共聚焦显微镜的应用-讲座
激光扫描共聚焦显微镜技术讲座课件
1、分辨率： 指显微镜能将近邻的两个
质点分辨清楚的能力,通常是 用显微镜所能分辨清楚最近 的相邻两点间的距离来表示。
激光扫描共聚焦显微镜技术讲座
人眼及各类显微镜的分辨率
人眼分辨率： 光学显微镜分辨率： 共焦显微镜分辨率： 电子显微镜分辨率：
0.20 mm 0.25 mm 0.18 mm 0.20 nm
激光扫描共聚焦显微镜技术讲座
一种高分辨率的显微成像技术
1 用激光做光源，激光单色性好，光源波长相同， 从根本上消除了色差。
2 采用共聚焦技术在物镜的焦平面上放置了一个带 有小孔的挡板，将焦平面以外的杂散光挡住，消 除了球差，并进一步消除了色差。显微图象的清 晰度和细节分辨能力。
3 采用点扫描技术将样品分成无数个点，用十分细 小的激光束逐点逐行扫描成像，再通过电脑组合 成一个整体。传统的光镜在场光源下一次成像， 标本上每一点都会受到相邻点的衍射光和散射光 的干扰。这两种图像的清晰度和精密度是无法相 比的。
激光扫描共聚焦显微镜技术讲座
LSCM的重要组件
激光光源 自动显微镜 扫描模块（包括共聚焦光路通道和针孔、
扫描镜、检测器） 数字信号处理器 计算机以及图象输出设备（显示器、彩
色打印机）等。
激光扫描共聚焦显微镜技术讲座
激光扫描共聚焦显微镜技术讲座
激光器 显微镜：物镜 载物台 计算机系统：图像分析与控制系统
30.00 6.10
0.40
2.10
0.65
0.65
0.80
0.30
1.25
0.18
激光扫描共聚焦显微镜技术讲座
4x
10x
20x
40x
60x
《激光共聚焦简化》课件
显微镜设置与校准
激光器选择
根据所使用的荧光染料选 择适当的激光器波长。
滤色片配置
选择合适的滤色片以减少 背景噪声并提高信噪比。
校准与调整
确保显微镜的焦距、放大 倍数和视野等参数设置正 确，以便获得清晰的图像 。
图像采集与处理
采集模式选择
图像处理
根据观察需求选择单帧采集、多帧平 均或实时扫描模式。
技术培训
参加相关技术培训，提高操作和维护显微镜的能 力。
05 案例展示与解析
细胞生物学研究案例
细胞骨架结构观察
利用激光共聚焦显微镜技术观察细胞 骨架的动态变化，解析细胞生长、分 裂和迁移过程中的骨架重构过程。
细胞器定位与功能研究
通过共聚焦显微镜对细胞内特定细胞 器进行高分辨率成像，分析其在细胞 代谢、信号转导等方面的功能。
《激光共聚焦显微镜技术简 化操作与解析》
contents
目录
• 激光共聚焦显微镜简介 • 激光共聚焦显微镜操作流程 • 激光共聚焦显微镜解析技术 • 激光共聚焦显微镜的维护与保养 • 案例展示与解析
01 激光共聚焦显微 镜简介
定义与工作原理
定义
激光共聚焦显微镜是一种光学显微镜技术，利用激光作为光 源，通过共聚焦方式获取样品的高分辨率、高对比度图像。
优点
色彩复原技术能够提供高对比度和高 分辨率的图像，同时能够选择性地标 记和染色细胞或组织的特定结构，有 助于研究者更深入地了解细胞或组织 的生理和病理变化。
缺点
由于荧光染料可能会对细胞或组织产 生一定的毒性作用，因此需要严格控 制染料的浓度和作用时间。
定量分析技术
01 02
定量分析技术
利用激光共聚焦显微镜的定量分析软件，对获取的图像进行定量分析和 数据提取。这种技术能够提供更准确和可靠的实验数据，有助于研究者 更深入地了解细胞或组织的生理和病理变化。
激光扫描共聚焦显微镜及其应用讲解
激光扫描共聚焦显微镜及其应用激光扫描共聚焦显微镜（Laserscanningconfocalmicroscope,LSCM)是近代最先进的细胞生物医学分析仪器之一。
它是在荧光显微镜成像的基础上加装激光扫描装置，使用紫外光或可见光激光荧光探针，利用计算机进行图像处理，不仅可观察固定的细胞、组织切片，还可对活细胞的结构、分子、离子进行实时动态地观察和检测。
目前，激光扫描共聚焦显微技术已用于细胞形态定位、立体结构重组、动态变化过程等研究，并提供定量荧光测定、定量图像激光扫描共聚焦显微镜（Laser scanning confocal microscope, LSCM)是近代最先进的细胞生物医学分析仪器之一。
它是在荧光显微镜成像的基础上加装激光扫描装置，使用紫外光或可见光激光荧光探针，利用计算机进行图像处理，不仅可观察固定的细胞、组织切片，还可对活细胞的结构、分子、离子进行实时动态地观察和检测。
目前，激光扫描共聚焦显微技术已用于细胞形态定位、立体结构重组、动态变化过程等研究，并提供定量荧光测定、定量图像分析等实用研究手段，结合其他相关生物技术，在形态学、生理学、免疫学、遗传学等分子细胞生物学领域得到广泛应用。
激光共聚焦显微镜的原理激光扫描共聚焦显微镜是采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套观察、分析和输出系统。
主要系统包括激光光源、自动显微镜、扫描模块（包括共聚焦光路通道和针孔、扫描镜、检测器）、数字信号处理器、计算机以及图象输出设备（显示器、彩色打印机）等。
通过激光扫描共聚焦显微镜，可以对观察样品进行断层扫描和成像。
因此，可以无损伤的观察和分析细胞的三维空间结构。
同时，通过激光扫描共聚焦显微镜也是活细胞的动态观察、多重免疫荧光标记和离子荧光标记观察的有力工具。
主要功能1、图像处理功能2、细胞生物学功能应用范围：（1）定量荧光测定；（2）定量共焦图像分析；（3）光学切片及三维重组；（4）动态观察；（5）荧光漂白恢复研究；（6）质膜流动性研究；（7）蛋白质相互作用研究；（8）激光显微外科及“光陷阱”研究；（9）光活化技术研究。
共聚焦显微镜的应用
共聚焦显微镜的应用共聚焦显微镜是一种常见且广泛应用于生物学、材料科学和其他领域的先进显微镜技术。
它通过使用一种特殊的激光光束和精确的光学系统，可以获取高分辨率和高对比度的显微图像。
共聚焦显微镜的原理是利用聚焦在样本上的激光光束与样本中的荧光信号进行交互，然后通过成像系统收集并转换这些信号为可视化的图像。
共聚焦显微镜的应用范围非常广泛。
下面，我将从多个角度讨论共聚焦显微镜在不同领域的应用。
1. 生物学中的应用：共聚焦显微镜在生物学研究中具有重要作用。
它可以提供高分辨率的细胞和组织结构图像。
在细胞生物学中，共聚焦显微镜可以用于观察细胞内蛋白质、细胞器和细胞核等结构的分布和运动。
共聚焦显微镜还可以用于观察细胞分裂过程、细胞内信号传导和细胞凋亡等关键生物学过程。
2. 材料科学中的应用：在材料科学领域，共聚焦显微镜被广泛应用于材料的表征和分析。
它可以提供高分辨率的表面形貌和内部结构信息。
在材料表面缺陷分析中，共聚焦显微镜能够观察到微观缺陷的形貌和位置。
共聚焦显微镜还可用于材料的化学成分分析和荧光标记探针的检测。
3. 医学领域中的应用：在医学领域，共聚焦显微镜可用于细胞和组织的诊断和研究。
在癌症研究中，共聚焦显微镜可以观察到癌细胞的形貌和分布，从而帮助医生确定病情和制定治疗方案。
共聚焦显微镜还可以用于血液和生物标本的显微观察，以及对药物在体内的分布和代谢过程的研究。
总结回顾：共聚焦显微镜是一种在生物学、材料科学和医学领域具有广泛应用的先进显微镜技术。
它通过高分辨率和高对比度的显微图像提供了对样本的详细观察。
在生物学中，共聚焦显微镜可以用于观察细胞结构、蛋白质分布和细胞内过程。
在材料科学中，共聚焦显微镜广泛应用于材料的表征和分析。
在医学领域，共聚焦显微镜对癌症诊断和研究具有重要意义。
通过综合利用共聚焦显微镜的特点和功能，我们可以更深入地理解和研究生物、材料和医学等领域的重要问题。
观点和理解：共聚焦显微镜作为一项先进的显微镜技术，为我们提供了探索微观世界的窗口。
激光共聚焦显微镜的原理与应用范围讲解
激光共聚焦显微镜的原理与应用范围讲解激光共聚焦显微镜（Confocal laser scanning microscope, CLSM）是一种高分辨率的显微镜技术，它利用激光束进行点扫描，将样品的不同深度处的信息获取并合成，从而实现三维图像的获取。
本文将对激光共聚焦显微镜的原理和应用范围进行详细介绍。
首先是激光扫描。
激光束通过空气透镜和扫描镜反射，聚焦在样品上。
扫描镜以一个固定的频率和幅度来快速振动，使得激光束扫描在样品表面，形成二维扫描像。
其次是共焦原理。
共焦显微镜利用一个空孔径光阑（pinhole）来调整激光束的直径，只允许经过焦平面的光通过，其他散射光被阻挡。
这样可以消除在光路上不同深度处的散射光干扰，提高图像的纵向分辨率。
同时，由于只有通过焦平面的光才能进入探测器，所以可以采集不同深度处的信息，合成三维图像。
最后是探测技术。
通常激光共聚焦显微镜会配备一个光电探测器，并通过探测器来收集散射和荧光光信号。
散射光可以用来形成反射式图像，而荧光光信号则可以用来观察标记了特定分子或细胞的样品。
通过调整激光的波长和探测器的设置，可以实现不同特定分子和结构的成像。
1.细胞和组织成像：激光共聚焦显微镜可以提供高分辨率的细胞和组织成像。
通过荧光标记特定蛋白质或细胞结构，可以观察和研究细胞内部的生物过程和结构。
2.神经科学：激光共聚焦显微镜在神经科学中的应用得到了广泛关注。
可以观察和追踪神经元的形态和功能，研究神经网络的连接和活动，揭示神经系统的工作机制。
3.生物医学研究：激光共聚焦显微镜在生物医学研究中也扮演着重要的角色。
可以用于癌症细胞的培养和观察，研究癌症的发生和发展机制。
还可以用于研究哺乳动物早期发育过程中的细胞分化和组织形态的变化。
4.材料科学：激光共聚焦显微镜可用于对材料的表面和内部结构进行观察和分析。
可以研究纳米材料的形貌和组成，观察材料的晶体结构和缺陷。
总之，激光共聚焦显微镜是一种重要的显微镜技术，具有高分辨率、三维成像和可观察特定分子和结构的能力。
激光扫描共聚焦显微镜教学课件
缺点
昂贵
激光扫描共聚焦显微镜的价格相对 较高，不是所有的实验室都能够负
担得起。
需要专业操作
使用该显微镜需要一定的专业知识 和技能，对操作者的要求较高。
样本制备要求高
由于该显微镜对样本的厚度和折射 率等参数敏感，因此需要精心制备 样本。
维护成本高
激光扫描共聚焦显微镜的维护成本 也相对较高，需要定期检查和保养 。
04
激光扫描共聚焦显微镜的 优缺点
优点
高分辨率
激光扫描共聚焦显微镜利用激光束进行 扫描，可以实现比传统显微镜更高的分 辨率。
灵敏度高
由于激光束的强度高，该显微镜对样本 的灵敏度也相应提高，可以检测到较弱 的荧光信号。
减少光损伤
共聚焦技术只对焦点处的样本进行照明 ，有效减少了光损伤。
三维成像
激光扫描共聚焦显微镜可以采集样本的 三维图像。
仪器清洁
清洁显微镜的透镜和其他部件，以确保观察的清晰度和准确 性。
图像获取
参数设置
在获取图像前，需要设置激光扫描共聚焦显微镜的参数，如扫描速度、扫描分辨 率、激光波长等。
图像获取
通过激光扫描共聚焦显微镜获取细胞样本的图像。
数据分析
对获取的图像进行处理，以提 高其清晰度和对比度。
02
数据测量
01
图像处理
显微镜控制和分析软件。
02
基于图形用户界面，方便用户进行样本观察、图像获
取和数据分析。
03
支持多种组织样本类型，包括免疫荧光、荧光原位杂
交等。
Definiens Developer
一种基于规则和智能图像分析软 件，用于构建细胞和组织图像分
析流程。
提供强大的图像处理和分析工具 ，包括图像预处理、特征提取、
激光共聚焦显微镜的用途
激光共聚焦显微镜的用途激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope，简称LSCM）是一种高分辨率、高对比度的显微镜技术。
通过激光光源的激发和扫描，LSCM可以快速获取高质量的荧光图像，具有出色的三维成像能力。
下面将详细介绍LSCM的用途。
1.生物医学研究LSCM广泛应用于生物医学研究领域。
它可以对活体组织、细胞、蛋白质等进行实时观察和成像。
利用荧光探针标记的细胞、分子等在LSCM 下，可以观察到细胞器的结构和功能，探索细胞的生物学、病理学等方面的问题。
此外，LSCM还可以用于研究神经科学、免疫学和细菌学等领域，为相关疾病的诊断和治疗提供依据。
2.材料科学LSCM在材料科学研究中具有重要的应用价值。
它可以观察材料的微观结构、表面形貌和内部构造。
通过荧光染料标记或利用材料本身的荧光特性，可以研究材料的纳米结构、晶格缺陷、材料界面等特性。
LSCM还可以配合其他技术如拉曼光谱、傅里叶变换红外光谱等，进一步对材料进行分析和表征。
3.植物生物学LSCM在植物生物学研究中也起到关键作用。
通过激光共聚焦显微镜，可以观察到植物细胞的结构和功能，如叶片、根部、维管束等。
利用荧光标记技术，可以观察到植物的细胞器的分布和数量、蛋白质的表达和转运等。
此外，LSCM还可以用于研究植物的光合作用、生长发育等机制。
4.纳米科学LSCM在纳米科学领域也具有广泛应用。
它可以观察纳米材料的形貌、表面结构、聚集状态等。
利用纳米材料的特殊荧光性质，可以研究纳米颗粒的生长、聚集与分散、表面修饰等过程。
此外，LSCM还可以利用近场光学技术对纳米结构进行高分辨率成像，为纳米材料的设计与合成提供支持。
总之，激光共聚焦显微镜是一种用于观察微观结构和功能的强大工具。
在生物医学研究、材料科学、植物生物学和纳米科学等领域，LSCM发挥着重要的作用，为科学研究和技术应用提供了强有力的支持。
随着技术的不断进步，LSCM在未来的应用前景将更加广阔。
激光共聚焦显微镜的原理和应用讲解
激光共聚焦显微镜的原理和应用李楠王黎明杨军关键词激光; 显微镜; 原理和作用中国图书资料分类法分类号R 318. 51激光共聚焦显微镜是80年代发展起来的一项划时代意义的高科技新产品, 它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置, 利用计算机进行图象处理, 使用紫外或可见光激发荧光探针, 从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图象, 在亚细胞水平上观察诸如Ca 2+、pH 值, , 成为形态学, , , 学, 1994, 了目前世界次最高, 功能最全的美国M eridian 公司的产品:A cas 系列U lti m a 型和扫描速度最快的In sigh t 型两台激光共聚焦仪。
仪器自1995年5月份到货安装以来, 已为我院7个科室的10个课题所应用, 目前主要开展的研究内容有:(1 细胞内游离钙的实时监测; (2 细胞通讯的研究; (3 细胞形态学的研究。
1基本原理和功能1. 1基本原理传统的光学显微镜使用的是场光源, 标本上每一点的图象都会受到邻近点的衍射光或散射光的干扰; 激光共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面上的每一点扫描, 标本上的被照射点, 在探测针孔处成像, 由探测针孔后的光电倍增管(PM T 或冷电耦器件(cCCD 逐点或逐线接收, 迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图象。
照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭作者单位解放军总医院实验仪器中心, 北京100853的, 焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔, 焦平面以外的点不会在探测针孔处成像, 这样得到的共聚焦图象是标本的光学横断面, 克服了普通显微镜图象模糊的缺点。
在显微镜的载物台上加一个微量步进马达, 可使载物台上下步进移动, 最小步进距离为的0. 1Λm , 能清楚地显示, 实现了的目的, 这就是21. . CT ”功能通过狭缝扫描技术将我们对细胞的研究由多层迭加影像推进到真正的平面影像水平, 使图像更加清晰, 从而为分子细胞生物学的深入研究拓宽了视野。
共聚焦显微镜用途
共聚焦显微镜用途
共聚焦显微镜是一种高分辨率显微镜，它可以在非常小的区域内进行高分辨率成像。
这种显微镜的用途非常广泛，以下是一些常见的应用：
1. 生物学研究：共聚焦显微镜可以用于生物学研究，例如观察细胞和组织的结构和功能。
它可以提供高分辨率的图像，使研究人员能够更好地了解生物学系统的工作原理。
2. 材料科学研究：共聚焦显微镜可以用于材料科学研究，例如观察材料的表面形貌和结构。
它可以提供高分辨率的图像，使研究人员能够更好地了解材料的性质和行为。
3. 医学诊断：共聚焦显微镜可以用于医学诊断，例如观察细胞和组织的结构和功能。
它可以提供高分辨率的图像，使医生能够更好地了解病人的病情和治疗方案。
4. 环境科学研究：共聚焦显微镜可以用于环境科学研究，例如观察微生物和污染物的结构和行为。
它可以提供高分辨率的图像，使研究人员能够更好地了解环境中的微观世界。
共聚焦显微镜是一种非常有用的工具，可以用于各种领域的研究和应用。
它的高分辨率成像能力使其成为了许多科学家和医生的首选工具之一。
激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用
激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用一、激光扫描共聚焦显微镜的原理传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光扫描共焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM)采用点光源照射样本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜搜集，并沿原照射光路回送到由双色镜构成的分光器。
分光器将荧光直接送到探测器。
光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。
照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点被挡在探测针孔之外不能成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学切面，避免了非焦平面上杂散光线的干扰，克服了普通显微镜图像模糊的缺点，因此能得到整个焦平面上清晰的共聚焦图像。
原理图二、激光扫描共聚焦显微镜组成特点LSCM由显微镜光学系统，激光光源，扫描装置和检测系统构成，整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地进行。
显微镜是LSCM的主要组件，它关系到系统的成像质量。
通常有倒置和正置两种形式，前者在切片、活细胞检测等生物医学应用中使用更广泛。
三、激光扫描共聚焦显微镜的应用（一）细胞的三维重建普通荧光显微镜分辨率低，显示的图像结构为多层面的图像叠加，结构不够清晰。
LSCM能以0.1μm的步距沿轴向对细胞进行分层扫描，得到一组光学切片，经A/D转换后作为二维数组贮存。
这些数组通过计算机进行不同的三维重建算法，可作单色或双色图像处理，组合成细胞真实的三维结构。
旋转不同角度可观察各侧面的表面形态，也可从不同的断面观察细胞内部结构，测量细胞的长宽高、体积和断层面积等形态学参数。
通过模拟荧光处理算法，可以产生在不同照明角度形成的阴影效果，突出立体感。
通过角度旋转和细胞位置变化可产生三维动画效果。
LSCM的三维重建广泛用于各类细胞骨架和形态学分析、染色体分析、细胞程序化死亡的观察、细胞内细胞质和细胞器的结构变化的分析和探测等方面。
共聚焦显微镜用途
共聚焦显微镜用途共聚焦显微镜用途共聚焦显微镜（Confocal Microscope）是一种高级的显微镜，它具有非常高的分辨率和灵敏度，能够提供高质量的三维图像。
共聚焦显微镜广泛应用于生物医学研究、材料科学、纳米技术、地质学等领域。
本文将详细介绍共聚焦显微镜在这些领域中的用途。
生物医学研究共聚焦显微镜在生物医学研究中被广泛应用。
它可以观察活体细胞和组织的三维结构，分析细胞功能和代谢过程，探索生命现象的机制和规律。
1. 细胞形态与结构分析共聚焦显微镜可以对活体细胞进行高分辨率成像，观察其形态和结构变化。
通过荧光染色技术，可以标记出不同类型的蛋白质、核酸或其他生物大分子，并利用激光扫描成像技术进行三维重建，从而获得更为精确的信息。
2. 细胞活动过程的研究共聚焦显微镜可以实时观察细胞内部的活动过程，如细胞分裂、蛋白质合成、物质转运等。
通过荧光标记技术，可以将特定的分子标记出来，并实时观察其在细胞内的运动轨迹和相互作用。
3. 细胞信号传递通路研究共聚焦显微镜可以用于研究细胞内信号传递通路。
利用荧光标记技术，可以标记出不同类型的信号分子，并观察其在细胞内的分布和相互作用关系，从而揭示信号传递机制。
4. 组织学研究共聚焦显微镜可以对组织进行高清晰度成像。
通过荧光染色技术，可以将不同类型的组织结构染色并标记出来，然后利用激光扫描成像技术进行三维重建，从而获得更为精确的信息。
材料科学共聚焦显微镜在材料科学中被广泛应用。
它可以观察材料表面和内部的微观结构，分析材料性质和性能，探索材料的制备和改性方法。
1. 材料表面形貌研究共聚焦显微镜可以对材料表面进行高分辨率成像，观察其形貌和结构。
通过荧光标记技术，可以将特定的分子标记出来，并实时观察其在材料表面的分布和相互作用关系。
2. 材料内部结构研究共聚焦显微镜可以对材料内部进行高清晰度成像。
通过荧光染色技术，可以将不同类型的组织结构染色并标记出来，然后利用激光扫描成像技术进行三维重建，从而获得更为精确的信息。
基础科学激光共聚焦显微镜原理和操作模版课件
592/618
激光扫描共焦显微镜应用
1)细胞表面抗原、胞内某种蛋白
免役荧光标记： 与抗体耦联, 直标: 一抗+荧光探针 间标: 二抗+荧光探针 如: 微管蛋白tublin ( 抗 tublin抗体+荧光探针) 肌动蛋白actin ( Palloidine+荧光探针)
2)细胞膜表面受体
配体+荧光探针 如: nAchR、mAchR、多巴胺受体(D1,D2)
AO
500/526 DNA
560/650 RNA
TOTO-1
514/533 DNA
SYTO11~16 20~24 488/ 520
SYTO11~16 20~24 521/ 556
SYTO 17 621/634
活细胞
死细胞 活细胞 活细胞 活细胞
激光扫描共焦显微镜应用
3. GFP 绿色荧光蛋白
GFP的的发现：60年代，Shimomura等首先从水母中分离出一 种水母发光蛋白(aequoren)，该蛋白与钙和肠腔素结合后可产 生蓝色荧光。然而水母整体几提取的颗粒都呈绿色，后经证实 在水母体内还存在另外一种发光蛋白即绿色荧光蛋白 GFP, 后 经研究表明，在水母体内Ca2+和肠腔素与水母发光蛋白结合后， 水母发光蛋白产生蓝色荧光，GFP在蓝光的激发下，产生绿色 荧光 。
2. 样品的最大厚度: 取决于: 物镜的NA、物镜的工作距离 激光的穿透力、样品的透明度 Z轴的最大移动范围(166mm、Z-wide)
3. 样品的最小光切厚度: (载物台最小移动距离为40nm） 取决于: 物镜的NA、针孔大小 Z轴的最小移动步距: 40nm Z轴的分辨率: 0.35 mm
激光扫描共焦显微镜技术
激光共聚焦显微镜的原理与应用范围讲解
激光共聚焦显微镜的原理与应用范围激光扫描共聚焦显微镜是采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套观察、分析和输出系统。
把光学成像的分辨率提高了30%~40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代的研究工具。
1 激光扫描共聚焦显微镜（LSCM ）的原理从基本原理上讲, 共聚焦显微镜是一种现代化的光学显微镜, 它对普通光镜从技术上作了以下几点改进:1．1用激光做光源因为激光的单色性非常好, 光源波束的波长相同, 从根本上消除了色差。
1． 2采用共聚焦技术在物镜的焦平面上放置了一个当中带有小孔的挡板, 将焦平面以外的杂散光挡住, 消除了球差; 并进一步消除了色差1． 3采用点扫描技术将样品分解成二维或三维空间上的无数点, 用十分细小的激光束(点光源逐点逐行扫描成像, 再通过微机组合成一个整体平面的或立体的像。
而传统的光镜是在场光源下一次成像的, 标本上每一点的图像都会受到相邻点的衍射光和散射光的干扰。
这两种图像的清晰度和精密度是无法相比的。
1．4用计算机采集和处理光信号, 并利用光电倍增管放大信号图在共聚焦显微镜中, 计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像, 得到的图像是数字化的, 可以在电脑中进行处理, 再一次提高图像的清晰度。
而且利用了光电倍增管, 可以将很微弱的信号放大, 灵敏度大大提高。
由于综合利用了以上技术。
可以说ＬＳＣＭ是显微镜制作技术、光电技术、计算机技术的完美结合, 是现代技术发展的必然产物。
2 ＬＳＣＭ在生物医学研究中的应用目前, 一台配置完备的ＬＳＣＭ在功能上已经完全能够取代以往的任何一种光学显微镜, 它相当于多种制作精良的常用光学显微镜的有机组合, 如倒置光学显微镜、紫外线显微镜、荧光显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜(ＰＨ、微分干涉差显微镜(ＤＩＣ等, 因此被称为万能显微镜, 通过它所得到的精细图像可使其他的显微镜图像无比逊色。
激光共聚焦显微镜的原理和应用讲解
激光共聚焦显微镜的原理和应用李楠王黎明杨军关键词激光; 显微镜; 原理和作用中国图书资料分类法分类号R 318. 51激光共聚焦显微镜是80年代发展起来的一项划时代意义的高科技新产品, 它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置, 利用计算机进行图象处理, 使用紫外或可见光激发荧光探针, 从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图象, 在亚细胞水平上观察诸如Ca 2+、pH 值, , 成为形态学, , , 学, 1994, 了目前世界次最高, 功能最全的美国M eridian 公司的产品:A cas 系列U lti m a 型和扫描速度最快的In sigh t 型两台激光共聚焦仪。
仪器自1995年5月份到货安装以来, 已为我院7个科室的10个课题所应用, 目前主要开展的研究内容有:(1 细胞内游离钙的实时监测; (2 细胞通讯的研究; (3 细胞形态学的研究。
1基本原理和功能1. 1基本原理传统的光学显微镜使用的是场光源, 标本上每一点的图象都会受到邻近点的衍射光或散射光的干扰; 激光共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面上的每一点扫描, 标本上的被照射点, 在探测针孔处成像, 由探测针孔后的光电倍增管(PM T 或冷电耦器件(cCCD 逐点或逐线接收, 迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图象。
照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭作者单位解放军总医院实验仪器中心, 北京100853的, 焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔, 焦平面以外的点不会在探测针孔处成像, 这样得到的共聚焦图象是标本的光学横断面, 克服了普通显微镜图象模糊的缺点。
在显微镜的载物台上加一个微量步进马达, 可使载物台上下步进移动, 最小步进距离为的0. 1Λm , 能清楚地显示, 实现了的目的, 这就是21. . CT ”功能通过狭缝扫描技术将我们对细胞的研究由多层迭加影像推进到真正的平面影像水平, 使图像更加清晰, 从而为分子细胞生物学的深入研究拓宽了视野。
激光扫描共聚焦显微镜技术及应用说课讲解共45页
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26、要使整个人生都过得舒适、愉快，这是不可能的，因为人类必须具备一种能应付逆境的态度。——卢梭
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27Байду номын сангаас只有把抱怨环境的心情，化为上进的力量，才是成功的保证。——罗曼·罗兰
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28、知之者不如好之者，好之者不如乐之者。——孔子
激光扫描共聚焦显微镜技术及应用说 课讲解
6、法律的基础有两个，而且只有两个……公平和实用。——伯克 7、有两种和平的暴力，那就是法律和礼节。——歌德
8、法律就是秩序，有好的法律才有好的秩序。——亚里士多德 9、上帝把法律和公平凑合在一起，可是人类却把它拆开。——查·科尔顿 10、一切法律都是无用的，因为好人用不着它们，而坏人又不会因为它们而变得规矩起来。——德谟耶克斯
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29、勇猛、大胆和坚定的决心能够抵得上武器的精良。——达·芬奇
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30、意志是一个强壮的盲人，倚靠在明眼的跛子肩上。——叔本华
谢谢！
45
共聚焦显微镜应用PPT课件
——细胞原位检测核酸
目录
▪ 概述 ▪ PI的特性 ▪ PI的应用 ▪ PI标记细胞的方法
概述
激光扫描共聚焦显微术通过成像显示出细胞内核酸的分布特征 及含量，即实现定位、定性及定量检测核酸。该方法常用于细胞核 定位及其形态学观察、检测细胞内DNA的复制及断裂情况以及染色 体定位观察等。
感谢聆听
不足之处请大家批评指导
Please Criticize And Guide The Shortcomings
演讲人：XXXXXX 时 间：XX年XX月XX日
PI标记细胞的方法
▪ 样品为活细胞
▪ 可直接向细胞外液中加人PI,使终浓度为1~15 μg/ml（根据细胞 种类及其密度而异），室温放置5~15min后，用激光扫描共聚焦 显微镜检测。
▪ 细胞膜完好的正常活细胞，PI不能染色；
▪ 膜不完整的细胞及死细胞则可检测到PI的红色荧光，此时观察到 的是细胞内DNA和RNA的总量。该项检测最好在短时间内完成，
Hale Waihona Puke PI应用▪ PI标记可以是活细胞也可以是固定的细胞
▪ 当标记活细胞样品时，目的在于检查细胞的膜完整性及其坏死情 况，常应用于检测膜损伤、细胞凋亡；
▪ 标记固定细胞时，目的一般是进行细胞核定位、显示细胞核或染 色体的形态、定量测定核酸等，常应用于检测细胞周期、细胞凋 亡、RNA和DNA在细胞内的分布及其含量变化、以及用作核酸显 色剂
谢谢聆听
未完待续
楚河汉界
小鼠肠道及其中的人类肠道 微生物，63x
重影的林
小鼠耳部血管与神经网， 10x
无定形
拟南芥的幼芽，40x
结束语
当你尽了自己的最大努力时，失败也是伟大的， 所以不要放弃，坚持就是正确的。
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51
长期观察的系统稳定性：温度、湿度、酸度
~ 50mS
9
药物高通量筛选相关
UPLSAPO40X OB
UPLSAPO40X OB Zoom 2X
17小时，5分钟间隔， Hoechst 33258染色
新型的智能活细胞共聚焦系统
Example of the image. Mouse brain slice ）
TRITC
+
=
共定位观察 ——colocalazation
在体荧光原位杂交 (FISH)
33
视丘下部 大脑皮层
组织水平
Rainbow mouse
第三脑室
36
丘脑
Livet et al. Nature 1st Nov 2007
6
FRET
CFP, before PB
YFP, before PB
CFP, after PB
大视野 多Z轴
拼图
Sample provided by:
Ms. Mikako Sakurai,
Mr. Masayuki Sekiguchi
(Section Chief)
Department of Degenerative
Neurological Diseases,
National Institute of
Dye: YFP OB： ＵｐｌａｎSAPO10x Number： 5X5 =25 images
Neuroscience, National Center of Neurology and Psychiatry
Each point :XYZ image 512x512、15 Z-Slices
荧光基础（略）
细胞样品来自北京中医医
65
院
细胞样品来自中科院植物
66
所
11
杀死细胞
67
Dronpa蛋白
69
Caged-IP3 on FV1000
68
Caged-Glutamate on FV1000
Imaging laser 488nm
Stimulation 405nm
点触发
Fluo-3
Intensity at each ROIs
YFP, after PB
37
荧光能量共振转移/FRET(Fluorescence
Resonance Energy Transfer )
442nm
485nm CFP
Ar Laser 488nm
530nm
YFP
442nm
CFP
530nm YFP
485nm
38
FRET应用
1 分子内结构变化（蛋白质、DNA构象等） 2 分子间相互作用（酶活力、离子通道结构变化等） 3 离子浓度测量（通过构建FRET蛋白测量Ca2+, PH, cAMP等） 4 分子间作用距离测量
10
同步双扫描应用——光诱导系统
快速的样本刺激和同步的标本成像
488nm&543nm获取图像
采图激光
405nm同时激发
同步激光
Keade蛋白
Data from; Dr. Atsushi Miyawaki and Ms. Ryoko Ando in RIKEN BSI
Keade蛋白 在神经学中 的应用
40
光谱型共聚焦的应用
快速切换：100nm/ms
准确、精确的光栅光谱系统 高精确： 1nm步进
光栅快速旋转----线性光谱扫描
荧光染料：任意选择波段和带宽
800 800
400 400
473nm
485nm
497nm
509nm
7
蓝
（宽）
蓝 空
（窄）
反光镜
绿 （宽）
绿 （窄）
800
400
• 采集荧光随意选择 • 带宽随意调整 • 可以获取标本光谱信息 • 更高的透过率 • 更快速的切换
XYZT imaging (4D)
XYZTλ imaging (5D)
线虫早期胚胎分裂 14Z, 1um/Z Interval 5 Sec 36 min 2716 frams
果蝇发育 5Z 206个时间点
胞吐过程
13
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激光扫描共聚焦显微镜基本原理
激光扫描共聚焦显微镜特点及应用
» 薄层光学切片 » 3D成像 » 多通道/光谱 » 时间相关成像 » AOTF/光刺激
其他共聚焦相关显微镜简介
Fluorescence Recovery After Photo-Bleaching (FRAP)
AOTF功能 ——荧光漂白后恢复（FRAP)
共聚焦显微镜应用介绍
荧光基础（略） 激光扫描共聚焦显微镜基本原理（略） 激光扫描共聚焦显微镜特点及应用 其他共聚焦相关显微镜应用简介
Olympus北京——齐冬 2008，12
明场观察
光学显微镜显微观察方式
微分干涉衬DIC
浮雕相衬RC
相衬（相差）
荧光显微镜的问题？？
暗场观察
荧光观察
偏光观察
荧光基础（略） 激光扫描共聚焦显微镜基本原理（略） 激光扫描共聚焦显微镜特点及应用 其他共聚焦相关显微镜简介
荧光的效率与距离成6次幂关系，可以灵敏测量1－10nm内的距离变化
39
FRET的一种应用 —— 测定Hela活细胞中的Ca2+浓度
Chameleon(变色指示剂) 一种合成蛋白，由4个部分组成：
– CFP – 钙调素 （CaM） – 缩氨酸（M13） – YFP CaM结合Ca2+后，蛋白构象发生变化， 产生分子折叠，使CFP/YFP相互靠近, 产生FRET.
激光扫描共聚焦显微镜基本原理
激光扫描共聚焦显微镜特点及应用
» 薄层光学切片 » 3D成像 » 多通道/光谱 » 时间相关成像 » AOTF/光刺激
其他共聚焦相关显微镜简介
8
一般的延时摄影——Time Lapse
物质运输
施加药物后蛋白质的迁移
蛋白质在神经细胞中的迁移
49
50
高速的离子成像
线扫描功能——快速采集信号
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Nat. Inst. F. Physiological Sciences, at. Inst. Of Natural Sciences, Japn
斑马鱼
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FluoView
FluoView
2-Photon – Imaging & laser stimulation / manipulation
Example: 只有焦点区域被激发 单spine解笼锁
Optical stimulation (SIM scanner)
1μm
spine
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© OLYMPUS
Page 90
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FluoView
２Photon 解笼锁
© OLYMPUS
Page 91
© OLYMPUS
CONFOCAL的图像特点
Confocal vs C-CCD
C-CCD camera 细胞标本
Confocal
1
共聚焦原理
共聚焦针孔 (Pinhole)
光电倍增管 (PMT) 荧光滤光片 (发射光滤色片)
激光
物镜 标本
眼睛观察
CCD 取图
Confocal 图像
宽场照明显微镜和共聚焦图像比较
扫描显微镜
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FluoView
1 photon Excitation state
Excitation light
2 photon Excitation Light
Fluorescence
Fluorescence
Ground state
absorb one photon
about half energy (=double frequency) absorb two photons at once
Data from: Dr. Atsushi Miyawaki and Dr. H. Hama in RIKEN BSI amd Dr., Furuta in Toho Univ.
荧光基础（略） 激光扫描共聚焦显微镜基本原理 激光扫描共聚焦显微镜特点及应用 其他共聚焦相关显微镜简介
» 转盘式共聚焦——快速 » 三维反卷积——经济 » 多光子显微镜——深层
• 特点：——深
• 生物组织对红外光光吸收少，随深度增加衰减小 • 红外光衍射低，光束形状保持好 • 焦点激发
FluoView
多光子显微镜的应用举例
FluoView
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FV1000MPE Image Files XYZ stack，700 µm deep - 4 µm steps，H. Waki, T.Nemoto, J.Nabekura,
X
Y
标本
OLYMPUS
显示器
Z
10
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» 薄层光学切片 » ZOOM » 多通道/光谱 » 时间相关成像 » AOTF/光刺激
其他共聚焦相关显微镜应用简介
细胞质膜及亚细胞器 相关定位观察 ~8um
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大型细胞如： 卵细胞光切( ~ 30um)
应用1 光栅＋狭缝 ＝随意可调滤色片 ＝无限染料应用
2 光谱拆分（Unmixing）