质谱测序 第三代测序
三代测序原理
三代测序原理
三代测序原理是指第三代测序技术，又称为单分子测序技术。
与第一代（Sanger测序）和第二代（高通量测序）相比，第三代测序技术具有更高的速度、更低的成本和更长的测序读长等优点。
第三代测序技术的原理主要是基于测序模板的直接测序，而不需要PCR扩增。
这种直接测序的方法可以避免PCR扩增引入
的错误，并且能够在一个测序周期内得到完整的序列信息。
在第三代测序技术中，常用的方法是通过将DNA分子固定在
一个载体上，形成DNA聚集体。
然后，通过负电荷的方式将
这些DNA聚集体附着在固定的表面上，形成一个DNA分子
阵列。
接着，通过使用荧光染料将这些固定的DNA分子标记出来，
并且使用激光束在一个固定的区域内进行扫描。
这样，就可以得到每个DNA分子的位置和荧光信号强度信息。
在测序过程中，通常会使用一种特殊的酶来控制DNA链的合
成过程。
这种酶能够识别每个碱基的序列信息，并且在特定的条件下将其添加到适当的位置。
通过不断重复这个步骤，直到测序反应完成，就可以得到整个DNA分子的序列信息。
总结起来，第三代测序技术的原理是通过直接测序DNA模板，
不需要PCR扩增，通过固定DNA分子并使用荧光标记，通过酶的作用在特定条件下完成碱基的添加，最终得到完整的
DNA序列信息。
这种技术具有快速、低成本和长读长等优势，在各种生物学研究中得到了广泛的应用。
第三代测序技术单分子即时测序
第三代测序技术:单分子即时测序・７１８・第三代测序技术：单分子即时测序刘岩吴秉铨ＤＮＡ测序技术是分子生物学研究中最常用的技术，它的出现极大地推动了生物学的发展。
从人类基因组计划（ｈｕｍａｎｇｅｎｏｍｅｐｒｏｊｅｃｔ），到人类基因组单倍型图计划（ＨａｐＭａｐ），再到人类癌症基因组及个体基因组计划，第一代和第二代ＤＮＡ测序技术功不可没。
特别是近几年发展起来的第二代ＤＮＡ测序技术则使得ＤＮＡ测序进入了高通量、低成本的时代。
目前，基于单分子读取技术的第三代测序技术已经出现，该技术测定ＤＮＡ序列更快，并有望进一步降低测序成本，为人类从基因水平深入理解疾病的发生、发展、诊断和治疗提供新的手段，使个体化医疗成为现实。
本文回顾了测序技术发展过程，并对第三代测序技术的特点和优势进行详细论述。
一、第一代ＤＮＡ测序（ｆｉｒｓｔ—ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）成熟的ＤＮＡ测序技术始于２０世纪７０年代中期，１９７７年Ｍａｘａｍ和Ｇｉｌｂｅｒｔ…报道了通过化学降解测定ＤＮＡ序列的方法。
同一时期，Ｓａｎｇｅｒ等拉１发明了双脱氧链终止法，基本原理是利用４种双脱氧核苷酸（ｄｄＮＴＰ）代替脱氧核苷酸（ｄＮＴＰ）作为底物进行ＤＮＡ合成反应。
一旦ｄｄＮＴＰ掺入到ＤＮＡ链中，由于核糖的第３位碳原子上不含羟基，不能与下一核苷酸反应形成磷酸二酯键，ＤＮＡ合成链的延伸反应被终止，生成了若干长度仅相差单个碱基的ＤＮＡ片段。
在４个ＤＮＡ合成反应体系中，分别加入一定比例的带有放射性同位素标记的某种ｄｄＮＴＰ，通过单碱基分辨率的凝胶电泳分离不同长度的ＤＮＡ片段和放射自显影后，可以根据电泳带的位置确定待测ＤＮＡ分子的序列。
２０世纪９０年代初出现的荧光自动测序技术也是基于Ｓａｎｇｅｒ等¨１原理。
但用荧光标记代替同位素标记，并用成像系统自动检测，从而大大提高了ＤＮＡ测序的速度和准确性，将ＤＮＡ测序带入自动化测序的时代，这些技术统称为第一代ＤＮＡ测序技术。
第三代DNA测序技术的原理及应用
第三代DNA测序技术是近年来生物学领域的一项重大突破，它的原理和应用在基因研究和生物科学中具有重要意义。
本文将深入探讨第三代DNA测序技术的原理，并分析其在不同领域的应用。
1. 引言DNA测序技术是生物学研究中最基础、最重要的工具之一。
传统的第一代和第二代DNA测序技术虽然有着高效和准确的特点，但在测序速度、数据质量和测序长度方面存在一定的局限性。
而第三代DNA测序技术的出现，为我们提供了更高的测序速度、更长的测序读长和更低的测序成本。
2. 原理第三代DNA测序技术的原理与传统技术有所不同。
它不再依赖于离散的信号和化学反应，而是通过直接读取单个DNA分子中的碱基序列来实现测序。
下面将介绍几种常见的第三代DNA测序技术原理及其特点。
2.1 单分子实时测序技术单分子实时测序技术是第三代DNA测序技术中的一种重要方法。
它利用了DNA链的线性自我扩增特性，通过监测单个DNA分子的合成过程来实现测序。
这种方法具有实时性好、测序速度快、数据产量高的优点，适用于高通量测序和长读长要求的研究。
2.2 纳米孔测序技术纳米孔测序技术是一种基于离子传导原理的第三代DNA测序方法。
它使得DNA分子能够通过纳米孔的通道，并且依据碱基的化学特性在电流传导上产生差异，从而实现测序。
这种方法具有高速度、低成本和无需扩增的特点，适用于快速测序和实时监测。
2.3 光学测序技术光学测序技术是第三代DNA测序技术中的又一种重要方法。
它利用了荧光染料的性质和光信号的检测来实现测序。
通过将DNA分子与特定的荧光染料标记，然后在测序仪器中激发并检测荧光信号，从而获取对应的碱基信息。
这种方法具有高灵敏度和高分辨率的特点，适用于复杂样品和高标准的测序要求。
3. 应用第三代DNA测序技术在生物学研究和医学领域的应用十分广泛，下面将介绍几个典型的应用案例。
3.1 基因组测序第三代DNA测序技术在基因组测序中具有重要意义。
其高通量、长读长和低成本的特点使得科学家们能够更快地完成全基因组的测序工作，并且能够检测到一些传统方法难以观察到的基因变异。
三代测序原理及步骤
三代测序原理及步骤
三代测序是一种新型的高通量测序技术，与传统的二代测序技术相比，具有更快的速度、更高的分辨率和更低的成本。
三代测序的原理主要分为三个步骤：预处理、测序和数据分析。
1. 预处理：样本DNA需要进行预处理，包括DNA提取、文
库构建和引物连接等。
其中文库构建过程中，DNA分子被打
断成较小的片段，并与适当的引物序列连接。
这个过程是为了克服DNA分子长度和连续读取长读长的难题。
2. 测序：三代测序主要依赖于单分子测序技术。
这种技术可以直接读取单个DNA分子的序列信息，避免了文库扩增和PCR
等步骤对序列的干扰。
常用的三代测序技术包括SMRT （Single Molecule Real-Time）测序、Nanopore测序等。
其中，SMRT测序技术利用圆盘形态的DNA多聚酶在放射线观测下
合成DNA，观察到DNA的添加情况，从而得到DNA的序列
信息；Nanopore测序技术则利用微小的纳米孔通过测量DNA
分子通过孔的电导变化来分析DNA序列。
3. 数据分析：三代测序产生的数据量大、复杂，需要进行数据预处理、序列比对、变异检测、基因组组装等一系列的数据分析步骤。
这些步骤主要包括数据清洗、基因组或转录组的组装、SNP分析、结构变异分析等。
总体来说，三代测序的步骤包括预处理、测序和数据分析。
通
过这些步骤，可以高效地获得高质量的基因组或转录组序列，并进一步分析相关的生物学功能和基因表达调控等信息。
三代测序原理技术比较
三代测序原理技术比较三代测序是指第三代DNA测序技术，相对于第一代和第二代DNA测序技术，它具有更高的测序速度、更低的成本和更高的基因组分辨率。
三代测序技术在遗传学、生物学和医学研究等领域中起着重要的作用。
本文将对三代测序原理和技术进行详细比较。
第一代测序技术，又称为经典测序技术，是20世纪70年代末到80年代初出现的。
代表性的方法包括Sanger测序和Maxam-Gilbert测序。
这些方法都是基于DNA链延伸原理进行测序，通常需要大量的模板DNA和特定的剪切酶。
优点是准确性高，读长长，可达到1000到2000个碱基。
缺点是测序速度慢，成本高，并且需要大量的模板DNA。
第二代测序技术，也称为高通量测序技术，是在21世纪初出现的。
代表性的方法包括454测序、Illumina测序和SOLiD测序。
这些方法都是基于DNA扩增和测序的原理进行测序，通常需要少量的模板DNA。
优点是测序速度快，成本低，并且可以实现高通量测序。
缺点是读长短，通常只能达到几百个碱基，而且对于GC含量高的区域有较大的偏倚。
第三代测序技术，又称为单分子测序技术，是在2005年之后出现的。
代表性的方法包括Pacific Biosciences (PacBio)测序、Oxford Nanopore Technologies (ONT)测序和Helicos测序。
这些方法都是基于单分子测序的原理进行测序，通常只需要少量的模板DNA。
优点是读长极长，可以达到数万个甚至数十万个碱基，对于复杂基因组和长读长测序有很大的优势。
此外，这些方法不需要扩增和特定的剪切酶，因此可以避免偏倚。
缺点是准确性相对较低，错误率较高。
在三代测序技术中，PacBio测序和ONT测序是目前较为成熟和广泛应用的两种方法。
PacBio测序原理是利用DNA聚合酶在测序过程中释放出的荧光信号进行测序。
当DNA聚合酶在DNA模板上合成新的DNA链时，会引起荧光信号的变化，从而实现碱基的识别和测序。
第三代测序技术原理及应用
Pacific Bioscience SMRT 技术
• 优势：长读长，耗时短。可以进行DNA甲基化，高GC含量区域、 RNA等测序。
• 缺陷：会出现插入和缺失错误。 缺失错误源于有时候碱基掺入速度过快， 超过了相机的拍摄帧数; 插
入错误源于有时候酶随机的选择一些碱基，但并未真的将这些碱基掺入 合成链中。但这些错误是随机的，并不会随着读长的增加而提高， 随着 测序覆盖深度的增加会逐渐被消除。
Oxford Nanopore Technologies 纳米孔单分子测序技术
• 优势：仪器构造简单使用成本低廉，因为它不需要对核苷酸进行标记， 也不需要复杂的光学探测系统 。能直接对 RNA 分子进行测序。同时 由于它是直接检测每一个碱基的特征性电流， 因而能对修饰过的碱基 进行测序， 这一点对于表观遗传学研究具有极高的价值。
Pacific Bioscience SMRT 技术
第一代、二代、三代测序仪比较
Rhoads A, Au KF. PacBio Sequencing and Its Applications. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 2015;13(5):278-289. doi:10.1016/j.gpb.2015.08.002.
• 缺点：测序的平均读长相对较短， 只有 35 bp， 准确率较低， 约为 ≤97% 。
Oxford Nanopore Technologies 纳米孔单分子测序技术
α-溶血素纳米孔 外：核酸外切酶 内：环糊精传感器
核酸外切酶 消化单链DNA
单碱基与环糊 精作用影响电 流
依据电信号大小和 停留时间识别碱基
测序准确度较高，测序碱基错误率 为1%
简述第一二三代测序技术原理
简述第一二三代测序技术原理
第一代测序技术原理：
第一代测序技术又称为Sanger测序技术，是由Frederick Sanger在1977年首次提出并开发的。
这种方法依靠DNA链
延伸的DNA聚合酶做模板并进行荧光标记，使用一种称为链终止的化学方法，会使DNA链延伸终止在特定核苷酸，生成所有长度的DNA片段，然后使用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离各个片段。
随后，通过电泳图谱能够分辨出不同长度的DNA片段，从而得到DNA序列。
第二代测序技术原理：
第二代测序技术是基于测序-by-synthesis原理，是通过将DNA 组装到表面上，并添加能够照亮每个核苷酸的化学试剂进行测序。
这些试剂可以逐个核苷酸累加，并用相应的光信号发送给计算机进行分析。
第二代测序技术包括Illumina, 454, Ion Torrent，和SOLiD。
Illumina使用激光照亮DNA序列中的核苷酸，并记录生成的荧光信号。
此技术具有高通量、低成本和快速的优点。
第三代测序技术原理：
第三代测序技术是一种实时单分子测序技术，采用单个自然DNA分子，并通过流速调节使DNA通过膜孔，然后测定膜孔中的电学性质来识别核苷酸（如Ion Torrent，Oxford Nanopore）。
这些技术还包括基于纳米技术和单分子DNA氧
化的PacBio技术。
这些技术具有不同的优点，包括高精确度、高通量和更真实的序列。
三代测序原理技术比较
三代测序原理技术比较三代测序是指第三代高通量测序技术，相对于第一代和第二代测序技术，它具有更高的速度、更低的成本以及更高的准确性。
目前，主要的三代测序技术包括单分子测序、单分子实时测序和纳米孔测序。
下面将分别介绍这三种技术的原理和特点。
单分子测序是三代测序技术的一种，它的原理是将DNA分子直接放在一个测序装置中，通过对DNA的碱基进行逐个测序以获得DNA序列。
单分子测序技术的一大特点是能够直接对DNA进行测序，不需要进行PCR扩增和片段化等传统测序方法中的预处理步骤，因此可以减少实验时间和所需样本量。
目前，常见的单分子测序技术有SMRT（Single-Molecule Real-Time）和Nanopore（纳米孔）测序。
SMRT技术是一种可以实现单分子实时测序的技术，它利用专门设计的测序装置以及特殊的引物和酶来进行测序。
测序装置中有一个高密度排列的微小孔，每个孔中有一个DNA聚合酶复合物和一个荧光基团，当DNA碱基与引物配对时，聚合酶会添加一个荧光基团，同时释放出荧光信号，这个过程可以被装置中的摄像机捕捉到。
通过观察荧光信号的强度和持续时间，就可以推断一些位置的DNA碱基是什么。
SMRT技术的优点是测序速度快、准确性高，但缺点是数据处理复杂，读长相对较短。
纳米孔测序是一种利用纳米孔测序装置对DNA分子进行测序的技术。
纳米孔是一种非常细微的孔道，通常直径在1-2纳米之间，只能通过单个DNA分子的一条链。
当DNA分子通过纳米孔时，其碱基会对应产生电信号，通过测量电信号的特性，可以推断DNA序列。
与其他测序技术相比，纳米孔测序的优势主要在于测序速度快、设备小巧、易于存储和传输，并且具有较长的读长和较低的测序成本。
然而，纳米孔测序技术也存在一定的误读和错配率等问题需要改进。
综上所述，三代测序技术相对于传统的测序技术具有更高的速度、更低的成本和更高的准确性。
单分子测序、单分子实时测序和纳米孔测序是目前主要的三代测序技术，它们各具特点，适用于不同的测序需求。
三代测序技术原理
三代测序技术原理三代测序技术是指第三代测序技术，也称为单分子测序技术。
它是指通过对单个 DNA 或 RNA 分子进行直接测序，不需要 PCR 扩增或克隆，从而可以更快速、更准确地获取基因组或转录组的信息。
三代测序技术的原理主要包括 DNA 或 RNA 分子的捕获、测序和数据分析三个方面。
首先，DNA 或 RNA 分子的捕获是三代测序技术的第一步。
在这一步中，需要将待测序的 DNA 或 RNA 分子捕获到测序平台上。
常用的捕获方法包括固相捕获、流式细胞捕获等。
通过这些方法，可以将单个 DNA 或 RNA 分子固定在测序平台上，为后续的测序做准备。
其次，测序是三代测序技术的核心步骤。
在这一步中，需要对捕获的 DNA 或 RNA 分子进行测序，获取其碱基序列信息。
三代测序技术采用的测序方法有多种，包括光学测序、纳米孔测序等。
这些方法可以实现对单个 DNA 或 RNA 分子的高通量测序，从而获得更加准确和完整的基因组或转录组信息。
最后，数据分析是三代测序技术的最后一步。
在这一步中，需要对测得的序列数据进行处理和分析，以获取最终的基因组或转录组信息。
数据分析包括测序数据的质控、序列拼接、基因组组装、基因表达分析等多个方面。
通过这些分析，可以得到关于基因组结构、基因表达水平等重要信息，为后续的生物信息学研究和应用奠定基础。
总的来说，三代测序技术的原理包括 DNA 或 RNA 分子的捕获、测序和数据分析三个方面。
通过这些步骤，可以更快速、更准确地获取基因组或转录组的信息，为生命科学研究和临床诊断提供重要支持。
三代测序技术的不断发展和应用将为生命科学领域带来更多的突破和进展。
第三代测序技术(单分子实时DNA测序)与第二代测序技术(高通量测序技术)简介
第三代测序技术（单分子实时DNA测序）与第二代测序技术（高通量测序技术）简介第三代测序技术(单分子实时DNA测序)与第二代测序技术(高通量测序技术)简介第三代测序技术简介如果有人告诉你用显微镜实时观测单分子DNA聚合酶复制DNA，并用它来测序，你一定会认为他异想天开，没有一点生物的sense。
我最初就是这样认为的，然而它不仅可以实现，而且已经实现了～这个就是被称为第三代的测序技术，Pacific Biosciences公司推出的“Single Molecule Real Time(SMRT) DNA Sequencing”(单分子实时DNA测序)。
我有幸在NIH听到了这个技术发明人Stephen Turner博士的讲座，根据自己粗浅的理解记录整理一下。
要实现单分子实时测序，有三个关键的技术。
第一个是荧光标记的脱氧核苷酸。
显微镜现在再厉害，也不可能真的实时看到“单分子”。
但是它可以实时记录荧光的强度变化。
当荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA链的时候，它的荧光就同时能在DNA链上探测到。
当它与DNA链形成化学键的时候，它的荧光基团就被DNA聚合酶切除，荧光消失。
这种荧光标记的脱氧核苷酸不会影响DNA聚合酶的活性，并且在荧光被切除之后，合成的DNA链和天然的DNA链完全一样。
第二个是纳米微孔。
因为在显微镜实时记录DNA链上的荧光的时候，DNA链周围的众多的荧光标记的脱氧核苷酸形成了非常强大的荧光背景。
这种强大的荧光背景使单分子的荧光探测成为不可能。
Pacific Biosciences公司发明了一种直径只有几十纳米的纳米孔[zero-mode waveguides (ZMWs)]，单分子的DNA聚合酶被固定在这个孔内。
在这么小的孔内，DNA链周围的荧光标记的脱氧核苷酸有限，而且由于A，T，C，G这四种荧光标记的脱氧核苷酸非常快速地从外面进入到孔内又出去，它们形成了非常稳定的背景荧光信号。
而当某一种荧光标记的脱氧核苷酸被掺入到DNA链时，这种特定颜色的荧光会持续一小段时间，直到新的化学键形成，荧光基团被DNA聚合酶切除为止(见图)。
三代测序的原理
三代测序的原理三代测序是一种新型的高通量测序技术，它可以在较短时间内获得大量的 DNA 测序数据，为基因组研究、单细胞基因组学等领域提供了更为高效的方法和手段。
三代测序技术相比于传统的二代测序技术，在测序长度、测序速度等方面都具有明显的优势，因此备受关注。
那么，什么是三代测序？它的原理是什么？三代测序技术包括单分子测序技术、纳米孔测序技术等，这些技术都是基于不同的原理而发展的。
下面我们就一些常见的三代测序技术原理进行详细介绍。
一、单分子测序技术单分子测序技术，顾名思义，就是在一个分子的层面上进行 DNA 测序，这种技术可以突破传统二代测序技术中 DNA 放大和分离纯化等阶段的限制，避免了因 PCR 反应带来的测序误差，并可以直接测序双链 DNA 分子。
单分子测序技术主要有实时荧光测序技术和化学测序技术两种。
1. 实时荧光测序技术实时荧光测序技术是通过 DNA 上特异序列受体，与荧光信号的转导机制相结合来实现的测序技术。
这种技术可以检测位于 DNA 测序反应过程中的碱基，并通过光学探测来连续监测测序结果。
实时荧光测序技术的基本原理是在每一轮的 DNA 合成中加入荧光标记基团，然后通过不断检测从而读出 DNA 序列信息。
2. 化学测序技术化学测序技术是将 DNA 去除荧光标记基团后，采用荧光探针进行信号监测，从而得出碱基序列信息的一种测序技术。
先在反应过程中加入一个被称为“保护基覆盖”的基团，然后进行荧光信号检测，得出结果后再将前面添加的保护基覆盖去掉，继续进行下一轮检测，直到完成整个 DNA 序列的测定。
单分子测序技术擅长于检测低复杂度序列（如 GC/AT 重复序列）、基因组结构变异等重要问题，可以应用在很多领域，如生物医学、生物环境以及生物信息学等领域。
二、纳米孔测序技术纳米孔测序技术是利用纳米孔对单个 DNA 分子进行测序的技术，它是一种界面控制技术，主要包括固体纳米孔、液态纳米孔和气态纳米孔等。
简述一、二、三代测序技术
简述一、二、三代测序技术
一代测序
一代测序技术是首次开发的测序技术，也叫Sanger测序，它实际上是一种“拼接”技术，利用特定的DNA复制酶（DNA聚合酶）在双链DNA基础上进行延展反应，从而实现DNA测序的目的，其优势在于格式简单，容易操作，准确度高，但是比较耗时。
二代测序
二代测序技术，又叫“高通量测序”或“质谱测序”，最基本的原理是使用新的双链DNA片段作为模板，利用测序读码亚单位，不断改变测序片段的序列，从而快速完成测序工作，其优势在于测序效率高，但准确度要比一代测序低。
三代测序
三代测序技术，又称“短序列测序”，是一种测序技术，其最基本的原理是使用单个DNA片段作为模板，构建测序片段，并记录每一个片段的碱基序列，从而实现测序的目的，其优势在于测序速度快，准确度高，但也比较昂贵。
第三代测序技术介绍
第三代测序技术介绍目前，主要的第三代测序技术包括单分子测序技术和纳米孔测序技术。
单分子测序技术是指将DNA样本直接读取成单个分子的测序技术。
这种技术的一个典型代表是PacBio Single Molecule Real-Time（SMRT）测序技术。
这种技术基于真核生物DNA聚合酶的特点，通过监测单个DNA分子的合成过程来实现测序。
在PacBio SMRT测序技术中，DNA分子被固定在悬浮在荧光物质中的微小光子学平台上，随着DNA合成的进行，DNA聚合酶会释放出光子，从而可以实时监测到DNA的合成过程。
这种技术能够实现长读取长度和高保真度，具有快速、高效、高通量的特点，被广泛应用于基因组学、转录组学等研究领域。
纳米孔测序技术是指通过将DNA样本引导通过一个纳米孔，并通过监测DNA分子在纳米孔中电信号的变化来实现测序的技术。
这种技术的一个代表是Oxford Nanopore Technologies（ONT）的MinION测序技术。
在MinION测序技术中，DNA样本通过纳米孔时，会引起电信号的变化，这种变化可以被转化成测序信息进行读取。
这种技术具有实时、长读取长度、低成本的特点，可以在实验室和户外等多种场合进行测序，被广泛应用于移动基因组学、环境监测等领域。
第三代测序技术的出现极大地推动了基因组学、转录组学等研究领域的发展。
它们不仅提高了测序的速度和准确性，还降低了测序的成本，使得大规模基因组和转录组的测序成为可能。
在人类基因组计划中，第三代测序技术被广泛应用于完成全基因组的测序任务，为研究人类基因组提供了重要的数据资源。
同时，第三代测序技术也被广泛应用于微生物学、农业科学、生物多样性研究等领域，为相关研究提供了有力的支持。
然而，尽管第三代测序技术在测序速度和准确性上有了巨大的进步，但其仍然存在一些挑战和限制。
比如，第三代测序技术在读取长度和错误率等方面仍有改进的空间，同时对于复杂的基因结构和重复序列的测序仍然存在困难。
基因测序的前世今生（一代测序,二代测序,三代测序最详原理）
测序技术的前世今生测序技术的发展历程第一代测序技术（Sanger测序）第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）,在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础。
原理：ddNTP的3’无羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP （分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。
第二代测序技术(NGS)第一代测序技术的主要特点是测序读长可达1000bp，准确性高达99.999%，但其测序成本高，通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规模的应用。
经过不断的技术开发和改进，以Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa、Hiseq技术和ABI公司的Solid技术为标记的第二代测序技术诞生了。
其大大降低了测序成本的同时，还大幅提高了测序速度，并且保持了高准确性，以前完成一个人类基因组的测序需要3年时间，而使用二代测序技术则仅仅需要1周，但在序列读长方面比起第一代测序技术则要短很多，大多只有100bp-150bp。
1.illuminaIllumina公司的Solexa和Hiseq是目前全球使用量最大的第二代测序机器，占全球75%以上，以HiSeq系列为主，技术核心原理都是边合成边测序的方法，测序过程主要分为以下4步：步：1）构建DNA测序文库测序文库DNA分子用超声波打断成200bp-500bp长的序列片段，并在两端添加上不同的接头。
2）测序流动槽（flowcell）结构：Flowcell是测序的载体，课吸附DNA文库，每个flowcell有8条lane，每个lane有2镜头课捕获荧光信号。
三代测序技术原理
三代测序技术原理随着科技的不断进步，人们对基因组的研究也越来越深入。
测序技术作为基因组研究的核心工具，也在不断发展和创新。
三代测序技术是一种新兴的测序技术，在基因组研究中具有重要的意义。
本文将从三代测序技术的原理出发，详细介绍其工作原理和应用。
三代测序技术是指第三代测序技术，与第一代和第二代测序技术相比，具有更高的测序速度、更低的成本和更高的准确性。
三代测序技术的原理主要包括单分子测序和实时测序两个方面。
在单分子测序中，DNA分子被直接测序，无需进行PCR扩增和文库构建等步骤。
这种直接测序的方法可以避免PCR引入的差错和文库构建过程中的偏差，提高了测序的准确性。
而实时测序则是指在测序过程中可以实时监测测序结果，实时获得测序信息。
这种实时监测的方法可以提高测序的效率和准确性，同时减少了后续的数据分析和处理时间。
三代测序技术的工作原理主要包括DNA片段的制备、测序仪器的工作和数据分析三个步骤。
在DNA片段的制备过程中，需要将DNA样本进行处理，得到适用于测序的DNA片段。
这个过程包括DNA的纯化、断裂和连接等步骤。
其中，DNA的纯化是将样本中的DNA分离出来，去除杂质。
断裂是将DNA分子打断成适当的长度，以便于测序。
连接是将适配体连接到断裂的DNA片段上，为后续的测序做准备。
接下来，测序仪器开始工作。
测序仪器会对DNA片段进行测序，获取其碱基序列信息。
具体来说，测序仪器会通过不同的测序方法，如单分子实时测序或单分子循环测序，对DNA片段进行测序。
在测序过程中，测序仪器会记录下每个碱基的信号，并将其转化为测序数据。
得到的测序数据需要进行分析和处理。
这一步骤主要包括数据质控、序列比对和变异检测等。
数据质控是对测序数据进行筛选，去除低质量的测序结果。
序列比对是将测序结果与参考基因组进行比对，以确定测序结果在基因组中的位置。
变异检测是根据测序结果，寻找样本中的变异位点，如单核苷酸多态性（SNP）或结构变异。
三代测序鉴定菌种
咨询年终工作计划范文模板尊敬的各位同事：大家好！随着一年的工作即将接近尾声，年终工作计划成为了我们共同关注的焦点。
为了更好地达成我们的工作目标，提高工作效率，我特意起草了年终工作计划，以便我们共同商讨和完善。
一、回顾过去一年的工作在过去的一年里，我们取得了许多值得骄傲的成绩。
我们团队在市场推广方面取得了较好的成绩，产品的市场份额稳步增长。
在客户服务方面，我们加强对客户的维护和管理，提高了客户满意度。
在团队建设方面，我们加强了部门人员的培训，提升了团队的整体素质和创造力。
在内部协作方面，我们建立了更为完善的协作机制，团队成员之间的合作更加紧密。
二、年终工作总结与考核在取得成绩的同时，我们也应当清醒地认识到存在的问题和不足之处。
在市场推广方面，我们与竞争对手相比还存在一定的差距，我们需要加大宣传和推广力度。
在客户服务方面，部分客户对产品的满意度未能得到提高。
在团队建设方面，部分团队成员的工作积极性不够高。
在内部协作方面，团队成员之间的信息沟通不畅，存在一定的理解和沟通障碍。
三、未来一年的工作目标和计划在未来的一年里，为了更好的完成各项工作任务，我们团队制定了以下工作目标和计划。
在市场推广方面，我们将加大宣传力度，扩大产品的市场份额，加强与经销商的合作。
在客户服务方面，我们将加大对客户的关怀和维护，提高客户的满意度。
在团队建设方面，我们将加强团队成员的培训和激励，提高团队整体素质和创造力。
在内部协作方面，我们将建立更为完善的协作机制，加强团队成员之间的信息沟通和协调，解决工作中存在的沟通和理解障碍。
四、年终工作计划的实施和落实为了更好地实施和落实年终工作计划，我们团队将采取以下几种措施。
在市场推广方面，我们将加大宣传和推广力度，制定详细的宣传计划，加强与经销商的合作。
在客户服务方面，我们将建立客户满意度调查机制，及时掌握客户的需求和意见，不断改进客户服务质量。
在团队建设方面，我们将定期组织各类培训和学习活动，提高团队成员的综合素质。
rna测序和质谱技术
rna测序和质谱技术
RNA测序（RNA sequencing）是一种高通量的技术，用于确
定细胞或组织中RNA分子的序列和相对表达水平。
通过RNA 测序，可以了解到细胞中哪些基因是活跃的，并在不同条件下对基因表达进行比较分析。
常见的RNA测序技术包括Sanger
测序、二代测序（如Illumina测序）和第三代测序（如PacBio 和Oxford Nanopore测序）。
质谱技术是一种分析化学方法，用于确定化合物的质量和结构。
RNA质谱技术（RNA mass spectrometry）是指利用质谱技术
对RNA分子进行分析和鉴定。
通过质谱技术，可以获得RNA 分子的质量、碱基组成、序列和修饰等信息。
常见的RNA质
谱技术包括质谱法碱基测序（mass-based base sequencing）、
质谱法测序（mass sequencing）和质谱法修饰检测（mass-based modification detection）等。
综上所述，RNA测序是一种分析RNA分子序列和相对表达水平的技术，而RNA质谱技术则是一种用质谱技术对RNA分
子进行分析和鉴定的方法。
两者在RNA分子的研究中各具优势，并可相互辅助应用。
DNA第一代,第二代,第三代测序的介绍
原理是：核酸模板在DNA聚合酶、引物、4 种单脱氧核苷三磷酸 ( d NTP，其中的一种用放射性P32标记 )存在条件下复制时，在四管反应系统中分别按比例引入4种双脱氧核苷三磷酸 ( dd NTP )，因为双脱氧核苷没有3’-O H，所以只要双脱氧核苷掺入链的末端，该链就停止延长，若链端掺入单脱氧核苷，链就可以继续延长。
如此每管反应体系中便合成以各自的双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。
反应终止后，分4个泳道进行凝胶电泳，分离长短不一的核酸片段，长度相邻的片段相差一个碱基。
经过放射自显影后，根据片段3’端的双脱氧核苷，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。
Sanger法因操作简便，得到广泛的应用。
后来在此基础上发展出多种DNA 测序技术，其中最重要的是荧光自动测序技术。
荧光自动测序技术荧光自动测序技术基于Sanger 原理，用荧光标记代替同位素标记，并用成像系统自动检测，从而大大提高了D NA测序的速度和准确性。
20世纪80 年代初Jorgenson 和 Lukacs提出了毛细管电泳技术( c a p il l ar y el ect r ophor es i s )。
1992 年美国的Mathies实验室首先提出阵列毛细管电泳 ( c a p il l ar y ar r a y el ectr ophor es i s ) 新方法，并采用激光聚焦荧光扫描检测装置，25只毛细管并列电泳，每只毛细管在内可读出350 bp，DNA 序列,分析效率可达6 000 bp/h。
1995年Woolley研究组用该技术进行测序研究，使用四色荧光标记法，每个毛细管长，在9min内可读取150个碱基，准确率约 97 % 。
目前, 应用最广泛的应用生物系统公司 ( ABI ) 37 30 系列自动测序仪即是基于毛细管电泳和荧光标记技术的D NA测序仪。
如ABI3730XL 测序仪拥有 96 道毛细管, 4 种双脱氧核苷酸的碱基分别用不同的荧光标记, 在通过毛细管时不同长度的 DNA 片段上的 4 种荧光基团被激光激发, 发出不同颜色的荧光, 被 CCD 检测系统识别, 并直接翻译成 DNA 序列。
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第三代测序技术与质谱测序技术的
介绍和比较
质谱蛋白测序
质谱分析是一种测量离子质荷比的分析方法。
一级质谱主要是给出目标物的分子量，GC-MS一级谱图可以定性分析，LC-MS能用于简单的分子量测定。
二级质谱可以看出目标物的部分碎片，可以对目标物的结构进行分析。
在蛋白测序方面，一级质谱结合肽质量指纹图谱(peptide mass fingerprint，PMF)可以初步推测蛋白质的种类、序列。
PMF基本原理是将蛋白质直接从双向电泳凝胶上切下或印迹到PVDF膜上并切下，经过原位酶解得到酶解肽段，然后用质谱得到这些肽段的PMF，即获得了肽质量指纹图谱。
由于每种蛋白质氨基酸序列都不同，当蛋白质被酶解后，产生的肽片段序列也不同，其肽混合物质量数即具一定特征性。
用实测的肽段质量去查找蛋白质和核酸序列库，结合适当的计算机算法，可鉴定蛋白质。
但这种方法不能用来直接测序，必须依靠大量的数据库信息进行比对，准确率也受到限制。
串联质谱可直接用于测定肽段的氨基酸序列，其过程是从一级质谱产生的肽段中选择母离子，进入二级质谱，经惰性气体碰撞后肽段沿肽链断裂，由所得到的各肽段质量数差值推定肽段序列。
得到的质谱数据既可以通过仪器提供的软件解析，也可以进行手工解析。
在第一级质谱得到肽的分子离子,选取目标肽的离子作为母离子，与惰性气体碰撞，使肽链中的肽键断裂。
主要有三种不同的肽键断裂方式，产生6中不同的碎裂离子：即N端的a, b, c型离子与C端的x, y, z型离子. 每种断裂类型分别生成互补的两种离子, 如a-x,b-y,c-z 。
最常见的是a 型离子、b 型离子和y型离子，其他类型离子较少出现。
将这些碎片离子系列综合分析，可得出肽段的氨基酸序列。
质谱法有不少优点，还能用于翻译后修饰的分析（糖基化、磷酰化），但目前只适用于20个氨基酸以下的肽段。
此外，还存在固有的局限性，比如Leu和Ile、Lys和Gln不能区分，有些肽的固有序列不能用质谱法测定。
第三代测序
测序技术在近几年中又有新的里程碑。
以PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies纳米孔单分子测序技术，被称之为第三代测序技术。
与前两代相比，他们最大的特点就是单分子测序，测序过程无需进行PCR扩增。
SMRT（single molecule Real-Time）测序技术
该技术其实应用了二代测序边合成边测序的思想，并以SMRT芯片为测序载体。
基本原理是：DNA聚合酶和模板结合，4色荧光标记的4种碱基（即是dNTP），在碱基配对阶段，不同碱基的加入，会发出不同光，根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。
具体的反应在零级波导孔(zero-mode waveguides, ZMW)的纳米结构中完成。
这种ZMW是直径50-100纳米，深度100nm的孔状纳米光电结构，通过微加工在二氧化硅基质的金属铝薄层上形成微阵列，光线进入ZMW后会呈指数级衰减，从而使得孔内仅有靠近基质的部分被照亮。
Φ29 DNA聚合酶被固定在ZMW的底部，模板和引物结合之后被加到酶上，再加入四色荧光标记的dNTP (A555-dATP, A568-dTTP, A647-dGTP, A660-dCTP)。
当DNA合成进行时，连接上的dNTP由于在ZMW底部停留的时间较长(约200ms)，其荧光信号能够与本底噪音区分开来，从而被识别。
荧光基团被连接在dNTP的磷酸基团上，因此在延伸下一个碱基时，上一个dNTP的荧光基团被切除，从而保证了检测的连续性，提高了检测速度。
SMRT的测序原理如图所示。
图A显示的是ZMW的结构，激光进入ZMW后呈指数级衰减，仅能照亮靠近底部的约30nm区域，因此大部分游离的荧光标记dNTP不会被激发，只有结合到DNA聚合酶上的dNTP其荧光基团被激光照亮，激发荧光。
图B显示的是DNA合成过程中检测到的荧光信号及持续时间。
结合到酶上的dNTP停留时间较长，信号呈脉冲式激发，因而能够与噪音区分。
另外，可以通过检测相邻两个碱基之间的测序时间，来检测一些碱基修饰情况，既如果碱基存在修饰，则通过聚合酶时的速度会减慢，相邻两峰之间的距离增大，可以通过这个来之间检测甲基化等信息。
SMRT技术的测序速度很快，每秒约10个dNTP。
但是，同时其测序错误率比较高，达到15%。
但好在它的出错是随机的，并不会像第二代测序技术那样存在测序错误的偏向，因而可以通过多次测序来进行有效的纠错。
纳米单分子测序技术
与以往的测序技术皆不同，它是基于电信号而不是光信号的测序技术。
该技术的关键之一是，他们设计了一种特殊的纳米孔，孔内共价结合有分子接头。
借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔，当DNA碱基通过纳米孔时，它们使电荷发生变化，从而短暂地影响流过纳米孔的电流强度，而ATCG单个碱基的带电性质不一样，通过电信号的差异就能检测出通过的碱基类别，从而实现测序。
纳米孔测序的主要特点是：读长很长，大约在几十kb，甚至100 kb;错误率目前介于1%至4%，且是随机错误，通量很高，起始DNA在测序过程中不被破坏，以及样品制备简单又便宜，理论上可以直接测序RNA。
纳米孔单分子测序计算还有另一大特点，它能够直接读取出甲基化的胞嘧啶，而不必像传统方法那样对基因组进行bisulfite处理。
这对于在基因组水平直接研究表观遗传相关现象有极大的帮助。
但也面临DNA易位速率过快，电流变化幅度较小，制备纳米孔材料的稳定性等问题。
测序技术比较
1、目的。
两种方法都是为了进行测序。
2、对象。
都是生物细胞产物。
三代测序对象是单细胞的DNA片段，不需要PCR扩增，分析单一的核苷酸种类；质谱测序对象是蛋白质的多肽片段，分析单一的氨基酸种类。
3、结果。
获得目的片段的序列。
三代测序得到DNA或RNA序列，质谱测序得到多肽序列。
两者序列可以相互换算验证。
4、原理。
三代测序基于碱基互补配对原则，边合成边测序；质谱测序根据不同离子碎片荷质比的差异进行区分。
5、检测方法。
三代测序利用荧光信号或电信号等检测，不同核苷酸对应不同信号，信号时间的不同可以区分碱基的修饰类型；质谱测序通过荷质比数据计算分析，计算中有一些特定的规律、公式，也有一些不可克服的误差因素。
6、读长。
三代测序读长很高，可以达到3000bp，测序速度约10bp/s；质谱测序只能针对小片段的多肽，在20个氨基酸左右。
7、修饰。
都可以检测发生的修饰。
三代测序通过核苷酸合成的时间检测碱基修饰；质谱测序通过荷质比分析氨基酸发生的修饰。
8、精度。
三代测序单次准确度约85%，重复测序可是准确率达到99.9999%；质谱测序准确率较高，但有部分氨基酸不能通过荷质比进行区分。
蛋白分析新技术
超高分辨率显微技术
自从1873年Ernst Abbe第一次发现光学成像具有衍射限制现象以来，物理学界就公认，显微镜的分辨率具有极限，该极限与光源的波长有关。
直到一个多世纪之后，罗马尼亚物理学家Stefan Hell推翻了这一观点。
他是首位不仅从理论上论证了，而且用实验证明了使用光学显微镜能达到纳米级分辨率的科学家。
自从2006年STORM技术和PALM技术问世以来，科技工作者就一直在不断努力，对它们进行改进、完善和提升。
新技术比以往所有光学3D成像技术的分辨率都要高出10倍，使以前很多看起来不可能的事情现在都变得可能了，对于蛋白质的分析研究有非常重要的意
义。
蛋白质芯片技术
蛋白质芯片原理是对固相载体进行特殊的化学处理，再将已知的蛋白分子产物固定其上（如酶、抗原、抗体、受体、配体、细胞因子等），根据这些生物分子的特性，捕获能与之特异性结合的待测蛋白（存在于血清、血浆、淋巴、间质液、尿液、渗出液、细胞溶解液、分泌液等），经洗涤、纯化，再进行确认和生化分析；它为获得重要生命信息（如未知蛋白组分、序列。
体内表达水平生物学功能、与其他分子的相互调控关系、药物筛选、药物靶位的选择等）提供有力的技术支持。
蛋白分离鉴定技术
基于色谱技术的二维色谱(2D-LC)、二维毛细管电泳(2D-CE)、液相色谱－毛细管电泳(LC-CE) 等新型分离技术，基于质谱技术的质谱鸟枪法(Shot-gun)、毛细管电泳-质谱联用(CE-MS)等新技术都可以在蛋白分离鉴定上发挥重要作用。
华东师范大学
张佳舜
51151300095。