色谱分析第三章(2)
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第三章 离子排斥色谱法
8 7 6 5 25 30 35 40 45 50
Temperature/℃
1
保留时间与色谱柱温度的关系 图。p-甲苯磺酸 + 乙腈淋 洗液。1. 柠檬酸；2. 酒石酸；3. 苹果酸；4. 琥珀酸；5. 乳酸 ；6. 甲酸；7. 乙酸
色谱柱温度的影响
70 60
Retention time(min)
1.0
1.2
1.5
Flow rate/(mL/min)
保留时间与乙腈体积分数关系 图。p-甲苯磺酸 + 乙腈 淋洗液。 1. 柠檬酸；2. 酒石酸；3. 苹果酸；4. 琥珀酸；5. 乳酸；6. 甲酸；7. 乙酸
色谱柱温度的影响
11 10 9
Retention time/min
7 6 5 4 3 2
1.0 分离柱: 淋洗液: 流速: 检测: 抑制器: 样品: 进样量： 色谱峰: 6 IonPac ICE-AS6 10 mmol/L 全氟丁酸 1.0 mL/min 电导 AMMS-ICE 抑制器 0.25% 硫酸 50 µ L 1. 柠檬酸 0.5 mg/L 2. 苹果酸 1.0 3. 乙二醇酸 1.0 4. 乳酸 1.0 5. 乙酸 1.0 6. 琥珀 酸 1.0
H20
H20 H20 CH3COOH
SO3H+ H20 SO3 H+
Donnan-膜
3.2 离子排斥色谱法分离机理
Donnan 排斥
吸附
空间排阻
常见无机酸和有机酸在离子排 斥色谱柱上的相对保留值
酸 硫酸 甲苯基磺酸 亚硫酸 5-磺基水杨酸 氨基磺酸 盐酸 丁炔二酸 三氯乙酸 半乳糖二酸 磷酸 柠檬酸 甲叉丁二酸 丙酮酸 丙二酸
甘油酸 硼酸 L-磺基丙氨酸 马来酸 草酸 三甲基醋酸
色谱学 第三章 薄层色谱
在吸附色谱过程中，溶质、溶剂和吸附剂三 者是相互联系而又相互竞争的，如此构成了 整个层析分离过程 。 在薄层吸附色谱过程中，主要为物理吸附， 无选择性。因之吸附剂与多元组分溶液接触 时，一方面任何溶质都可被吸附（当然单位 重量吸附剂所能吸附物质的量，即“吸附量” 会因物质种类而异），另一方面，吸附剂也 可吸附流动相分子。由于物理吸附是可逆的， 故被吸附的分子同时也可被解吸出来。
偶氮染料 偶氮苯 对甲氧基偶氮苯 苏丹黄 苏丹红 对氨基偶氮苯 对羟基偶氮苯
Ⅱ 0.61 0.28 0.18 0.11 0.04 0.01
表3-2 硅胶活度分级法 Rf Ⅲ Ⅳ 0.70 0.83 0.43 0.67 0.30 0.53 0.13 0.40 0.07 0.20 0.01 0.07
除上二种外，还有其他一些吸附剂。吸附剂品种如下： （1）硅胶：薄层色谱用为200~250目粒度，规格很多，一般如有石膏作粘 结剂，称硅胶G；石膏含量为5~20%，一般为10~13%，亦有用淀粉作粘 结剂的，称硅胶S，不加粘结剂者称硅胶H或硅胶N，为了便于观察组分的 斑点，也可在硅胶中加入荧光指示剂。如果又加有粘结剂时，则称为硅胶 GF或硅胶GF254，即吸收254nm紫外光。 （2）氧化铝：根据加有粘结剂情况不同，有H、G、HF、GF等品种。 （3）硅镁吸附剂：即费罗里硅土，使用前要在130℃下活化二小时。 （4）纤维素：长度仅为2~20微米的短纤维，分天然纤维和微晶纤维两种 形式，也可加粘合剂、一般用于亲水性物质的分离，如羟基化物等，但缺 点为不能用浓硫酸等腐蚀性溶剂进行显色。 （5）聚酰胺：这是一种使用广泛的有机吸附剂，多用于分离酚类化合物， 样品容量大，但粘结能力差，可加入纤维素或淀粉作粘结剂。 （6）烧结薄层板：这是一种多次使用的薄层板，是由200~300目石英或玻 璃粉，与200~300目硅胶或氧化铝按1：25重量混合，用乙醇调成浆料，涂 在玻璃板上。0.25~0.3毫米厚，然后在700~780℃高温下烧结，即成烧结板。 烧结板用一次后可用乙醇或其它有机溶剂洗涤，最后用水洗干净后烘干再 继续使用。
第三章 液相色谱法
2010/3/29
流动相脱气方法
• 1.超声波振荡脱气： 将配制好的流动相连容器 放入超声水槽中脱气10-20min。这种方法比较 简便，又基本上能满足日常分析操作的要求， 所以，目前仍广泛采用。 2.惰性气体鼓泡吹扫脱气： 将气源（钢瓶）中 的气体（氦气）缓慢而均匀地通入储液罐中的 流动相中，氦气分子将其它气体分子置换和顶 替出去，而它本身在溶剂中的溶解度又很小， 微量氦气所形成的小气泡对检测无影响。
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四、注意事项
1. 流动相要过滤、脱气 2. 样品要过滤 3. 检测器要匹配 4. 进样前要注意系统是否平衡 5. 使用梯度洗脱时，进样前系统要回到 初始状态 • 6. 注意柱压 • • • • •
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第三章 液相色谱分析法
第一节 高效液相色谱法
一、高效液相色谱法 的特点 二、流程及主要部件 三、高效液相色谱法 的主要分离类型
2010/3/29
液相色谱仪（1）
2010/3/29
液相色谱仪（2）
2010/3/29
液相色谱仪（3）
2010/3/29
液相色谱仪（4）
2010/3/29
一、高效液相色谱法的特点
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流动相脱气方法
• 3.真空脱气装置： 将流动相通过一段由多孔性合成树 脂膜制造的输液管，该输液管外有真空容器，真空泵 工作时，膜外侧被减压，分子量小的氧气、氮气、二 氧化碳就会从膜内进入膜外而被脱除。
2010/3/29
色谱方法选择
2010/3/29
Polarity (极性）
Non-polar
流动相脱气方法
• 1.超声波振荡脱气： 将配制好的流动相连容器 放入超声水槽中脱气10-20min。这种方法比较 简便，又基本上能满足日常分析操作的要求， 所以，目前仍广泛采用。 2.惰性气体鼓泡吹扫脱气： 将气源（钢瓶）中 的气体（氦气）缓慢而均匀地通入储液罐中的 流动相中，氦气分子将其它气体分子置换和顶 替出去，而它本身在溶剂中的溶解度又很小， 微量氦气所形成的小气泡对检测无影响。
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四、注意事项
1. 流动相要过滤、脱气 2. 样品要过滤 3. 检测器要匹配 4. 进样前要注意系统是否平衡 5. 使用梯度洗脱时，进样前系统要回到 初始状态 • 6. 注意柱压 • • • • •
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第三章 液相色谱分析法
第一节 高效液相色谱法
一、高效液相色谱法 的特点 二、流程及主要部件 三、高效液相色谱法 的主要分离类型
2010/3/29
液相色谱仪（1）
2010/3/29
液相色谱仪（2）
2010/3/29
液相色谱仪（3）
2010/3/29
液相色谱仪（4）
2010/3/29
一、高效液相色谱法的特点
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流动相脱气方法
• 3.真空脱气装置： 将流动相通过一段由多孔性合成树 脂膜制造的输液管，该输液管外有真空容器，真空泵 工作时，膜外侧被减压，分子量小的氧气、氮气、二 氧化碳就会从膜内进入膜外而被脱除。
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色谱方法选择
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Polarity (极性）
Non-polar
2020年智慧树知道网课《色谱分析》课后章节测试满分答案
第一章测试1【判断题】(2分)色谱的分离的核心部分是色谱柱。
A.对B.错2【判断题】(2分)色谱分析法只能测定有色物质。
A.对B.错3【判断题】(2分)吸附色谱是利用吸附剂对样品的吸附性能不同达到分离。
A.对B.错4【判断题】(2分)气固色谱和液固色谱都是吸附色谱。
A.对B.错5【判断题】(2分)基于组份在两项之间溶解或吸附能力的不同，经过反复多次的平衡，使性质有微小差别的组份分离。
（）A.错B.对第二章测试1【单选题】(2分)衡量色谱柱选择性的指标是（）。
A.分配系数B.相对保留值C.容量因子D.理论塔板数2【单选题】(2分)衡量色谱柱柱效的指标是（）。
A.分配系数B.理论塔板数C.相对保留值D.容量因子3【单选题】(2分)下列途径（）不能提高柱效。
A.降低固定相颗粒粒度B.减小固定液液膜厚度C.将试样进行预分离D.调节载气流速4【单选题】(2分)在一定柱长条件下，某一组分色谱峰的宽窄主要取决于组分在色谱柱中的（）。
A.分配系数B.扩散速率C.保留值D.容量因子5【单选题】(2分)色谱柱温升高的结果是（）。
A.组分的保留体积减小B.组分在固定液中的溶解度增大C.两组分的分离度增加D.两组分的相对保留值不变6【判断题】(2分)组分的分配系数越大，表示其保留时间越长。
（）A.错B.对7【判断题】(2分)在载气流速比较高时，分子扩散成为影响柱效的主要因素。
（）A.错B.对8【判断题】(2分)分离温度越高，保留时间缩短，峰面积不变。
（）A.对B.错9【判断题】(2分)某试样的色谱图上出现三个色谱峰，该试样中最多有三个组分。
（）A.错B.对10【判断题】(2分)色谱柱理论塔板数n与保留时间的平方成正比，组分的保留时间越长，色谱柱理论塔板数越大，分离效率越高。
（）A.错B.对第三章测试1【判断题】(2分)根据色谱峰的面积可以进行定性和定量分析。
()A.对B.错2【判断题】(2分)采用内标法进行高效液相色谱法定量时，需知校正因子。
高效液相色谱提纲
高效液相色谱提纲色谱的基础知识第一章色谱分析法概述一、色谱分析法发展简介二、色谱法分类1、按两相状态分类2、按操作形式分类3、按分离原理分类三、HPLC与其他方法的比较1. 色谱法与精馏、萃取分离比较2. 色谱法与光谱、质谱分析方法比较3. 高效液相色谱与经典色谱的比较4. 液相色谱与气相色谱的比较四、色谱法特点五、现代色谱法应用领域六、有关色谱主要期刊与书籍第二章色谱分析法的理论基础一、色谱流出曲线二、色谱图中的基本术语三、分配平衡四、色谱法的基本理论五、色谱法基本分离方程第三章色谱定性分析和定量分析一、定性分析二、定量分析高效液相色谱的知识第四章高效液相色谱仪第五章色谱分离系统一、液相色谱分离原理及分类（一）分离原理（二）高效液相色谱法的主要类型二、高效液相色谱的固定相1. 高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类2.高效液相色谱固定相按孔隙深度分类3. 高效液相色谱固定相以化学组成来分类三、流动相1.对流动相溶剂的要求：2. 流动相及流动相的极性3. 流动相的组成四、色谱柱1. 色谱柱的构型2. 色谱柱寿命第六章液固色谱法和液液色谱法一、液一固吸附色谱法(LSAC)1．分离原理 2.固定相 3.流动相二、液一液分配色谱法（LLPC）1．分离原理 2.固定相 3.流动相第七章化学键合相色谱法一、化学键合固定相二、反相键合相色谱法三、正相键合相色谱法四、离子性键合相色谱法第八章离子交换和离子色谱法一、离子交换色谱法1．离子交换色谱原理2．固定相3．流动相二、离子色谱法1.离子色谱法原理2.离子色谱具有以下优点3.离子色谱装置类型4.离子色谱的应用第九章体积排阻色谱法高效液相色谱同时测定食品中的苯甲酸、山梨酸、糖精钠、维生素C高效液相色谱同时测定药品中的苯甲酸与水杨酸样品处理、条件优化及应用第十章色谱分析样品处理一、样品的采集二、常用样品制备技术（一）溶剂萃取***1. 液-液萃取液-液萃取新技术——液相微萃取2. 液-固萃取3. 液-气萃取（溶液吸收）4. 萃取溶剂的选择（二）蒸馏1. 简单蒸馏2. 分馏3. 减压蒸馏4. 水蒸气蒸馏（三）固相萃取***1. 固相萃取的模式及原理2. 固相萃取的常用吸附剂3. 固相萃取的装置及操作程序4. 固相萃取技术的应用（四）膜分离（五）衍生化技术*（六）其它样品制备技术*1. 超临界流体萃取2. 微波萃取技术第十一章衍生化技术及浓缩柱一、衍生化技术（一）按衍生化反应分类1.衍生化反应满足条件2. 按衍生化反应类别分类（二）按衍生化的方式分类1. 柱前衍生2. 柱后衍生二、浓缩柱第十二章高效液相色谱分离条件的优化及建立分析方法的一般步骤一、高效液相色谱分离条件的优化（一）高效液相色谱中色谱参数的相关性1. 色谱参数的分类2. 色谱参数的相关性（二）色谱分离条件优化标准的选择1. 难分离物质对的峰对分离优化标准2. 整体色谱图的优化标准二、建立HPLC分析方法的一般步骤（一）样品的性质及柱分离模式的选择1. 样品的溶解度2. 样品的分子量范围3. 样品的分子结构和分析特性（二）分离操作条件的选择1. 容量因子和死时间的测量2. 色谱柱操作参数的选择3. 样品组分保留值和容量因子的选择4. 相邻组分的选择性系数和分离度的选择第十三章高效液相色谱法的实验技术和分析应用一、高效液相色谱法的实验技术1. 溶剂的纯化技术2. 色谱柱的装填技术3. 色谱柱的平衡、保护与清洗、再生技术二、HPLC法的分析应用第十四章液相制备色谱。
(第三章)药物分析-色谱分析法
纸色谱
1）紫外光 ：对未知化合物，展开后在用显色剂以前，应先在紫 外灯下进行察看。紫外光常用两种波长254 nm与365 nm。
2）碘：碘是一种非破坏性显色剂，价廉易得，显色迅速、灵敏。 与物质的反应往往是可逆的。
3）水：为非破坏性显色剂，用于硅胶薄层，纸色谱不常用。
纸色谱
④ 测量Rf值与鉴定：
必须注意：展开剂也须事先用缓冲液平衡后再使用。
斑点拖尾现象形成的几种原因：
① 点样量过多，超过了滤纸溶剂的溶解能力。
② 物质电离，导致Rf值差异。
③ 被分离的物质与滤纸上的Cu2+、Ca2+、Mg2+等杂质形 成络合物而形成拖尾，可改用纯滤纸展开。 ④ 某些物质在展开过程中分解，产物有不同的Rf值。
样点朝上，展开剂从上向下通过薄层或滤纸。展开 剂通过滤纸条或纱布条作为桥梁进行转移。展开剂 受吸附和重力的双重作用，展开较快。
特 殊 装 置
纸色谱的下行展开法
3. 双向展开
用于某些复杂成分或Rf值较小的成分的展开
B
d
C
c
b
a
d
c
b
a
A
混合样品
CB
A
**边缘效应： 消除边缘效应的方法： 1. 将展开槽、纸或薄层板用展开剂蒸气饱和； 2. 在层析缸内壁贴上用展开剂浸湿的滤纸条； 3. 点样位置距离边缘一定距离。
（1）氧化铝：有碱性、中性和酸性三类，粒度规格大多为100～150目。 碱性氧化铝（pH9~10）：适用于碱性物质（如胺、生物碱）和对酸敏感的 样品（如缩醛、糖苷等），也适用于烃类、甾体化合物等中性物质的分离。 酸性氧化铝（pH3.5~4.5）：适用于酸性物质如有机酸、氨基酸等以及色素 和醛类化合物的分离。 中性氧化铝（pH7~7.5）：适用于醛、酮、醌、苷和硝基化合物以及在碱性 介质中不稳定的物质如酯、内酯等的分离，也用来分离弱的有机酸和碱等。
气相色谱分析
2021/8/1
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1.色谱法概述
色谱法是一种分离技术。在分析化学 领域中是一种新型的分离分析方法。 气相色谱是色谱中普遍使用的一种。
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6
1.1 色谱法的产生和发展
俄 国 植 物 学 家 Tsweet 发 明 的 方 法后来被称为“经典液相色谱 法”。 （1906年） 所使用的玻璃管称为色谱柱。 管内的碳酸钙填充物称为固定 相。 淋洗液称为流动相或淋洗剂。 混合物中的各组分被称为溶质。
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❖色谱法普遍用来分离无色物质，但色谱法 这个名称一直被沿用下来。
❖1941年Martin和Synge 发现了液-液（分配）
色谱法，阐述了气-固吸附色谱原理，提出 气-液色谱法设想； (1952 年诺贝尔化学奖)
❖色谱学成为分析化学的重要分支学科，则 是以气相色谱的产生、发展为标志。
内径细 0.1-0.5mm 柱长 50-300m/常用石英
毛细管柱
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2.5 检测系统
➢检测器、控温装置 ➢将经色谱柱分离后的各组分按其特性及
含量转化为相应的电讯号。
➢根据检测原理不同，浓度型、质量型
➢浓度型：热导池、电子捕获检测器 ➢质量型：氢火焰离子化、火焰光度检测
器
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第 一 1 色谱法概述 章 2 气相色谱仪
气 3 气相色谱分析理论基础
相 色
4 分离条件的选择
谱 5 检测器
分 析
6 定性定量方法
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主要参考书目
❖ 仪器分析，朱明华，高等教育出版社 ❖ 现代仪器分析，杜廷发，国防科技大学
第三章 气相色谱法
分离室：准确控制分离需要的温度。当试样复杂时， 分离室温度需要按一定程序控制温度变化，各组分 在最佳温度下分离。
5）检测系统
色谱仪的眼睛，通常由检测器、放大器、记录仪三部 分组成；
被色谱柱分离后的组分依次进入检测器，按其浓度 或质量随时间的变化，转化成相应电信号，经放大 后记录和显示，给出色谱图； 检测器：广谱型—对所有物质均有响应； 专属型—对特定物质有高灵敏响应；
毛细管柱结构流程
具有分流和尾吹装置
二、气相色谱的特点
① ② ③ ④ ⑤
分离效率高 灵敏度高 选择性好 分析速度快 应用范围广
第二节 气相色谱固定相
1. 固体固定相 2. 液体固定相 3. 合成固定相
一、固体固定相
一般采用固体吸附剂，主要用于分离和分 析永久性气体及气态烃类物质。 1. 强极性的硅胶 2. 弱极性的氧化铝 3. 非极性的活性炭 4. 特殊吸附作用的分子筛：碱及碱土金属的 硅铝酸盐（沸石），多孔性。
当试样由载气携带进入色谱 柱与固定相接触时，被固定 相溶解或吸附。 随着载气的不断通入，被溶 解或吸附的组分又从固定相 中挥发或脱附， 挥发或脱附下的组分随着载 气向前移动时又再次被固定 相溶解或吸附。 随着载气的流动，溶解、挥 发，或吸附、脱附的过程反 复地进行。
2、气相色谱流程
1-载气钢瓶；2-减压阀； 3-净化干燥管；4-针形 阀；5-流量计;6-压力表； 4-针形阀；5-流量计;6压力表；9-热导检测器； 10-放大器；11-温度控制 器；12-记录仪；
固定液一般为高沸点有机物，均匀涂在担体 表面，呈液膜状态。
1）对固定液的要求 选择性好：填充柱：r2,1>1.15，毛细管柱r2,1>1.08 热稳定性好 化学稳定性好 对试样各组分有适当的溶解能力 黏度低、凝固点低
第三章 第二节 填充柱气相色谱
极性固定液
适于分离 非极性、弱极性化合物 极性化合物
常见的载体
载体 特点 用途 产地
白 色
101，102 白色载体
PH>7 略呈 碱性
适用于涂渍极性 固定液，分析极
性或碱性物质
上海试剂一 厂
硅 101,102硅烷 藻 化白色载体
经过硅烷化 处理
分析氢键型化合 物
上海试剂一 厂ຫໍສະໝຸດ 土 载Celite545 Chromosorb （A、G、W）
相对极性在0～+l之间的叫非极性固定液 +2为弱极性固定液 +3为中等极性 +4～+5为强极性。
非极性亦可用“－”表示。
表中列出了一些常用固定液的相对极性数据。
（4）固定液的选择
对固定液的选择并没有规律性可循。一 般可按“相似相溶”原则来选择。在应用时， 应按实际情况而定。
（i）分离非极性物质：一般选用非极性固定液， 这时试样中各组分按沸点次序流出，沸点低的先 流出，沸点高的后流出。
后，破碎过筛而得，因铁生成氧化铁呈红色，故 称红色载体，其特点是表面孔穴密集、孔径较小、 比表面积较大。对强极性化合物吸附性和催化性 较强，如醇、胺、酸等极性化合物会因吸附而产 生严重拖尾。因此它适宜于分析非极性或弱极性 物质。国产：6201，201；301等。
白色载体: 是将硅藻土与20％的碳酸钠（助
这种分子间作用力是一种较弱的分子间 的吸引力，它不像分子内的化学键那么强。
它包括取向力、诱导力、色散力、静电力 和氢键等作用力。前三种统称范德华力。而氢 键力则与它们有所不同，是一种特殊的范德华 力。
（3）固定液的分类
• 固定液有几百种，根据固定液的化学结构、 官能团性质、固定液相对极性及分析对象 有几种分类方法，目前最常用的是用相对 极性表示。
仪器分析 第三章高效液相色谱分析
主要分离机理
吸附能，氢键 疏水分配作用 溶质分子大小 库仑力 立体效应 生化特异亲和力
主要分析对象或应用领域
异构体分离、族分离，制备 各种有机化合物的分离、分析与制备 高分子分离，分子量及其分布的测定 无机离子、有机离子分析 手性异构体分离，药物纯化 蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析
第二节 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素
同时消耗样品少。
2、HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：
（1）速度快-通常分析一个样品在15～30 min，有些样 品甚至在5 min内即可完成。 （ 2 ）分辨率高 - 可选择固定相和流动相以达到最佳分离 效果。 （3）灵敏度高-紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学 检测器可达0.1pg。 （ 4 ）柱子可反复使用 - 用一根色谱柱可分离不同的化合 物。 （ 5 ）样品量少，容易回收 - 样品经过色谱柱后不被破坏， 可以收集单一组分或做制备。
基本要求： ①流量稳定，其RSD应＜0.5%，这对定性定 量的准确性至关重要；②流量准确可调，0.1～10 ml/min， ③输出压力高，一般应能达到 150 ～ 300kg/cm2 ；④液流稳 定，无脉动；⑤ 死体积小，要求小于0.5ml。⑥密封性能好， 耐腐蚀。
泵的使用及注意事项： ①防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任何杂 质微粒都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预 先过滤除去流动相中的任何固体微粒，泵的入口都应连接 砂滤棒。 ②流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动 相不应保留在泵内，尤其是在停泵过夜或更长时间的情况 下。如果将含缓冲液的流动相留在泵内，由于蒸发或泄漏， 甚至只是由于溶液的静臵，就可能析出盐的微细晶体，这 些晶体将和上述固体微粒一样损坏密封环和柱塞等。 因此，用后必须泵入纯水将泵充分清洗后，再换成适合于 色谱柱保存和有利于泵维护的溶剂（如对于反相键合硅胶 固定相，可以是甲醇或甲醇-水）。
大学 师范类 化学专业 仪器分析学科 第三章高效液相色谱法
HPLC
阳离子交换
- + M++ RSO3 H
H+ + RSO3 M+
-
阴离子交换
Cl X RNR+ + 3
阳离子交换树脂
RNR3 X + Cl-
+
-
3、流动相
水相缓冲液+有机溶剂
调节选择性的 主要参数
盐种类及浓度 pH值
各种阴离子的在阴离子交换剂上的滞留次序：
2 2 2 柠檬酸离子 SO4 C 2O4 I NO3 CrO4 Br
( BH+ RSO3 )m ( BH+ RSO3 ) s
离子对
+ + 通式 B+ + A ( ) ( B B A A )s m 疏水性离子对不易在水中离解而迅速进入有机相中， 存在下述萃取平衡：
X+水相+ Y-水相
[B A ]s [ B A ]s KB A [B ]m [B ]m [A ] m
故要减小He，提高柱效，应采用小颗粒固定 相并填充均匀。
HPLC
2、分子扩散相Hd（纵向扩散项）
cd Dm Hd u
cd ：常数
Dm ：分子在流动相中的扩散系数
u :
流动相流速
Dm 一般很小，当u较大时，Hd很小，Hd可忽略
HPLC
3、传质阻力项
HPLC
（1） 固定相传质阻力项
Hs Cs d f Ds u
硅烷化反应
硅胶
十八烷基 氯硅烷
ODS(C18)键合相 非极性
键合固定相类 型 疏水基团 烷烃（C8和C18）、苯基等 极性基团 丙氨基 氰乙基 醚和醇等
阳离子交换
- + M++ RSO3 H
H+ + RSO3 M+
-
阴离子交换
Cl X RNR+ + 3
阳离子交换树脂
RNR3 X + Cl-
+
-
3、流动相
水相缓冲液+有机溶剂
调节选择性的 主要参数
盐种类及浓度 pH值
各种阴离子的在阴离子交换剂上的滞留次序：
2 2 2 柠檬酸离子 SO4 C 2O4 I NO3 CrO4 Br
( BH+ RSO3 )m ( BH+ RSO3 ) s
离子对
+ + 通式 B+ + A ( ) ( B B A A )s m 疏水性离子对不易在水中离解而迅速进入有机相中， 存在下述萃取平衡：
X+水相+ Y-水相
[B A ]s [ B A ]s KB A [B ]m [B ]m [A ] m
故要减小He，提高柱效，应采用小颗粒固定 相并填充均匀。
HPLC
2、分子扩散相Hd（纵向扩散项）
cd Dm Hd u
cd ：常数
Dm ：分子在流动相中的扩散系数
u :
流动相流速
Dm 一般很小，当u较大时，Hd很小，Hd可忽略
HPLC
3、传质阻力项
HPLC
（1） 固定相传质阻力项
Hs Cs d f Ds u
硅烷化反应
硅胶
十八烷基 氯硅烷
ODS(C18)键合相 非极性
键合固定相类 型 疏水基团 烷烃（C8和C18）、苯基等 极性基团 丙氨基 氰乙基 醚和醇等
色谱分析课件
用GF254板 -------显色剂显色,破坏性检出方法
通用显色剂
定性分析
1. 与标准对照品在三种不同的展开剂中展开 (加熔点)；
2. 制备TLC，将待定性化合物分离后，刮下、 洗脱，再波谱分析；
3. TLC与其它技术联用
定量分析
1. 间接定量（洗脱测定法）； 2. 直接定量（薄层扫描法）
薄层扫描法：以一定波长的光照射展开后 的薄层色谱板上被分离组分的斑点，测定 斑点对光的吸收强度或所发出的荧光强度， 进行定量分析的方法。 薄层吸收扫描法 薄层荧光扫描法
色谱法的特点
（1）分离效率高 复杂混合物，有机同系物、异构体。手性异构体。
（2） 灵敏度高 可以检测出μg.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。
（3） 分析速度快 一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。
（4） 应用范围广 气相色谱：沸点低于400℃的各种有机或无机试样的分析。 液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。
GC的特点
1. 分离效率高（填充柱上千块塔板；开管柱 106块塔板）
2. 分析速度快 3. 样品用量少（检测限低，高灵敏检测器） 4. 缺点：（约20%样品适用） A. 样品须能气化（350度下有一定的挥发性） B. 热稳定性要好 C. 定性困难
第二节 气相色谱术语、理论
1. 气相色谱流出曲线 2. 分配系数与容量因子 3. 塔板理论 4. 速率理论 5. 分离度 6. 基本分离方程
• 添加剂
荧光指示剂
硝酸银溶液
制板、活化
点样
1.溶剂对样品的溶解度适中； 2.溶剂沸点适中； 3.样品浓度适中； 4.原点位置应在展开剂液面上； 5.定性分析:内径0.5mm管口平整的毛细管
通用显色剂
定性分析
1. 与标准对照品在三种不同的展开剂中展开 (加熔点)；
2. 制备TLC，将待定性化合物分离后，刮下、 洗脱，再波谱分析；
3. TLC与其它技术联用
定量分析
1. 间接定量（洗脱测定法）； 2. 直接定量（薄层扫描法）
薄层扫描法：以一定波长的光照射展开后 的薄层色谱板上被分离组分的斑点，测定 斑点对光的吸收强度或所发出的荧光强度， 进行定量分析的方法。 薄层吸收扫描法 薄层荧光扫描法
色谱法的特点
（1）分离效率高 复杂混合物，有机同系物、异构体。手性异构体。
（2） 灵敏度高 可以检测出μg.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。
（3） 分析速度快 一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。
（4） 应用范围广 气相色谱：沸点低于400℃的各种有机或无机试样的分析。 液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。
GC的特点
1. 分离效率高（填充柱上千块塔板；开管柱 106块塔板）
2. 分析速度快 3. 样品用量少（检测限低，高灵敏检测器） 4. 缺点：（约20%样品适用） A. 样品须能气化（350度下有一定的挥发性） B. 热稳定性要好 C. 定性困难
第二节 气相色谱术语、理论
1. 气相色谱流出曲线 2. 分配系数与容量因子 3. 塔板理论 4. 速率理论 5. 分离度 6. 基本分离方程
• 添加剂
荧光指示剂
硝酸银溶液
制板、活化
点样
1.溶剂对样品的溶解度适中； 2.溶剂沸点适中； 3.样品浓度适中； 4.原点位置应在展开剂液面上； 5.定性分析:内径0.5mm管口平整的毛细管
第3章+高效液相色谱分析
不同待测离子与反离子形成离子对的能力不同， 分配系数存在差异，导致在固定相中滞留时间不同， 从而实现色谱分离。
离子对的容量因子k可表示为：
VS 1 k DX K XY [Y ]水相 VM
则组分的保留时间：
L 1 t R (1 K XY [Y ]水相 ） u
分析实例：
§3-4 液相色谱的流动相
当固定相选定时，流动 相的种类、配比能显著地影 响分离效果，因此流动相的 选择很重要。
1.选择流动相时应注意的几个问题
（1）尽量使用高纯度试剂作流动相（防止微量杂质长 期累积，损坏色谱柱和使检测器噪声增加) 。 （2）避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂。 （3）试样在流动相中应有适宜的溶解度。 （4）溶剂的黏度小些为好。 （5）流动相同时还应满足检测器的要求。比如当使用 紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。
子或反离子)，加到流动相中与溶质离子结合形成疏
水性离子对，从而控制溶质离子的保留行为。 阴离子分离：对离子常用烷基铵类，如氢氧化十 六烷基三甲铵。 阳离子分离：对离子常用烷基磺酸(己烷磺酸钠)。 反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C18 柱)， 含有对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样
离子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+X-。
固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)； 原理：按分子大小分离。小分子 可以扩散到凝胶空隙中通过，出 峰最慢；中等分子只能通过部分 凝胶空隙，中速通过；而大分子 被排斥在外，出峰最快；溶剂分 子小，故在最后出峰。 相对分子质量在100～105范围 内的化合物按质量分离。
空间排阻色谱固定相
（1）软质凝胶 葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构。 水为流动相。适用于常压排阻分离。 （2）半硬质凝胶 苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶。 非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性 溶剂 （3）硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等；如可控孔径玻璃微球，具有 恒定孔径和窄粒度分布。 化学稳定性，热稳定性好，机械强度大，流动相性质 影响小，可在较高流速下使用。
第三章 薄层色谱法
况中，薄层色谱过程中展开剂的流速是随空间、时间而变化的复杂函数。 二、塔板理论 高效薄层板上样品斑点内部的样品量分布是按高斯型分布的。可用式(3－4)来计算色 谱系统的理论塔板数。
R L L n = 16( s ) 2 − 16( f ) 2 Ws Ws
（3－4）
式中。N 为理论塔板数；Ls 为物质 s 在板上的移动距离；Ws 为 s 物质斑点直径；R f 为物 质 s 的比移值。该方程式表示了薄层板效率与迁移距离的关系。 Guiochon 等提出了计算薄层色谱板的有效理论塔板数的公式(3—5)。
neff
Ls = 16 W −W s 0
2
（3－5）
式中，W0 为样品原点的峰宽。 在薄层色谱中， 有人认为用有效理论塔板数来衡量板效率更合理。 因为薄层色谱与柱色 谱相比有其特点，在柱色谱中，通常色谱柱均有相当的长度，因而进样引起的色谱峰的扩张 不太严重， 而薄层色谱样品移动的距离很短， 点样引起的峰扩张(即原斑点直径)则不能忽略， 所以展开后斑点扩张的程度应减去原斑点的宽度， 其差值与斑点移动的距离成正比。 有效板 高(H)的计算公式如下：
的前提下分离才有可能，提高 α，选择合适的流动相为主要手段。 (3)容量项 c R f2 越大，容量项越小，分离度越小，R f2 越小，分离度越大。最佳分离条 件为 R f 在 0.3~0.5 之间；可用范围为 0.2~0.9。调整展开剂极性，可以使被分离组分的 R f 值 落入所需区间。 (二) 分离值 (Separation V alue)
(3－8)
式中， K 为分配系数；V s 为色谱系统中固定相所占的体积；V m 为色谱系统中流动相所 占的体积。
k=
1 −1 Rf
（3－9）
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13
速率理论H─ｕ图
传质阻力增加
C’u (C’>C) H B/u b=B/uopt c’=Cuopt A+Cu
A+B/u+Cu
Hmin
b
c’
Cu
A
涡流扩散取决于 柱子 分子纵向扩散 增加
a
0
u’opt uopt
u
14
最佳流速
H A B / u Cu
dH B 2 C 0 du u
Dm B
18
tR L/u LH t u n L/H
L t u LH
4
LH
2
影响分子向前行走的独立因素
• 1. 涡流扩散。 • 2. 分子纵向扩散。 • 3. 流动相传质阻力——滞留流动相和迁移流动相。 • 4. 固定相传质阻力——固定相内扩散阻力、吸附热 对两相平衡的影响。
3
• 在色谱过程中各个分子的无规运动，无论何种情 况都可以展开成许多独立的、具有不同步长和步 数的无规运动之和。 • 按照误差传递理论： • 总的离散度(方差、标准偏差)=各种独立无规运动 离散度(方差、标准偏差)之和
i
2 2 1 2 2 2 n
2
LH
2
2gDm H 2ld P L u
2
8 k ' dS k' dP u 2 u 2 (k '1) DS k '1 Dm
2 2
2
A B / u CM u CS u A B / u Cu
11
柱分离过程影响柱效(塔板高度)的因素
的纵向扩散和在固定相中的纵向扩散。但 是以上的讨论仅含分子集合在流动相中的 纵向扩散。这在流动相为气体的场合是合 适的，但在流动相是液体的场合并不完全
，因为在气相，分子扩散系数比在液相或
固定相中的扩散系数大十万倍。
7
流动相中的传质阻力
• 流动相传质阻力对色谱峰宽的贡献由两部分组成 ①迁移流动相传质 ②滞留流动相传质
1
速率理论的两个理论根据
• 1. 爱恩斯坦一维扩散公式 • 2. 数据集合的离散
2
速率理论: 随机行走模型的基本假设
• ①溶质(组分)在通过色谱柱时, 单个分子的运动是 随机的、无规则的, 但总体分子平均运动是沿着柱 长的方向迁移. • ②溶质(组分)分子在通过色谱柱时,要经过多次分配 平衡. 当它们在流动相中时,以流动相的速度向前移 动,若它们在固定相中, 则向前移动的速度为零. • ③溶质分子在色谱柱中经历任两次分配平衡期间, 向前移动的距离相等.这个距离称为"随机行走步长", 用 ｈ 表示. 在柱中完成的随机行走的次数称为" 行 走步数"或"级数", 以n 表示.
2
9
速率理论方程
i
2 2
• 色谱峰宽的方差由上几部分组成: 涡流扩散、纵向
分子扩散、流动相中的传质阻力和固定相中的传质 阻力. 不同特征的固定相, 其传质阻力的表达式也 不相同. 若考虑的是吸附色谱,
2 2 A 2 B
2 Cm
2 Cs
10
速率理论方程
H A B / u Cu ⑴ 流速ｕ的影响 （H-u 曲线）
⑵ 涡流扩散的影响
A=2λdP
⑶ 分子纵向扩散的影响
B =2gDm
2
k' ⑷ 流动相传质的影响 Cm k '1 ⑸ 固定相传质的影响 Cs 82 k ' 2 k '1
dP Dm
2
dS DS
5
涡流扩散
¤规整填料
1
¤不规则填料
2
• 分配平衡在颗粒表面进行,分子沿颗粒切线方相
• 分配平衡与填料床层的间隙大小以及均匀度有关,
引入填充均匀度因子λ.
移动,颗粒越大步长越长, l ∝ d
P;
;
•
A＝2ldP
A2＝2ldPL
6
分子纵向扩散
令B＝2γDm 为分子扩散项系数
B2＝2gDmL/u
分子纵向扩散包含两个部分：在流动相中
2
12
提高柱效的途径
2gDm H 2ld P L u
2
8 k' dS k' dP u 2 u 2 (k '1) DS k '1 Dm
2 2
2
• ①选用细颗粒的填料可以获得高柱效; • ②流动相低线速, 有利于达到高柱效; • ③流动相粘度低, 溶质在流动相中的扩散系数大(传质快), 可 提高柱效; • ④采用低配比固定液,有利于减小固定相传质阻力,提高柱效; • ⑤提高温度可减小流动相和固定相的粘度, 从而增大组分的扩 散系数, 改善传质, 有利于提高柱效. • ⑥组分的扩散系数还取决于组分本身的结构, 过大的分子扩散 系数小对获得高的柱效不利.
• •
•
不同流动相对H-u曲线形状的影响
• 不同载气的气相色谱 Van Deemter H-u 曲线 H • 填料粒度对Van Deemter H-u 曲线的影响 H
N2 填料粒度
He
H2
0
u
0
u
1 ml/min
17
影响柱效的各个因素
• 填料: 颗粒度dP 均匀性
柱效( n
l g
2 2 A 2 B 2 Cm
22 Cs源自2 22gDm L 8 k ' dS k' dP 2 2lLd P Lu 2 Lu 2 u (k '1) DS k '1 Dm AL BL / u CM Lu CS Lu AL BL / u CLu
uopt ( B / C ) H m in A 2 ( BC)
15
H─ｕ图的特征
•
反映了色谱体系的分离特征.
• 反映了色谱体系的分离特征. ① u对HB和HC 的影响正好相反. 体现在H─u 图上有一最低 点. 这个最低点兼顾了分子扩散和两相传质阻力的抗衡, 使两 者之和最小. 在这点上的H 称为最小塔板高度Hmin, u 称为最 佳线速度uopt. ② 在uopt. 附近, 曲线比较平坦, 即u对H 的影响不大. 提示 提高线速度可以节省分析时间. ③ 在低流速区操作 (线速比uopt. 小得比较多时), 分子扩散的 影响占主导. 为了减小2γDm/u 的值, 必须减小Dm . 应使用分子 量较小的物质作流动相. ④ 在高流速区操作(线速比uopt. 大得比较多时), 传质阻力对 H贡献占主要部分. 为减小传质阻力, 宜采用细颗粒固定相, 分 子量小的物质作流动相, 选用具有较大的DS 的固定相, 且固定 16 相用液量要小些.
平衡塔板理论的缺陷
不能指出和解释影响理论塔板数的因素，不能提示提 高柱效的方向。 • 热力学因素： 精馏的分离基础是纯组分蒸汽压的差别.色谱除了蒸 汽压的因素外还有组分与固定相之间的作用力（溶解 度、吸附力等），忽略了两相体积的大小 色谱过程实质是非平衡过程。 • 动力学因素： 忽略流动相的流动速度, 忽略了两相体积的大小, 这就忽视了组分分子在两相中扩散的传质的动力学过 程,过程需要时间以及色谱动力学过程的四个因素。
k' dP Cm k '1 Dm
2
2
2 P C D Lu k '1 m
m
k' d
2
2
8
固定相中的传质阻力
流动相
刚达分配平衡
固定相
流动相 固定相
2
分配平衡后的瞬间
k' dS CS 2 k '12 DS 8
2 C
s
k' dS 2 Lu 2 k '1 DS 8
流动相:密度(压力) D B
流速 uopt=(B/C)1/2 柱效
H ) 柱效 H 柱效 H
• 固定相:配比(固定相用量)(扩散膜厚) 柱效 H
温度 • •
柱效 H k’ (K CS )(一般 VR ) 柱效 H u D (Cm + CS) 柱效 H
速率理论H─ｕ图
传质阻力增加
C’u (C’>C) H B/u b=B/uopt c’=Cuopt A+Cu
A+B/u+Cu
Hmin
b
c’
Cu
A
涡流扩散取决于 柱子 分子纵向扩散 增加
a
0
u’opt uopt
u
14
最佳流速
H A B / u Cu
dH B 2 C 0 du u
Dm B
18
tR L/u LH t u n L/H
L t u LH
4
LH
2
影响分子向前行走的独立因素
• 1. 涡流扩散。 • 2. 分子纵向扩散。 • 3. 流动相传质阻力——滞留流动相和迁移流动相。 • 4. 固定相传质阻力——固定相内扩散阻力、吸附热 对两相平衡的影响。
3
• 在色谱过程中各个分子的无规运动，无论何种情 况都可以展开成许多独立的、具有不同步长和步 数的无规运动之和。 • 按照误差传递理论： • 总的离散度(方差、标准偏差)=各种独立无规运动 离散度(方差、标准偏差)之和
i
2 2 1 2 2 2 n
2
LH
2
2gDm H 2ld P L u
2
8 k ' dS k' dP u 2 u 2 (k '1) DS k '1 Dm
2 2
2
A B / u CM u CS u A B / u Cu
11
柱分离过程影响柱效(塔板高度)的因素
的纵向扩散和在固定相中的纵向扩散。但 是以上的讨论仅含分子集合在流动相中的 纵向扩散。这在流动相为气体的场合是合 适的，但在流动相是液体的场合并不完全
，因为在气相，分子扩散系数比在液相或
固定相中的扩散系数大十万倍。
7
流动相中的传质阻力
• 流动相传质阻力对色谱峰宽的贡献由两部分组成 ①迁移流动相传质 ②滞留流动相传质
1
速率理论的两个理论根据
• 1. 爱恩斯坦一维扩散公式 • 2. 数据集合的离散
2
速率理论: 随机行走模型的基本假设
• ①溶质(组分)在通过色谱柱时, 单个分子的运动是 随机的、无规则的, 但总体分子平均运动是沿着柱 长的方向迁移. • ②溶质(组分)分子在通过色谱柱时,要经过多次分配 平衡. 当它们在流动相中时,以流动相的速度向前移 动,若它们在固定相中, 则向前移动的速度为零. • ③溶质分子在色谱柱中经历任两次分配平衡期间, 向前移动的距离相等.这个距离称为"随机行走步长", 用 ｈ 表示. 在柱中完成的随机行走的次数称为" 行 走步数"或"级数", 以n 表示.
2
9
速率理论方程
i
2 2
• 色谱峰宽的方差由上几部分组成: 涡流扩散、纵向
分子扩散、流动相中的传质阻力和固定相中的传质 阻力. 不同特征的固定相, 其传质阻力的表达式也 不相同. 若考虑的是吸附色谱,
2 2 A 2 B
2 Cm
2 Cs
10
速率理论方程
H A B / u Cu ⑴ 流速ｕ的影响 （H-u 曲线）
⑵ 涡流扩散的影响
A=2λdP
⑶ 分子纵向扩散的影响
B =2gDm
2
k' ⑷ 流动相传质的影响 Cm k '1 ⑸ 固定相传质的影响 Cs 82 k ' 2 k '1
dP Dm
2
dS DS
5
涡流扩散
¤规整填料
1
¤不规则填料
2
• 分配平衡在颗粒表面进行,分子沿颗粒切线方相
• 分配平衡与填料床层的间隙大小以及均匀度有关,
引入填充均匀度因子λ.
移动,颗粒越大步长越长, l ∝ d
P;
;
•
A＝2ldP
A2＝2ldPL
6
分子纵向扩散
令B＝2γDm 为分子扩散项系数
B2＝2gDmL/u
分子纵向扩散包含两个部分：在流动相中
2
12
提高柱效的途径
2gDm H 2ld P L u
2
8 k' dS k' dP u 2 u 2 (k '1) DS k '1 Dm
2 2
2
• ①选用细颗粒的填料可以获得高柱效; • ②流动相低线速, 有利于达到高柱效; • ③流动相粘度低, 溶质在流动相中的扩散系数大(传质快), 可 提高柱效; • ④采用低配比固定液,有利于减小固定相传质阻力,提高柱效; • ⑤提高温度可减小流动相和固定相的粘度, 从而增大组分的扩 散系数, 改善传质, 有利于提高柱效. • ⑥组分的扩散系数还取决于组分本身的结构, 过大的分子扩散 系数小对获得高的柱效不利.
• •
•
不同流动相对H-u曲线形状的影响
• 不同载气的气相色谱 Van Deemter H-u 曲线 H • 填料粒度对Van Deemter H-u 曲线的影响 H
N2 填料粒度
He
H2
0
u
0
u
1 ml/min
17
影响柱效的各个因素
• 填料: 颗粒度dP 均匀性
柱效( n
l g
2 2 A 2 B 2 Cm
22 Cs源自2 22gDm L 8 k ' dS k' dP 2 2lLd P Lu 2 Lu 2 u (k '1) DS k '1 Dm AL BL / u CM Lu CS Lu AL BL / u CLu
uopt ( B / C ) H m in A 2 ( BC)
15
H─ｕ图的特征
•
反映了色谱体系的分离特征.
• 反映了色谱体系的分离特征. ① u对HB和HC 的影响正好相反. 体现在H─u 图上有一最低 点. 这个最低点兼顾了分子扩散和两相传质阻力的抗衡, 使两 者之和最小. 在这点上的H 称为最小塔板高度Hmin, u 称为最 佳线速度uopt. ② 在uopt. 附近, 曲线比较平坦, 即u对H 的影响不大. 提示 提高线速度可以节省分析时间. ③ 在低流速区操作 (线速比uopt. 小得比较多时), 分子扩散的 影响占主导. 为了减小2γDm/u 的值, 必须减小Dm . 应使用分子 量较小的物质作流动相. ④ 在高流速区操作(线速比uopt. 大得比较多时), 传质阻力对 H贡献占主要部分. 为减小传质阻力, 宜采用细颗粒固定相, 分 子量小的物质作流动相, 选用具有较大的DS 的固定相, 且固定 16 相用液量要小些.
平衡塔板理论的缺陷
不能指出和解释影响理论塔板数的因素，不能提示提 高柱效的方向。 • 热力学因素： 精馏的分离基础是纯组分蒸汽压的差别.色谱除了蒸 汽压的因素外还有组分与固定相之间的作用力（溶解 度、吸附力等），忽略了两相体积的大小 色谱过程实质是非平衡过程。 • 动力学因素： 忽略流动相的流动速度, 忽略了两相体积的大小, 这就忽视了组分分子在两相中扩散的传质的动力学过 程,过程需要时间以及色谱动力学过程的四个因素。
k' dP Cm k '1 Dm
2
2
2 P C D Lu k '1 m
m
k' d
2
2
8
固定相中的传质阻力
流动相
刚达分配平衡
固定相
流动相 固定相
2
分配平衡后的瞬间
k' dS CS 2 k '12 DS 8
2 C
s
k' dS 2 Lu 2 k '1 DS 8
流动相:密度(压力) D B
流速 uopt=(B/C)1/2 柱效
H ) 柱效 H 柱效 H
• 固定相:配比(固定相用量)(扩散膜厚) 柱效 H
温度 • •
柱效 H k’ (K CS )(一般 VR ) 柱效 H u D (Cm + CS) 柱效 H