丹皮酚影响人胶质母细胞瘤细胞组织因子表达的体外研究

·实验研究·丹皮酚影响人胶质母细胞瘤细胞组织因子表达的体外研究＊汤浩１△　程彦磊２△　张本平３　赵婕３　方峻３ ［摘要］　目的：研究丹皮酚（Ｐａｅ）对人胶质母细胞瘤细胞Ｕ２５１中组织因子（ＴＦ）表达的调控。

方法：以实时定量ＰＣＲ法检测ＴＦ转录水平，以Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测ＴＦ表达水平。

结果：①Ｐａｅ可呈剂量依赖性下调Ｕ２５１细胞ＴＦ的转录水平，当Ｐａｅ作用浓度分别为４７、９４、１８８、３７６、７５２和１　５０４μｍｏｌ／Ｌ时，对Ｕ２５１细胞ＴＦ　ｍＲＮＡ的抑制率分别为３６．５４％、７０．３２％、７３．１６％、６８．９８％、８７％和９３．３８％（均Ｐ＜０．０１）；②Ｐａｅ对Ｕ２５１细胞ＴＦ转录的抑制作用随着时间的延长而逐渐增强；③Ｐａｅ可显著降低Ｕ２５１细胞ＴＦ蛋白的表达。

结论：Ｐａｅ可显著降低人胶质母细胞瘤细胞中ＴＦ的转录及表达，有可能通过下调ＴＦ表达而干预人胶质母细胞瘤细胞的化疗敏感性。

［关键词］　丹皮酚；组织因子；胶质母细胞瘤 ［中图分类号］　Ｒ７３－３ ［文献标志码］　Ａ ［文章编号］　１００１－１４２０（２０１１）０９－０５４１－０４Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　ｒｅｇｕｌａｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｐａｅｏｎｏｌ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ　ｔｉｓｓｕｅ　ｆａｃｔｏｒ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ　ｃｅｌｌｓＴＡＮＧ　Ｈａｏ１△　ＣＨＥＮＧ　Ｙａｎｌｅｉ１△　ＺＨＡＮＧ　Ｂｅｎｐｉｎｇ３　ＺＨＡＯ　Ｊｉｅ３　ＦＡＮＧ　Ｊｕｎ３（１　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｓｕｒｇｉｃａｌ　ＩＣＵ，Ｗｕｈａｎ　Ｆｉｒｓｔ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｗｕｈａｎ，４３００２２，Ｃｈｉｎａ；２Ｆｉｒｓｔ　ＣｌｉｎｉｃａｌＳｃｈｏｏｌ，Ｔｏｎｇｊｉ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｈｕａｚｈｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；３　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆ　Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｏｎ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｔｏｎｇｊｉ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｈｕａｚｈｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ） Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｒｅｇｕｌａｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｐａｅｏｎｏｌ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｉｓｓｕｅ　ｆａｃｔｏｒ（ＴＦ）ｉｎｈｕｍａｎ　ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ　ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄ：Ｈｕｍａｎ　ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ　Ｕ２５１ｃｅｌｌｓ　ｗｅｒｅ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｒｔｉｍｅ　ｏｆ　ｐａｅｏｎｏｌ．Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＰＣＲ　ｗａｓ　ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｔｈｅ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ＴＦ　ｍＲＮＡ．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｖｅ　ｌｅｖｅｌｏｆ　ＴＦ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｂｙ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ．Ｒｅｓｕｌｔ：①Ｐａｅｏｎｏｌ　ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｏｆ　ＴＦ　ｉｎ　Ｕ２５１ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ａｄｏｓｅ－ｄｅｐｅｎｄａｎｔ　ｍａｎｎｅｒ．Ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｒａｔｅｓ　ｏｆ　ＴＦ　ｍＲＮＡ　ｌｅｖｅｌ　ｗｅｒｅ　３６．５４％（Ｐ＜０．０５），７０．３２％（Ｐ＜０．０１），７３．１６％（Ｐ＜０．０１），６８．９８％（Ｐ＜０．０１），８７％（Ｐ＜０．０１）ｏｒ　９３．３８％（Ｐ＜０．０１）ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｗｈｅｎ　Ｕ２５１ｃｅｌｌｓｗｅｒｅ　ｉｎｃｕｂａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｐａｅｏｎｏｌ　ａｔ　ａ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　４７，９４，１８８，３７６，７５２ｏｒ　１　５０４μｍｏｌ·Ｌ－１　ｆｏｒ　２４ｈｏｕｒｓ．②Ｐａｅｏｎｏｌｉｎｈｉｂｉｔｅｄ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｏｆ　ＴＦ　ｉｎ　Ｕ２５１ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ａ　ｔｉｍｅ－ｄｅｐｅｎｄａｎｔ　ｍａｎｎｅｒ．③Ｐａｅｏｎｏｌ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＴＦ　ｉｎ　Ｕ２５１ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ａ　ｄｏｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｍａｎｎｅｒ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｐａｅｏｎｏｌ　ｅｘｅｒｔｓ　ａｎ　ｏｂｖｉｏｕｓ　ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａ－ｔｉｎｇ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＴＦ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ　ｃｅｌｌｓ．Ｉｔ　ｍａｙ　ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ　ｔｏ　ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｔｈｅ　ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ　ｃｅｌｌｓ　ｗｈｉｃｈ　ｄｅｓｅｒｖｅｓ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｓｔｕｄｙ． Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　ｐａｅｏｎｏｌ；ｔｉｓｓｕｅ　ｆａｃｔｏｒ；ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ＊基金项目：武汉市卫生局科研项目基金（Ｎｏ：武卫［２０１０］４２）１武汉市第一医院外科ＩＣＵ（武汉，４３００２２）２华中科技大学同济医学院第一临床学院３华中科技大学同济医学院附属协和医院血液科△共同贡献第一作者通信作者，方峻，Ｅ－ｍａｉｌ：ｆａｎｇｊｕｎｔｈ＠１２６．ｃｏｍ 组织因子（ＴＦ）是众所周知的外凝血途径启动因子。

近年来ＴＦ的信号转导受体特性和非凝血功能逐渐引人瞩目，尤其是对肿瘤发生、发展过程的影响〔１－３〕。

多种肿瘤细胞、肿瘤患者血浆中ＴＦ表达异常增高，不仅促进肿瘤生长、侵袭和转移，也可增强肿瘤的血管新生，ＴＦ的表达水平尚和肿瘤的恶性程度、病理特征、组织学分级以及预后相关〔１－５〕。

我们的前期研究也发现ＴＦ异常高表达可以提高胶质母细胞瘤细胞和神经母细胞瘤细胞对化疗药物的耐受性，抑制肿瘤细胞凋亡〔６－８〕。

新近研究证实下调ＴＦ表达可抑制肿瘤的发生和发展〔９－１０〕，然而目前调控ＴＦ基因表达或功能多采用干扰ＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、单克隆抗体等手段，涉及天然化合物对ＴＦ表达调控的研究报道甚为少见。

本文研究了天然单体化合物丹皮酚（ｐａｅｏｎｏｌ，Ｐａｅ）对人胶质母细胞瘤中ＴＦ基因转录和表达的影响。

１　材料与方法１．１　细胞系及试剂人胶质母细胞瘤细胞系Ｕ２５１购自中国典型培养物保藏中心（Ｃｈｉｎａ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ·１４５·临床血液学杂志２０１１年９月第２４卷第９期Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ），并在含有１０％胎牛血清（购自浙江杭州四季青生物工程有限公司）、２ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｌ－ｇｌｕｔａ－ｍｉｎｅ、５０Ｕ／ｍｌ青霉素及５０μｇ／ｍｌ链霉素的ＤＭＥＭ高糖培养基（购自美国ＨｙＣｌｏｎｅ公司）中，于Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｓｔｅｒｉ－Ｃｕｌｔ　ＣＯ２培养箱（购自美国Ｆｏｒｍａ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司）中、３７℃、５％ＣＯ２环境下培养，取对数生长期细胞用于实验。

总ＲＮＡ提取试剂ＲＮＡｉｓｏ　Ｐｌｕｓ、逆转录试剂盒ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ、实时定量荧光染料ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　ＴａｑＴＭ购自日本ＴａＫａＲａ　ＢＩＯ株式会社大连宝生物工程有限公司，鼠抗人ＴＦ单抗（ＴＦ９－１０Ｈ１０）购自德国Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ公司，鼠抗人β－ａｃｔｉｎ单抗购自Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ公司。

１．２　药物处理Ｐａｅ购自美国Ｓｉｇｍａ公司（产品编号：Ｈ３５８０３，分子量：１６６．１７），以二甲基亚砜（ＤＭＳＯ，购自美国Ｓｉｇｍａ公司）溶解稀释为５．７８ｍｏｌ／Ｌ原液保存。

取对数生长期Ｕ２５１细胞，以２×１０５／孔密度接种于６孔培养板中。

待细胞贴壁后，在浓度梯度实验中，Ｐａｅ组分别加入不同浓度Ｐａｅ，对照组加入等量等密度细胞悬液，溶剂组加入Ｐａｅ的相应稀释溶剂ＤＭＳＯ，连续培养２４ｈ后进行实时定量ＰＣＲ检测和Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ分析；在时间梯度实验中，Ｐａｅ组是以分别９４μｍｏｌ／Ｌ　Ｐａｅ分别作用４、１２、２４ｈ，同样设置对照组和溶剂组，进行实时定量ＰＣＲ检测。

１．３　实时定量ＰＣＲＰａｅ作用结束后，以ＲＮＡｉｓｏ　Ｐｌｕｓ提取总ＲＮＡ。

以ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＲＴ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ将总ＲＮＡ逆转录为ｃＤＮＡ，反应体系及条件依照试剂盒说明书设定。

由日本ＴａＫａＲａ　ＢＩＯ株式会社大连宝生物工程有限公司根据人ＴＦ基因序列（ＡＣ－ＣＥＳＳＩＯＮ　ＮＯ：Ｍ１６５５３）设计并合成引物，上游引物序列：５’－ＧＧＣＧＣＴＴＣＡＧＧＣＡＣＴＡＣＡＡＡＴＡ－３’，下游引物序列：５’－ＴＧＡＴＴＧＡＣＧＧＧＴＴＴ－ＧＧＧＴＴＣ－３’。

以人β－ａｃｔｉｎ作为内参照，由同一公司根据其基因序列（ＧＩ：５０１６０８８）设计并合成引物，上游引物序列：５’－ＴＧＧＣＡＣＣＣＡＧＣＡＣＡＡＴ－ＧＡＡ－３’，下游引物序列：５’－ＣＴＡＡＧＴＣＡＴ－ＡＧＴＣＣＧＣＣＴＡＧＡＡＧＣＡ－３’。

实时定量ＰＣＲ反应体系依照ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　ＴａｑＴＭ说明书设定，运用Ｍｘ３０００ＰＴＭ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ扩增仪（美国Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ公司）进行扩增，扩增反应程序：９５℃预变性３０ｓ，其后９５℃变性５ｓ，５５℃退火３０ｓ，７２℃延伸３０ｓ，４５个循环。

反应结束得到各样品Ｃｔ值后，以ΔＣｔ＝Ｃｔ目的基因（ＴＦ）－Ｃｔ内参基因（β－ａｃｔｉｎ），根据２－ΔΔＣｔ方法分析ＴＦ的表达差异，以２－ΔΔＣｔ＞１为基因表达上调，反之下调，并作图分析。

１．４　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ收集细胞后，以细胞裂解液处理，离心后取上清，以考马斯亮蓝法（Ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｓｓａｙ，Ｂｉｏ－Ｒａｄ，美国）进行蛋白质定量。

蛋白变性后，以含有１０μｇ总蛋白的样本进行１０％ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳，之后将凝胶上的蛋白质电转移到硝酸纤维素膜上，封闭液封闭后，分别以特异性ＴＦ、β－ａｃｔｉｎ单抗孵育，４℃过夜，继而与辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育１ｈ，以增强化学发光法（ＥＣＬ，ＡｍｅｒｓｈａｍＬｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，英国）显色。

以β－ａｃｔｉｎ作为蛋白质完整性及等量的对照。

１．５　统计学处理上述实验中每种处理均重复进行３次，部分结果以珚ｘ±ｓ表示。

利用ＳＰＳＳ１５．０软件系统进行统计分析，选用ｔ检验法进行统计学处理，以Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。

２　结果２．１　Ｐａｅ呈剂量依赖性抑制人胶质母细胞瘤细胞ＴＦ转录本研究结果显示，Ｐａｅ可以显著降低胶质母细胞瘤Ｕ２５１细胞ＴＦ　ｍＲＮＡ的水平，当Ｐａｅ作用浓度分别为４７、９４、１８８、３７６、７５２、１　５０４μｍｏｌ／Ｌ时，Ｕ２５１细胞ＴＦ　ｍＲＮＡ水平分别为对照的（６３．４６±１０．４５）％、（２９．６８±７．１０）％、（２６．８４±９．０５）％、（３１．０２±７．０４）％、（１３．０±６．２４）％、（６．６３±２．２９）％（均Ｐ＜０．０１）；Ｐａｅ对Ｕ２５１细胞的ＴＦ转录的抑制率分别为３６．５４％、７０．３２％、７３．１６％、６８．９８％、８７％、９３．３８％（均Ｐ＜０．０１）（图１）。