脂筛选平板:在上述马丁肉汤培养基中加入10%

灭菌的脱纤羊血。

1.1.4 透明质酸钠盐筛选培养基:在上述马丁肉汤培养基中加入0.1%的透明质酸钠。1.1.5 种子培养基(g P L ):马丁肉汤20,蛋白胨10,NaCl 3,Na HCO 32,Na 2HPO 41,葡萄糖10;调pH 7.6,116e 灭菌40min 。1.1.6 发酵培养基(g P L):葡萄糖40,牛肉膏40,酵母粉40,MgSO 4#7H 2O 2,NaHCO 32,Na 2HPO 41,NaCl 2;调pH 值7.6,121e 灭菌15min 。1.2 方法

1.2.1 紫外诱变与筛选方法

取保存于斜面的出发菌种(S H -0)1-2环接种于种子培养基中,于37e 静置培养16h,经4000r P min 离心10min,用等体积的无菌生理盐水悬浮后,再经4000r P min 离心10mi n,去上清;制成菌悬液后,取5m L 注入直径为6cm 的小平皿中,以照射时间90s,种子液的稀释度为105倍,照射距离30cm 作为紫外诱变条件[3],在暗处稀释涂血琼脂筛选平板,37e 培养48h;待菌长出后选取不具溶血性的菌株。

以上方法重复进行30次实验。摇瓶发酵后分别测定其HA 的含量和相对分子量,以未经诱变的出发菌作对照,选取HA 含量高、分子量大的菌种,划斜面保种。1.2.2 NTG 诱变剂量的确定

以1.2.1中选取的菌种作为NTG(N-甲基-N-硝基-N -亚硝基胍)诱变的出发菌,经菌种活化后,使制成的菌悬液细胞数为108个P mL,先分别取0.5ml 400L g P mL 、600L g P mL 、800L g P mL 和1000L g P mL 的NTG 加入试管中,后取已制备好的菌悬液各0.5ml 加入到上述试管中,混匀后立即置于37e 水浴保温30min(处理浓度分别为200L g P mL 、300L g P mL 、400L g P mL 和500L g P mL)。用稀释法终止反应后,在暗处稀释涂种子培养基平板,37e 培养48h;计算用不同浓度的NTG 对菌种处理后,所得的菌落个数及致死率。每组试验重复3次,取平均值。

致死率=(对照每毫升菌液中的活菌数-处理后每毫升菌液中的活菌数)P 对照每毫升菌液中的活菌数。1.2.3 NTG 诱变及高产菌株的筛选

按照1.2.2中确定的NTG 诱变的最佳剂量,对1.2.1中选取的菌种进行诱变,在血平板上挑取不具溶血性的菌株点种

第16卷第3期:282006年6月 生 物 技 术BIOTECHNOLOGY

Vol 116,No 13:28

Jun 12006