细胞穿膜肽TAT介导猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp9纳米抗体Nb6抗病毒感染的研究

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猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白Nsp9基因的克隆与原核表达

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ＣｉｅｅＪｕｎｌｆＶｅｅｉａｙＭｅｉｎｈｎｓｏｒａｏｔｒｎｒｄｃｅｉ
中国兽医杂志２００７年（４卷）１第３第Ｏ期
３
猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白Ｎｐｓ９基因的克隆与原核表达
沈张奇，郭鑫，杨汉春，新娜，陈艳红，查振林盖
（国农业大学农业部预防兽医学重点开放实验室，京海淀１０９）中北００４
摘要：过ＰＲ方法从重组质粒ｐＫＢ通ＣＳ — ２扩增得到非结构蛋白Ｎｓ９的基因片段。将基因克隆至原核表达载体ｐＴ２ａｐＥ一８
关键词：繁殖与呼吸综合征病毒；结构蛋白；Ｎｓ９基因；隆；原核表达猪非ｐ克中图分类号：８Ｑ７６文献标识码：Ａ文章编号：５９６０（０７１～０３００２—０５２０）０００ —３
Ｃｌｎｎｎｏｒｏｉｘｅｓｏｆｎｏ — ｔｕｔｒｌｐｒｔｉｐ９ｇｎｏｉｇａｄｐｒｋａｙｔｃｅｐｒｓｉｎｏｎｓｒｃｕａｏｅｎＮｓｅｅｏｒｉｅＲｅｒｄｃｉｅａｓｒｔｒｙｒｍｅＶｉｕｆＰｏｃｎｐｏｕｔｖｎｄＲｅｐｉａｏｙＳｎｄｏｒｓ
Ｎｓｏｕｌｅｒｃｇｎｚｄｂｙｔｏｉｉｅｕｆｏｍｈｅｐｉｎｆｃｅｔｐ９ｃｄｂｅｏｉｅｈｅｐｓｔｖｅｓｒｍｒｔｇｉｅｔｄｗｉｈＰＲＲＳＶ．Ｔｈｅｕｔｐｒｖｄｄｅｒｓｌｏｉｅ

猪繁殖与呼吸综合征病毒在Marc-145细胞微载体上培养条件的研究

ＣｕｔｒｆｏｃｎｐｏｕｔｅａｄｒｓｉａｏｙｓｎｒｍｅｖｒｓｏｌｅｏｐｒｉｅｒｒｄｃｉｎｐｒｔｒｄｏｉｕｎｕｅｖｅｙＭａｃ１５ｃｌｍｉｒｃｒｉｒｒ．ｅｌｃｏａｒｅｓ４
１材料与方法
１１材料．
兰中央兽医研究所确定该病的病原是一种新的ＲＡＮ病毒，并命名为Ｌｌｓａ病毒。９６年郭宝清同ｅｙｔｄ１９等首次从疑似ＰＲＲＳ感染的猪群中分离到了ＰＲＶＲＳ，
１５ｅｌ／．Ｉｃｌｍ１ｔ０ｓｗａｆａｉｌｔｒｐｇｔｔｅｏｃｎｒｐｏｕｔｅｎｅｐｒｔｒｙｄｏｖｒｓｎｓｅｓｅｏｐｏａａｅｈｐｒｉｅｅｒｄｃｖａｄｒｓｉｏｙｓｎｒｍｅｉｕｏｂｉａｍｉｒｃｒｉｒ．ｉｈｌｉｅｅｐｒｎａｕｄｔｎｆｒａｓｒｄｃｏｆＲＲＳｖｃ：ｅｃｏａｒｅｓｗｈｃｄｔｘｅｉａｈｍｅｔｌｏｎａｉｓｏｕｔｎｏＰｆｏｏｍｐｉａｃｎ．ｉＫ：Ｍａｃ１５ｅｌｐｒｉｅｅｒｄｃｉｅｄｅｐｒｔｒｙｄｏｒ－４ｌｏｃｎｒｐｏｕｔａｒｓｉａｏｙｓｎｒｍｅｉｕ；ｃｏａｒｅｓｃ；ｖｎｖｒｓｍｉｒｃｒｉｒ
ＰＲＶ在微载体Ｃｔｄｘ３上的生长条件，ＲＳｙｏｅ一为

猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的制备和鉴定

抗体腹水ＥＩＡ效价达１１，ＩＭＡ效价达１５０１０４，与猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒等无ＬＳ００Ｐ～：６～：０２１２
交叉反应。结论获得特异性针对猪繁殖与呼吸综合征病毒的单克隆抗体，为研究该病的快速诊断技术奠定基础。关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；单克隆抗体；酶联免疫吸附试验；免疫过氧化物酶单层试验
摘要：目的制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒（ＲＶ）单克隆抗体并对其生物学特性进行鉴定。方法以纯化的ＰＲＶＰＲＳＲＳ
全病毒抗原免疫ＢＬ／ＡＢｃ小鼠，通过杂交瘤技术制备单克隆抗体，并测定其免疫球蛋白亚类、效价和特异性。结果成功获得２株能稳定分泌抗ＰＲＳＭ蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞，命名为３、３，经鉴定亚类均为ＩＧａａｐ链。２株单克隆ＲＶＣ３Ｄ２ｇ２、ｋｐａ
ｓｅｉｃＭｃｓａａｎｔＭｒｔｉｆＰｐｃｆＡｂｇｉｓｉｐｏｅｎｏＲＲＳｗｅｅｏｔｉｅ，ｎｍｅｓ３ｎＤ２，ｗｈｃｒｄｎｉｅｓｉＶｒｂａｎｄａｄａＣ３ａｄ３ｉｈｗｅｅｉｅｔｄａｍｍｕｏｌｂｌａｉｆｎｇｏｕｉＧ２ｎ
Ａｂｔａｔｓｒｃ：Ｏｂｅｔｖｏｐｅａｅａｄｉｅｔｆｎｃｏａｎｉｏｉｓ（Ａｂ）ａａｎｔＰＲＲＳＭｅｈｄｊｃｉｅＴｒｐｒｎｄｎｉｙｍｏｏｌｎｌａｔｄｅｂＭｃｓｇｉｓＶｔｏｓＢＡＬｃｍｉｅｗｅｅＢ／ｃｒ

猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白单克隆抗体制备及抗原表位鉴定

猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白单克隆抗体制备及抗原表位鉴定王梦婕;张杰;孙杨杨;白娟;刘星;姜平【期刊名称】《畜牧与兽医》【年(卷),期】2022(54)6【摘要】为制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)M蛋白单克隆抗体,将PRRSV类NADC30毒株FJ1402的M蛋白胞外区基因与TAT穿膜肽基因融合,密码子按大肠杆菌偏嗜性优化,构建了大肠杆菌表达质粒,制备获得重组M蛋白。

取6周龄雌性BALB/c小鼠免疫重组蛋白,将脾脏淋巴细胞和SP2/0细胞融合,用间接ELISA 方法筛选阳性杂交瘤细胞株,获得4株分泌M蛋白抗体的杂交瘤细胞株。

其中1E7、2F7、3A12的细胞上清液抗体效价为1∶3200,3G7的细胞上清液抗体效价为1∶800,传至第15代均能稳定分泌抗体。

单抗经亚型鉴定可知1E7、2F7、3A12的重链类型为Ig2a,3G7的重链类型为IgG1,轻链类型都为κ型。

经间接免疫荧光试验(IFA)和Western blot鉴定,4株单克隆抗体均可与PRRSV产生特异性反应,鉴定出2个抗原表位,为PRRSV诊断和疫苗研制奠定了基础。

【总页数】6页(P91-96)【作者】王梦婕;张杰;孙杨杨;白娟;刘星;姜平【作者单位】南京农业大学动物医学院/农业农村部动物细菌学重点实验室【正文语种】中文【中图分类】S852.6【相关文献】1.猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP9蛋白单克隆抗体制备与鉴定2.猪繁殖与呼吸综合征病毒 GP5蛋白单克隆抗体的制备及鉴定3.高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株GP3单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定4.美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白中和活性单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定5.一株针对猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30-like毒株GP5蛋白的单克隆抗体制备及鉴定因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒样品对细胞的敏感性

Ｃｉａｈｎ）
Ａｂｔａｔｓｒｃ：Ｗｅｃｌｅｔｄ０ｃｉｃｌａｌｓｒｍｓｐｃｅＰｏｃｎｒｐｒｄｕｔｖｄｅｐｉａｏｙｓｎｒｍｅｉｕｏｌｃｅ１０ｌｎｉａｓｍｐｅｆｏｕｓｅｔｄｒｉｅｅｏｃｉｅａｎｒｓｒｔｒｙｄｏｖｒｓ
ｓｅｔｖｌｓｌｔｄｗｉａｃ１５ｃｌａｐｃｉｅｙｉｏａｅｔＭｒ一４ｅｌｎｄＰＡＭｅｌｎｗｈｃｈ１ｈｃｌ，ｉｉ０ＰＲＲＳｓｒｉｒｓｌｔｄｗｉｈｂｈＭａｃ１５Ｖｔａｎｓｗｅｅｉｏａｅｔｏｔｒ一４ａｎｄＰＡＭｅ１ＤａａｓｏｄｔａｅｍｓｔｄａａｌｆｉｏａｉｇＰＲＲＳＶ，ｗｈｌｈｅｖｒｓｈｄｎｏｓｇｉｉａｃｌ．ｔｈｗｅｈｔｓｒｕｗａｈｅｉｅｌｓｍｐｅｏｓｌｔｎｉｅｔｉｕａｉｎｆｃｎｔｄｆｅｅｃｎｓｎｉｖｔｆｅｔｏａｃ１ｎｄＰＡＭｅｌ．ｉｒｎｅｉｅｓｔｉｅｆｃｎＭｒ一４５ａｉｙｃｌｓＫｅｒｙｗｏｄｓ：ＲＲＳＶ；ｃｌ；ｓｎｉｉｉｎａｙｉｅｌｅｓｔｖｔａｌｓｓｙ
（ｎｌｓａｄｙａｄＶｔｉｒｅａｃｓｔｔ，ｈｎｈｉｃｄｍｇｉｌｒｌｃｎｅ，ｈｎｈｉ０１６ＡｉｂｎｒｎｅｒａｙＲｓｒＩｔｕｓａｇａＡａｅｙｏｒｕｔａｉｃｓＳａｇａ１０，ｍａＨｕｅｎｅｈｎｉｅｆＡｃｕＳｅ２
ｓｄｏｅｖｒｓｓｍｐｌｓｏｎｃｌｙｎｒｍｉｕａｅｅｌｓ

猪繁殖与呼吸综合征病毒感染抑制肺脏抗菌肽PG-1基因表达

２８
中罔兽医杂志２０１３年（第４９卷）第ｌＯ期
猪繁殖与呼吸综合征病毒感染抑制肺脏抗菌肽ＰＧ一１基因表达
刘春玲。，焦慧娟，许美娟，丁志青，李宏全，姜俊兵
（１．山西农业大学动物科技学院，山两太谷０３０８０１；２．山两农业大学生命科学学院，山西太，奋０３０８０１）
ＩＩＵＣｈｕｎ — ｌｉｎｇ，ＪＩＡＯＨｕｉ — ｊｕａｎ。，ＸＵＭｅｉ — ｊｕａｎ，ＤＩＮＧＺｈｉ — ｑｉｎｇ，ＬＩＨｏｎｇ — ｑｕａｎ，ＪＩＡＮＧＪｕｎ — ｂｉｎｇ
摘要：猪抗菌肽（Ｐｒｏｔｅｇｒｉｎ１，ＰＧ－１）对革兰阳性菌、革兰阴性菌和产生耐药性的细菌具有抗菌作用，还可降低慢病毒亚科的传染性和抗囊膜病病毒感染。目的为了研究ＰＧ－１基因在猪体内的表达是否受到病毒感染的影响，我们设计了猪繁殖与呼吸综合征病毒攻毒试验，采用荧光定量ＰＣＲ技术方法测定ＰＧ－１基因在肺脏和肠道的表达水平，分析猪繁殖与呼吸综合征病
毒感染对Ｐ１基因表达的影响。结果表明，ＰＧ－１基因在肺脏和小肠组织中均有表达，与对照组比较，攻毒组肺脏和肠道中

猪呼吸系统发病机理及诊断防治

猪呼吸系统发病机理及诊断防治作者：刘树民来源：《农民致富之友（上半月）》 2019年第3期猪呼吸系统的疾病在生猪养殖过程中是常见的疾病，很多养猪场都比较常见，也是兽医在临床上普遍的症候群。

猪的呼吸系统疾病分为两大类型，一类可以使大批猪患病的疾病，具有病情严重持续时间短的特点；一类是在猪群持续存在的，并且持续的程度与疾病的缓急相关。

1、猪繁殖与呼吸综合征1.1 发病机理猪繁殖与呼吸综合征（PRRSV），单核巨噬细胞系统中常复制这种疾病，其更为明显的现象表现在肺泡巨噬细胞中。

PRRSV疾病会逐渐使巨噬细胞破裂和溶解，猪肺内的巨噬细胞会越来越少，就会缺乏对其它病毒和细菌的免疫力，于此同时，这种疾病会逐渐的转移到其它的淋巴组织中，影响淋巴组织的免疫功能，严重的会造成淋巴组织衰竭。

如果这个疾病持续的扩散，会使得全身的中性粒细胞和巨噬细胞都会受到感染，使得猪的整体免疫力低下，猪的体质逐渐出现了免疫干扰或者抑制的状况，为其它的病原感染提供了机会。

1.2 诊断和治疗这种疾病在猪群中发生就会产生蔓延，全体猪群基本都会感染，并且这种疾病的持续性长，常年都会受到这种疾病的困扰，空气、排泄物、空气都可能是这种疾病的传播媒介。

诊断：猪在感染PRRSV后，身体会出现呼吸困难、不断流泪的症状并且伴有发热的现象。

母猪妊娠后期感染这种疾病，会造成流产，流产猪胎脐眼与脐带之间的连接处有严重的出血现象，这种现象就可以证明这头母猪和流产胎儿都已经携带 PRRSV疾病。

PRRSV 疾病在猪发生后，猪的淋巴结会出现明显的肿大和出血的现象，猪胃底会出现明显的弥漫性出血，并且呈片状；此外，这种病在发生继发性感染会造成多样性的病理变化。

治疗：这种疾病在当前兽医临床中没有特性药物，临床治疗中常采用的办法是：在2000千克的饲料中拌上500克的酒石酸乙酰异戊酰泰乐菌素与400克的替米考星，或者是利用免疫球蛋白、干扰素等一类的抗病毒制剂来治疗PRRSV疾病。

猪繁殖与呼吸综合征病毒的CTL表位多肽及其应用[发明专利]

专利名称：猪繁殖与呼吸综合征病毒的CTL表位多肽及其应用专利类型：发明专利
发明人：夏春,潘孝成
申请号：CN201210030549.6
申请日：20120210
公开号：CN103242427A
公开日：
20130814
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了猪繁殖与呼吸综合征病毒的CTL表位多肽及其应用。

本发明所提供的猪繁殖与呼吸综合征病毒的CTL表位多肽的氨基酸序列如序列表中序列1所示。

本发明还保护编码所述多肽的核酸分子。

本发明所提供的猪繁殖与呼吸综合征病毒的CTL表位多肽能够与猪SLA-I分子结合，可用于制备针对猪繁殖与呼吸综合征病毒的疫苗，以及制备鸡的CD8+T淋巴细胞增殖剂。

申请人：中国农业大学
地址：100193 北京市海淀区圆明园西路2号
国籍：CN
代理机构：北京纪凯知识产权代理有限公司
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猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp9纳米抗体在体内抗病毒感染的初步验证

猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp9纳米抗体在体内抗病毒感染的初步验证猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种以怀孕母猪流产和不同年龄段猪的呼吸道疾病为临床特征的病毒性传染病。

PRRSV具有逃逸宿主体液免疫应答机制等特征,导致现阶段商品化的疫苗不能给猪群提供完全的保护作用,且目前尚未得知有效的治疗方法,该病给我国养猪业带来巨大的经济损失。

前期研究中,本实验室将PRRSV非结构蛋白Nsp9特异性纳米抗体Nb6基因通过（G4S）3 Linker与细胞穿膜肽TAT基因融合,克隆至pET21b载体,成功构建pET21b-TAT-Nb6表达载体。

原核表达获得的TAT-Nb6重组蛋白具有与Nsp9重组蛋白相互作用的活性,并且能够进入MARC-145细胞和原代细胞PAM中,可以抑制多株PRRSV毒株（包括基因1型（GZ11-G1）与2型（SD16、JX-A1、GD-HD、VR-2332））在以上两种细胞中的复制（Wang et al.2019）。

因此,TAT-Nb6具有开发为新型抗PRRSV纳米抗体药物的潜力。

基于以上背景,本研究通过对TAT-Nb6诱导表达温度、IPTG添加量和诱导表达时间的摸索,确定最佳的诱导表达条件,从而制备大量TAT-Nb6重组蛋白,对其在猪体内抗PRRSV作用进行验证,为抗PRRSV纳米抗体药物的研发提供一定的理论基础。

主要研究内容及结果如下:1.TAT-Nb6重组蛋白优化表达条件:为了获得TAT-Nb6在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中最大表达量,我们将含有pET-21b-TAT-Nb6表达载体的大肠杆菌在不同条件下进行培养,如不同的诱导温度、诱导剂浓度和时间。

通过SDS-PAGE和western blot分析。

结果显示,TAT-Nb6重组蛋白在IPTG终浓度0.2 mM,37℃诱导6 h条件下诱导表达量最高。

猪繁殖与呼吸综合征病毒E基因的克隆及其腺病毒表达载体的构建

猪繁殖与呼吸综合征病毒E基因的克隆及其腺病毒表达载体的构建邓碧亮;顾万军;黄毓茂【摘要】本研究通过RT-PCR方法扩增猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)GD株的E蛋白基因,克隆至穿梭质粒pShuttle-CMV vector中,构建腺病毒重组表达载体.经过抗性筛选、PCR扩增、单酶切等方法对其进行鉴定,确定得到了含有目的基因的阳性克隆,成功构建了腺病毒表达载体pad-E.同时转染293细胞并进行了初步鉴定,进一步的研究还在继续.本研究为PRRSV结构蛋白功能及其基因工程疫苗研究奠定了基础.【期刊名称】《广东畜牧兽医科技》【年(卷),期】2010(035)002【总页数】3页(P28-30)【关键词】PRRSV;基因克隆;重组腺病毒【作者】邓碧亮;顾万军;黄毓茂【作者单位】河源市动物疫病预防控制中心,广东,河源,517000;佛山科学技术学院生命科学学院,广东,佛山,528231:;华南农业大学兽医学院,广东,广州,510642【正文语种】中文【中图分类】S856猪繁殖与呼吸综合症病毒（Porcine Reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）主要引起母猪的繁殖障碍和仔猪的严重呼吸障碍。

自从1996年我国首次证实存在该病之后[1]，因其高度传染性迅速遍及全国各地，给我国养猪业造成了很大的经济损失。

2006年上半年以来全国各地发生的疫情更使此病的控制难度加大。

由于目前的常规疫苗都不太理想[2]，因此，新的PRRSV基因工程疫苗的研制一直都是该病研究的热点之一。

PRRSV为单股正链RNA病毒，属于动脉炎病毒科Arterividae成员，基因组全长约15 kb，包括8个开放阅读框[3]。

PRRSV的ORF5基因编码的糖基化囊膜蛋白（E蛋白）具有较好的免疫原性，能够诱导产生中和抗体，且中和抗体出现之后，抗血清主要识别E蛋白[4]。

此外，E蛋白还具有诱导细胞凋亡、参与病毒粒子与病毒受体结合等过程的作用[5]。

猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白nsp11结构与功能

猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白nsp11结构与功能姜楠;靳换;李逸;陈艳红;周磊【期刊名称】《中国兽医杂志》【年(卷),期】2017(053)008【总页数】4页(P59-62)【作者】姜楠;靳换;李逸;陈艳红;周磊【作者单位】中国农业大学动物医学院,北京海淀100193;中国农业大学动物医学院,北京海淀100193;中国农业大学动物医学院,北京海淀100193;中国农业大学动物医学院,北京海淀100193;中国农业大学动物医学院,北京海淀100193【正文语种】中文【中图分类】S852.65+1猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种严重危害生猪养殖的重要病原，以引起感染母猪繁殖障碍和各日龄猪只呼吸道症状为特征[1]。

PRRSV病原具有免疫抑制、持续性感染和高度变异的特性，其在靶细胞(PAMs)中或体内的增殖能力能够直接影响病毒的致病性，而病毒编码的非结构蛋白(nsp)往往与病毒复制增殖能力密切相关[2]。

此外，PRRSV所具有的免疫抑制特性也是影响其致病性的重要因素之一。

PRRSV感染猪群往往表现出更严重的细菌继发感染，同时PRRSV感染还可抑制其他疫苗的免疫效果。

大量研究表明，PRRSV感染对先天性免疫反应具有明显的抑制效果，尤其表现出对I型干扰素通路(IFN)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)，白介素分子(IL)具有下调作用，而多种病毒编码的非结构蛋白参与该类拮抗效应[3]。

因此，针对PRRSV非结构蛋白的结构功能的研究以及对其与宿主相互作用机制和调控宿主免疫通路的探索成为近年来的研究热点，特别是对PRRSV非结构蛋白nsp11抑制先天性免疫通路、促进病毒复制增殖的分子机制研究以及其晶体结构的解析已成为重点突破方向，本文将对PRRSV nsp11研究领域的进展做一简要综述。

PRRSV属于套式病毒目，动脉炎病毒科,动脉炎病毒属成员，基因组为单股正链RNA，长度约为15 kb。

含有至少12个开放阅读框(ORF)，其中ORF1a编码病毒复制酶多聚蛋白pp1a，其自剪切为nsp1α、nsp1β、nsp2-6，nsp7α、nsp7β和nsp8等非结构蛋白，其中通过-2型核糖体移码可以形成新的nsp2亚型(nsp2TF)[4]。

猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp9蛋白纳米抗体的筛选及其抗病毒功能研究

猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp9蛋白纳米抗体的筛选及其抗病毒功能研究猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由PRRS病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的病毒性传染病,该病在临床上主要引起母猪流产以及各年龄段猪的呼吸道疾病,给全球养猪业带来了巨大的经济损失。

由于PRRSV具有高变性和抗体依赖的增强作用,现有的疫苗并不能给猪群提供完全的保护作用,因此有必要尝试研发新型抗病毒策略。

PRRSV的非结构蛋白9(Nonstructural protein 9,Nsp9)具有RNA依赖的RNA 聚合酶(RNAdependent RNA plolymerase,RdRp)活性,在病毒生命周期中发挥重要作用,并且与其他病毒蛋白相比Nsp9具有更高的保守性,是研发抗PRRSV药物的理想靶蛋白。

纳米抗体(nanobody)具有分子量小、结构稳定、可溶性好、特异性强、生产成本低以及可以识别特殊抗原表位等优点。

目前已有针对多种人类病毒纳米抗体的研究报道,结果显示具有良好的抗病毒活性和临床应用前景,然而在动物病毒上相关的研究报道还比较少。

基于以上背景,本研究利用噬菌体展示技术筛选针对PRRSV Nsp9的特异性纳米抗体,探索其抗病毒活性和机制,为开发新型抗PRRSV的纳米抗体药物提供必要的实验依据和物质基础。

本研究的主要内容和结果如下:1.利用Overlap PCR扩增Nsp9全长基因片段,将其克隆入pET-28a载体,构建了pET-28a-Nsp9重组表达载体。

将其转化Transetta(DE3)感受态细胞,IPTG诱导后,经SDS-PAGE和western blot分析表明Nsp9重组蛋白得到可溶性表达。

经过Ni-NTA亲和层析柱和凝胶过滤层析柱两步纯化,得到具有较高纯度的Nsp9重组蛋白。

猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞受体研究进展

猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞受体研究进展李清州;达龙珠;鲍登克;陈海燕;杨春英;刘毓霞;乔松林【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2010(31)12【摘要】猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是引起猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的病原,对PRRSV细胞受体的研究将有助于揭示PRRSV的感染途径、复制过程、致病机理和疫病预防及控制等一系列问题,细胞受体的研究已经成为目前PRRSV研究中的重要领域.论文从硫酸乙酰肝素受体、唾液酸黏附素受体、CD163分子、波形蛋白等方面综述了PRRSV细胞受体研究进展.【总页数】4页(P100-103)【作者】李清州;达龙珠;鲍登克;陈海燕;杨春英;刘毓霞;乔松林【作者单位】河南省农业科学院,农业经济与信息研究中心,河南郑州,450002;河南省农业科学院,农业经济与信息研究中心,河南郑州,450002;河南省农业科学院,农业部动物免疫学重点开放实验室河南省动物免疫学重点实验室,河南郑州,450002;河南省农业科学院,农业经济与信息研究中心,河南郑州,450002;河南省农业科学院,农业经济与信息研究中心,河南郑州,450002;河南省农业科学院,农业经济与信息研究中心,河南郑州,450002;河南省农业科学院,农业部动物免疫学重点开放实验室河南省动物免疫学重点实验室,河南郑州,450002【正文语种】中文【中图分类】S852.659.6【相关文献】1.猪繁殖与呼吸综合征病毒对猪免疫力的影响研究进展 [J], 尹剑;张辉;祁磊;宋朦;崔焕忠2.猪呼吸与繁殖综合征病毒细胞受体研究进展 [J], 乐涛;余欢;朱礼倩;毕丁仁3.猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞受体研究进展 [J], 李红;周恩民;易建中4.猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞受体功能研究进展 [J], 王向鹏;陈璐;张赟5.猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型混合感染研究进展 [J], 温永俊;蔡雪辉因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

穿膜肽TAT和R9的生物学效应的体内体外研究

穿膜肽TAT和R9的生物学效应的体内体外研究徐咏婷; 陈燕; 余雳; 谭桂湘; 谭拥军; 黄明敏【期刊名称】《《激光生物学报》》【年(卷),期】2019(028)004【总页数】7页(P323-329)【关键词】细胞穿膜肽; 穿膜效率; 活体穿膜【作者】徐咏婷; 陈燕; 余雳; 谭桂湘; 谭拥军; 黄明敏【作者单位】湖南大学生物学院长沙410082【正文语种】中文【中图分类】Q784细胞穿膜肽也称为蛋白转导域，它是一类能携带蛋白质、多肽等一些其他的生物大分子穿过哺乳动物细胞膜的短肽[1]，直接将这些起治疗作用的蛋白质、多肽等穿过细胞膜进入细胞发挥生物作用并保持生物活性[2-5]。

蛋白质转导现象最初是在对来源于HIV1的反式激活蛋白(HIV-1-transactivatorprotein，TAT)的研究中发现的[6,7]，该蛋白是具有穿膜能力的特殊肽段区域[8]，其核心序列是由11个氨基酸组成，序列为YGRKKRRQRRR[9]。

自从TAT发现以来,许多肽被添加到CPP(cell penetrating peptide)家族中,其中包括人工合成的多聚精氨酸R9[10],多聚精氨酸R9通过融合9个精氨酸组成细胞穿膜肽[11]。

细胞穿膜肽TAT和R9有着的不同序列，因此在穿膜的过程中它们的效率和穿膜机制等均不相同；在利用细胞穿膜肽成药时，会根据细胞穿膜肽的特性选择相应的穿膜肽。

除了考虑穿膜肽的特性之外，同时还需考虑其毒性，在应用到细胞中时，浓度过高常常会导致细胞毒性增加，细胞将受到影响，同样在应用到小鼠体内时，也会产生和细胞同样的结果，在不断提高注射浓度时，容易增加细胞毒性[12]。

本试验通过构建细胞穿膜肽TAT-EGFP(HIV-1-transactivator-green fluorescent protein)的原核表达体系，采用His-Tag亲和纯化的方法对融合蛋白进行纯化，比较两种融合蛋白在乳腺癌细胞231中不同浓度梯度下对细胞的影响，并通过腹腔注射到小鼠体内，观察两种融合蛋白在不同器官中的分布，为如何选择细胞穿膜肽进行试验提供依据。

猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白Nsp9基因的克隆与原核表达

猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白Nsp9基因的克隆与原核表达沈张奇;郭鑫;杨汉春;盖新娜;陈艳红;查振林【期刊名称】《中国兽医杂志》【年(卷),期】2007(043)010【摘要】通过PCR方法从重组质粒pSK-B2扩增得到非结构蛋白Nsp9的基因片段.将基因克隆至原核表达载体pET-28a(+),得到重组表达载体pET-28-Nsp9,转化Escherichia coli BL21(DE3)细胞.经IPTG诱导,Nsp9蛋白以包涵体形式表达,SDS-PAGE分析表明重组蛋白的分子量约为27.3 kD,表达量占菌体蛋白的43.2%.Western-Blotting结果表明重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别.表达的重组蛋白为进一步研究PRRSV的免疫特性和分子生物学功能奠定了基础.【总页数】3页(P3-5)【作者】沈张奇;郭鑫;杨汉春;盖新娜;陈艳红;查振林【作者单位】中国农业大学,农业部预防兽医学重点开放实验室,北京,海淀,100094;中国农业大学,农业部预防兽医学重点开放实验室,北京,海淀,100094;中国农业大学,农业部预防兽医学重点开放实验室,北京,海淀,100094;中国农业大学,农业部预防兽医学重点开放实验室,北京,海淀,100094;中国农业大学,农业部预防兽医学重点开放实验室,北京,海淀,100094;中国农业大学,农业部预防兽医学重点开放实验室,北京,海淀,100094【正文语种】中文【中图分类】Q786【相关文献】1.口蹄疫病毒非结构蛋白3AB、3A基因的克隆与原核表达 [J], 张先锋;易忠;魏玉荣;胡尔玛西;符子华2.口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC基因的克隆与原核表达 [J], 张先锋;易忠;魏玉荣;符子华;胡尔玛西3.口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC基因的克隆及3AB基因的原核表达 [J], 曹轶梅;刘在新;卢曾军;胡永浩;常惠芸;谢庆阁4.猪繁殖与呼吸综合征病毒JL07SW株Nsp9基因的序列分析及原核表达 [J], 黄志强;张学东;丁壮;张泉鹏;宣华5.猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白NSP2的原核表达及其单克隆抗体的制备[J], 王海燕;姜平;杜以军;李玉峰;李军星;沈芳因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

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细胞穿膜肽TAT介导猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp9纳米抗体
Nb6抗病毒感染的研究
猪繁殖与呼吸综合症（PRRS）是一种以猪繁殖障碍和呼吸疾病为特征的病毒性传染病,是目前造成全球养猪业巨大经济损失的重要传染病之一。

该病由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起。

PRRSV以高变性、免疫抑制、持续性感染及抗体依赖性增强为特征,现有疫苗的群体保护力较低,尚无有效的抗病毒药物。

PRRSV非结构蛋白Nsp9是RNA依赖的RNA聚合酶,在不同毒株间高度保守,被认为是抗PRRSV药物的一个重要靶标。

在先前的研究中,本实验室成功制备出一株PRRSV Nsp9特异性纳米抗体Nb6,并且证明细胞内表达的Nb6可以显著抑制PRRSV在MARC-145细胞中的复制。

然而,由于纳米抗体不能有效穿过细胞膜,因此不能进入细胞达到抗病毒的作用。

因此,制备安全、有效和无细胞毒性的细胞内递送系统对于提高Nb6的抗病毒活性至关重要。

细胞穿透肽（cell penetrating peptides,CPPs）是一类含有约5-30个氨基酸的短肽,可以通过直接易位或内吞作用等方式进入细胞内,且不会引起细胞毒性。

目前,CPPs已经被用作向细胞内递送各种货物的工具,例如质粒DNA,siRNA,蛋白质,病毒,成像剂和其他各种纳米颗粒等。

TAT蛋白（HIV-1 trans-activator）是人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）反式激活因子,是最早被报道的CPPs。

目前已有关于TAT与纳米抗体融合蛋白在癌症治疗中的研究报道,结果表明其具有显著的抗癌效果,并有望被开发为新型抗癌药物。

然而,关于CPPs在PRRSV防控中的应用尚未有研究报道。

基于以上背景,本研究利用原核表达系统成功表达TAT-Nb6融合蛋白,对其穿膜及抗PRRSV功能进行验证,并对Nb6的抗病毒机制进行初步探索,为抗PRRSV
纳米抗体药物的研发提供一定的理论基础。

主要研究内容及结果如下:1.细胞穿膜肽TAT介导纳米抗体穿膜的研究本研究首先利用原核表达表达系统获得
TAT-Nb6融合蛋白。

通过Overlap PCR扩增获得TAT-Nb6基因片段,将其克隆至原核表达载体pET-21b中,构建pET-21b-TAT-Nb6重组表达质粒。

该重组质粒转化至BL21（DE3）感受态细胞中,IPTG诱导后,获得以包涵体形式表达的TAT-Nb6融合蛋白。

经Ni-NTA亲和层析柱纯化、复性和浓缩得到高纯度的TAT-Nb6,并通过ELISA方法验证了TAT-Nb6与PRRSV Nsp9重组蛋白具有很强的结合力。

然后将TAT-Nb6分别加入到MARC-145细胞和PAMs细胞的培养基中,与细胞进行共孵育,并利用Western blot、间接免疫荧光和流式细胞术检测两种细胞内TAT-Nb6的量。

实验结果表明,TAT能够介导纳米抗体Nb6进入两种细胞,并且呈时间和剂量依赖性。

随后对细胞活性进行检测,发现TAT-Nb6浓度≤30μM时对两种细胞均没有细胞毒性。

我们进一步验证了TAT-Nb6在猪体内的穿膜能力,免疫组织化学实验结果表明,TAT-Nb6在所有的收集的组织中都有分布。

本部分研究结果表明,原核表达的TAT-Nb6融合蛋白不仅可以与PRRSV Nsp9重组蛋白发生互作,同时具有进入细胞的能力。

2.TAT-Nb6抗PRRSV的研究本研究通过病毒感染实验来研究TAT-Nb6的抗PRRSV功能。

结果表明,TAT-Nb6可以抑制PRRSV基因1型（GZ11-G1）与2型（SD16、JX-A1、GD-HD、VR-2332）毒株在MARC-145细胞系或原代PAM细胞上的增殖,并且呈剂量依赖性。

同时发现TAT-Nb6对PRRSV的抑制效果在不同毒株间存在差异。

为了初步探索Nb6抗PRRSV的机制,我们利用酵母双杂交技术寻找Nb6与Nsp9的结合区域。

结果表明,Nb6与Nsp9互作位点位于Nsp9羧基端的两个不连续区
域:Nsp9aa454-551和Nsp9aa599-646。

进一步对Nsp9 aa 454-646氨基酸同源性进行分析,结果发现基因1型不同毒株间同源性达到92.2%-100%,2型毒株间达到92.7%-100%,而两种基因型之间同源性只有77.7-81.3%。

综上所述,本研究成功表达了TAT-Nb6融合蛋白,该蛋白能够进入到PRRSV感染的细胞内,并发挥抗病毒作用,具有开发为抗PRRSV新型药物的潜力。

同时对Nb6抗PRRSV的机制进行初步探索,为抗PRRSV 纳米抗体药物的研发提供一定的理论基础。