第二章微生物菌种选育

第二章微生物菌种选育
采取土壤样品要考虑的几个问题
v 土质肥，微生物含量高，特别肥沃的土壤中细菌多，放 线菌少；在植物残体枯枝落叶下的土壤中较多含有拮抗 性真菌。
v 离地面5~20cm处的土壤通气良好、不受阳光直射，含 菌量最高。
v 采土季节以春秋两季最好。 v 采土方法：选择适当地点、铲除表土、取土样数十克，
盛入事先准备的无菌防水纸袋中，其上记录采土时间、 地点、植被情况等。 v 多点采土、混合分离，可以代表每一地块上的微生物分 布平均情况
第二章微生物菌种选育
（二）增殖培养
v 含有目的菌较多的土样不需要富集培养 v 如果原有样品中目的菌含量低，可以人为地添加相应的
基质，培养使之以较其它微生物更快的速度生长繁殖， 从而提高它们在样品中的比例，便于分离。 v 富集培养的一般方法：采用有利于目的菌种而不利于无 关微生物的营养和培养条件，以达到使目的菌种在群体 中比例上升的目的。 v 例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，或 者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这 一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可 能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。 v 一些有特定物质产生能力的菌种，不容易富集，只有通 过大量艰苦的工作筛选取得。
2.2.2 诱变育种的一般步骤
1、出发菌株的选择 v 自然界直接分离到的野生型菌株 v 经历过生产条件考验的菌株 v 已经历多次育种处理的菌株
第二章微生物菌种选育
2、制备菌悬液 v 待处理的菌悬液应考虑微生物的生理状态、悬液的
均一性和环境条件； v 尽可能选择孢子或单倍体细胞作为诱变对象，避免
表型延迟。 v 表型延迟就是指某一突变在DNA复制和细胞分裂后，
末端产物不能积累，因此末端产物的反馈调节作用被解除。 （2）抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变菌株的筛选 v 调节基因或操纵基因发生突变，使产生的阻遏蛋白不能再和
终产物结合或结合后不能作用于已突变的操纵基因，因此不 再起反馈阻遏作用； v 编码酶的结构基因发生突变，使变构酶不再具有结合终产物 的能力但仍具有催化活性，从而解除了反馈抑制。 v 抗反馈突变株一般通过抗结构类似物突变的方法筛选。 v 营养缺陷型的回复突变株中也可获得抗反馈突变株。
第二章微生物菌种选育
某些细菌的富集条件
富集对象
接种菌样
好氧氨基酸氧化菌
土壤
好氧性芽孢杆菌 土壤，巴氏消毒
氨基酸发酵性梭菌 土壤，巴氏消毒
耐碱解尿素芽孢菌 土壤，巴氏消毒
厌氧八叠球菌
土壤
乳酸菌
植物体或牛奶
肠道细菌
土壤或污水
pH7.0
丙酸菌
干酪
醋酸菌
果实或生啤酒
添加营养物(g)
特殊培养条件
– – – 尿素50 葡萄糖20 葡萄糖20 葡萄糖20，CaCO320
第二章微生物菌种选育
•从自然界筛选
第二章微生物菌种选育
v 2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。 v 3、采土方式：在选好适当地点后，用小萨子除去
表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁 的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样 时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土 样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐 步分批寄回，以便及时分离。
才在细胞表型上显示出来，造成不纯的菌落。 3、诱变处理 v 根据诱变剂用量对菌体致死率的曲线选择合适的处
理剂量。 v 一般突变率随诱变剂量的增大而增高，但达到一定
剂量后，突变率会下降。
第二章微生物菌种选育
4、突变菌株的筛选 （1）营养缺陷型突变株的筛选 v 生物合成途径的某一步发生了酶缺陷，合成反应不能完成，
•
生产能力强弱的过程。
• 复筛采用摇瓶培养后，发酵液采用精确的分析方法
• 进行测定。
• 复筛过程中，要结合培养条件进行。
• 培养条件包括：培养基
•
pH值
•
发酵温度
•
供氧量等。
第二章微生物菌种选育
（五）菌种鉴定
v 经典分类鉴定方法：形态特征、生理生化特 征、血清学试验等。
v 现代分类鉴定方法：遗传特性、细胞化学组 分、计算机数值分析。
第二章微生物菌种选育
第二节 菌种选育
v • 菌种选育是一门应用科学技术，其理论基础是微生 物遗传学、生物化学等，而其研究目的是微生物产 品的高产优质和发展新品种为生产不断地提供优良 菌种，从而促进生产发展。
vHale Waihona Puke Baidu
目前菌种选育常采用自然选育和诱变育种等方
法，带有一定的盲目性，尚属于经典育种的范畴。
随着微生物学、生化遗传学的发展，出现了转化、
• 拮抗菌的筛选—对峙培养： • 将病原指示菌与待测菌株 • 相对接种在平板上适温培 • 养，根据病原菌的生长情 • 况筛选出拮抗性菌株。
第二章微生物菌种选育
第二章微生物菌种选育
•2）摇瓶发酵筛选：将待测菌株进行液体振荡培养，取
•
发酵滤液进行活力测定。
第二章微生物菌种选育
•2、复筛：在初筛的基础上，进一步鉴定有希望菌株的
第二章微生物菌种选育
•B 复合诱变因素的使用 • 在微生物诱变育种中，可利用各种物理、化学 诱变因素来处理菌种。对野生型菌株单诱变因素有 时也能取得好的效果，但对老菌种单一诱变因素重 复使用突变的效果不高，这时可利用复合因素来扩 大诱变幅度，提高诱变效果。
第二章微生物菌种选育
•C 剂量选择 • 各种诱变因素有它们各自的诱变剂量单位，如 紫外线剂量单位用焦耳，x一射线剂量单位是库（仑） 每千克，中子剂量单位是戈。 • 化学诱变因素一般是以溶液浓度来计算剂量单 位的。对不同微生物使用的剂量是不同的，致死率 取决于诱变剂量，而致死率和变异率之间有一定关 系。因此可以用致死率作为选择适宜剂量的依据。
第二章微生物菌种选育
（五）毒性试验
v 自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将 其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有 关的菌种，更应慎重。据有的国家规定，微生物中 除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆 菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食 用，均需通过两年以上的毒性试验。
•三、新种分离与筛选的步骤
v 定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特 性。
v 采样：有针对性地采集样品。 v 增殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖
培养后，在数量上占优势。 v 分离筛选：采用选择性培养基利用分离技术得到纯种目
的菌。 v 发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、
好氧，pH7.0 好氧，pH7.0 厌氧，pH7.0 好氧，pH8.6 厌氧，pH2~3 厌氧，pH6.5 好氧或厌氧，
乳酸钠20 乙醇40
厌氧，pH7.0 好氧，pH6.0
注：培养基成分为酵母膏10g，KH2PO4或K2HPO4 1.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，加水1000ml。 一般培养在30℃下。
转导、原生质体融合、代谢调控和基因工程等较为
定向的育种方法。
第二章微生物菌种选育
•2.1 自然选育 • 在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自然突变而
进行菌种筛选的过程叫做自然选育。 • 所谓自然突变就是指某些微生物在没有人工参与下所发生 的那些突变。一般认为引起自然突变有两个原因：即多因素低 剂量的诱变效应和互变异构效应。 • 菌种的自然突变往往有两种可能性:菌种衰退,生产性能下 降;代谢更加旺盛,生产性能提高。
• 很高的特异性，但回复突变率高，很少使用。
•
脱氨剂：碱基脱氨或脱氮，引起碱基对转换，
第二章微生物菌种选育
（三）培养分离
v 尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物 的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在这— 步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用， 而且控制得细一点，好一点。纯种分离的方法有划 线分离法、稀释分离法。
第二章微生物菌种选育
• 稀释倒 • 平板法
•稀释分离 法
第二章微生物菌种选育
•2.2诱变育种 •2.2.l 诱变育种的基本原理 ➢ 诱变育种的理论基础是基因突变，所谓突变是指 由于染色体和基因本身的变化而产生的遗传性状的变 异。 ➢突变主要包括染色体畸变和基因突变二大类。 • （1）染色体畸变是指染色体或DNA片断的缺失、易 位、逆位、重复等。 • （2）基因突变是指DNA分子结构中的某一部位发 生变化（又称点突变）。
第二章微生物菌种选育
•E 高产菌株的获得需要筛选条件的配合 • 在诱变育种过程中高产菌株的获得还必须有合适的筛选
条件的配合。 • 诱变与筛选可以说是一个问题的两个方面，必须用辩证的 观点来看待。 • 总之，在诱变育种过程中要正确处理出发菌株，诱变因素 和筛选条件三者的关系。
第二章微生物菌种选育
•2.2.4 几种常见的物理、化学诱变剂的使用方法
第二章微生物菌种选育
（3）组成型突变株的筛选 v 分批限量加入诱导物法，解除菌株对诱导物的依赖 v 交替培养法 （4）抗性突变株的筛选 v 抗生素抗性突变 v 抗噬菌体菌株的选育 v 条件抗性突变 v 敏感突变
第二章微生物菌种选育
•2.2.3 诱变育种工作中几个应注意的问题 •A 选择好出发菌株 • 选好出发菌株对诱变效果有着极其重要的作用。 有些微生物比较稳定，其遗传物质耐诱变剂的作用 强。如果用这种菌株于生产是很有益的，而用作出 发菌株则不适宜。 • 用作诱变的出发菌株必须对它的产量、形态、生 理等方面有相当了解。挑选出发菌株的标准是产量 高、对诱变剂的敏感性大、变异幅度广，再确定诱 变剂的使用及筛选条件。
第二章微生物菌种选育
•D 变异菌株的筛选 • 诱变育种工作的一个主要任务是获得高产变异 菌株。从经诱变的大量个体中挑选优良菌种不是一件 容易的事。因为不同的菌种表现的变异形式是不同的， 从一个菌种的变异规律去发现那些与产量有关的特性， 并根据这些特性，分门别类地挑选一定数最的典型菌 株进行发酵和鉴定，以确定各种类型与产量之间的 关系。这样，可大大提高筛选的工作效率。
第二章微生物菌种选育
➢ 根据突变发生的原因又可分为自然突变和诱发突变。 • 诱发突变是指用各种物理、化学因素人工诱发的基因突 变。诱变因素的种类很多，有物理的、化学的和生物的三大类， 见表2－1。经诱变处理后，微生物的遗传物质、DNA和RNA 的化学结构发生改变，从而引起微生物的遗传变异。
第二章微生物菌种选育
• 平板 • 涂布法
•注意：必须要做多个浓度的稀释分离平板。
第二章微生物菌种选育
• 划线分离法——平板划线法
第二章微生物菌种选育
•（四）筛 选
•分初筛、复筛。
•1、初筛：从分离得到的大量微生物中，将目标微生物
•
筛选出来的过程。
•一般采用平板筛选。
•常用的初选方法：
• 水解酶产生菌的筛选： • 将酶的作用底物加在培 • 养基中，接种后适温培 • 养，根据菌苔周围是否 • 产生水解圈筛选出水解 • 酶产生菌。
第二章微生物菌种选育
2020/12/10
第二章微生物菌种选育
本章主要内容
v 第一节 v 第二节 v 第三节 v 第四节
菌种的分离筛选 菌种选育 生产菌种的扩大培养 菌种的保藏与复壮
第二章微生物菌种选育
第一节 菌种的分离筛选
一、菌种的来源 v 根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂
或菌种保藏部门索取或购买； v 从大自然中分离筛选新的微生物菌种。
•1）物理诱变剂：紫外线、X—射线、γ—射线，快中子；
• 电离辐射特点： 导致DNA断裂缺失，造成不可回复
•
的缺失突变。诱变效率高，但它可能
•
影响邻近基因的性能。
• 紫外线是常用的诱变剂。
•2）化学诱变剂：碱基类似物（5-BU）、脱氨剂（羟胺、
•
亚硝酸）、 嵌入剂（吖啶类）等。
• 特点：
•
碱基类似物：取代相应碱基进入DNA链，具有
培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品 品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最 适pH值、提取工艺等。
第二章微生物菌种选育
（一）采样
1、采样对象 以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的
沼泽土中，以细菌和放线菌为主，富含碳水 化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多， 如一些野果生长区和果园内。采样的对象也 可以是植物，腐败物品，某些水域等。
第二章微生物菌种选育
二、分离思路
v 新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照 生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法， 快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。
v 实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必 须重新进行分离纯化。
v 有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合 理先进的设备与之配合。
第二章微生物菌种选育