大肠杆菌感受态细胞
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（2）每组取培养液3个2ml转入2ml离心管 中 ， 在 冰 上 冷 却 20-30min ， 于 4℃ ， 4000r ／min离心10min（从这一步开始，所有操 作均在冰上进行，速度尽量快而稳）；
（ 3 ） 倒 净 上 清 培 养 液 ， 用 1ml 冰 冷 的 0.1mo1／L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴； （4）0～4℃，4000r／min离心10min； （ 5 ） 弃 去 上 清 液 ， 加 入 500µl 冰 冷 的 0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞。 0～4℃，4000r／min离心10min；
以称这种现象为-互补现象。
9
由互补产生的－半乳糖苷酶(LacZ)能够作用
于生色底物5－溴－4－氯－3－吲哚－－D－ 半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落，所以利 用这个特点，在载体的该基因编码序列之间 人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源
DNA片段时，会造成LacZ()基因的失活，破
坏-互补作用，就不能产生具有活性的酶。 所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重 组质粒的菌落为蓝色。
4
转化的方法：
1. 化学的方法(热击法)；使用化学试剂（如 CaCl）制备的感受态细胞，通过热击处 理将载体DNA分子导入受体细胞；
2. 电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的 感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体 DNA分子导入受体细胞。
5
克隆的筛选：
主要用不同抗生素基因筛选。常用的 抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、 氯霉素、四环素、链霉素等；
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2）细胞转化
(1) 分别取3个100µl感受态细胞悬液(如是冷 冻保存液，则需化冻后马上进行下面的操 作)，第一组，加入10 µl重组质粒DNA(体 积不超过10µl)+ 100µl感受态细胞，此管为 转化实验组。第二组，插入DNA片段对照 组，即酶切后DNA片段25ng+100µl感受态 细胞悬液；第三组，质粒DNA对照组，即 1ng 未酶切pBluescript 质粒DNA十100µl感 受态细胞悬液。
组
含抗菌素的平板 结果说明
转化实验组
插入DNA片 段对照组 质粒对照组
白色菌落和少量 蓝色菌落
无菌落或极少量 白色菌落 蓝色菌落
说明有重组质粒导入细 胞中（有时还需要酶切 进一步鉴定〕
说明插入片段比较纯或 有少量模板DNA存在
可以判断感受态细胞的 效率
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转化体总数＝菌落数×（转化反应原液总体积/涂 板菌液体积） 插入频率＝蓝色菌落数/白色菌落数 转化频（效）率＝转化体总数/加入质粒DNA的量 （计算出每微克的转化菌落数）
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(2) 将以上各样品轻轻摇匀，冰上放置2030min ， 于 42℃ 水 浴 中 保 温 1 － 2min ， 然 后 迅速冰上冷却2min
(3) 立即向上述管中分别加入0.4ml LB液体 培养基（不需在冰上操作），使总体积到 0.5ml ， 该 溶 液 称 为 转 化 反 应 原 液 ， 摇 匀 后 于37℃振荡培养约45-60min ，使受体菌恢复 正常生长状态，并使转化体表达抗生素基因 产物(Ampr)。
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（6）弃去上清液，加入100µl冰冷的0.1mo1／ L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻 后，即制成了感受态细胞悬液； （7）制备好的感受态细胞悬液可直接用于转 化实验，也可加入占总体积15％左右高压灭菌 过的甘油，混匀后分装于1.5ml离心管中，置 于-70℃条件下，可保存半年至一年。
10
11
重组DNA转化细菌过 程示意图
12
3．仪器、材料和试剂
无菌超净台，电热恒温水浴，分光光度计，离心 机，移液器，微型离心管等；
菌株：E.coli DH5α
质粒：pBluscript KS+DNA 片段的重组质粒以 及pBluscript KS 空质粒；
LB培养基；含抗菌素的LB平板培养基（氨苄青霉 素 ， 浓 度 50-100µg ／ mL ， X-gal 20-48µg/ml, IPTG 100 µg/ml。一般将抗生素、X-gal和IPTG 配 制 成 1000 储 备 液 ， 用 时 按 培 养 基 的 量 再 加 入）；
预冷CaCl2溶液（0.1mol／L） 13
4．操作步骤
1）大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法)
（1）从新活化的E.coli DH5α菌平板上挑取 一单菌落，接种于3～5ml LB液体培养中， 37℃振荡培养12h左右，直至对数生长期。将 该菌悬液以1:100～1:50转接于100ml LB液体 培养基中，37℃振荡扩大培养，当培养液开 始 出 现 混 浊 后 ， 每 隔 20 ～ 30min 测 一 次 OD600nm，至OD600nm≤0.5时停止培养；
大肠杆菌感受态细胞的制备、 重组DNA的转化、克隆筛选
1
1. 实验目的和要求
通过本实验学习氯化钙法制备大肠杆 菌感受态细胞和外源质粒DNA转入受 体菌细胞的技术以及筛选转化体的技 术。了解细胞转化的概念及其在分子 生物学研究中的意义。
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2. 相关知识及原理
感受态细胞(Competent cells): 受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl， RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的 通透性发生变化，成为能容许多有外源 DNA 的 载 体 分 子 通 过 的 感 受 态 细 胞 (competent cell) 。
3
转化（transformation）：
是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细 胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程 等研究领域的基本实验技术。
进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现 遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性 状。转化过程所用的受体细胞一般是限制－修 饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和 甲基化酶的突变株。
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6
将经过转化后的细胞在选择性抗生素培养 基中培养，才能较容易地筛选出转化体， 即带有异源DNA分子的受体细胞。否则， 如果将转化后的菌液涂在无选择性抗生素 的培养基平板上，会出现成千上万的细菌 菌落，将难以确认哪一个克隆含有转化的 质粒。虽然只有那些含有被转化质粒的细 菌才能在含有抗生素的平板上生长和繁殖， 但对于连接混合物而言，此时并不能确定 哪个克隆含有插入片段。
用 CaCl2法制备的感受态细胞，可使每微克 超螺旋质粒 DNA产生5106-2107个转化菌 落。在实际工作中，每微克有105以上的转化 菌落足以满足一般的克隆实验。
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4) 检出转化体和计算转化率
统计每个培养皿中的菌落数，各实验组 培养皿内菌落生长状况应如表所示:
21
各实验组在培养皿内菌落生长状况及结果分析
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3) 平板培养（有时需要稀释）
(1)取各样品培养液0.1ml，分别接种于 含 抗菌素 LB平 板 培养基 上 ， 涂 匀 （如果用玻璃棒涂抹，酒精灯烧过 后稍微凉一下再用，不要过烫）。
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(2) 菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿， 于37℃恒温培养箱内培养过夜(12-16小时)， 待菌落生长良好而又未互相重叠时停止培养， 对于可以蓝白斑筛选的质粒和菌株来说，此 时应该能清楚地看到蓝色和白色菌落。
列和头146个氨基酸的编码信息，编码-互补 肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型-半乳糖 苷酶实现基因内互补（ -互补）。当这种载 体转入可编码－半乳糖苷酶C端部分序列的 宿主细胞中时，在异丙基--D硫代半乳糖苷 （IPTG）的诱导下，宿主可同时合成这两种 肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但它们 可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所
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重组质粒克隆的鉴定
鉴定带有重组质粒克隆的方法常用的有互补、小规模制备质粒DNA进行酶切分析、 插入失活、PCR以及杂交筛选的方法。最 常用的方法是小规模制备质粒DNA进行酶 切分析，对于带有LacZ基因的载体还可以 结合-互补现象来筛选。
-互补现象：
因为有些载体都带有一个LacZ基因的调控序
（2）每组取培养液3个2ml转入2ml离心管 中 ， 在 冰 上 冷 却 20-30min ， 于 4℃ ， 4000r ／min离心10min（从这一步开始，所有操 作均在冰上进行，速度尽量快而稳）；
（ 3 ） 倒 净 上 清 培 养 液 ， 用 1ml 冰 冷 的 0.1mo1／L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴； （4）0～4℃，4000r／min离心10min； （ 5 ） 弃 去 上 清 液 ， 加 入 500µl 冰 冷 的 0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞。 0～4℃，4000r／min离心10min；
以称这种现象为-互补现象。
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由互补产生的－半乳糖苷酶(LacZ)能够作用
于生色底物5－溴－4－氯－3－吲哚－－D－ 半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落，所以利 用这个特点，在载体的该基因编码序列之间 人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源
DNA片段时，会造成LacZ()基因的失活，破
坏-互补作用，就不能产生具有活性的酶。 所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重 组质粒的菌落为蓝色。
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转化的方法：
1. 化学的方法(热击法)；使用化学试剂（如 CaCl）制备的感受态细胞，通过热击处 理将载体DNA分子导入受体细胞；
2. 电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的 感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体 DNA分子导入受体细胞。
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克隆的筛选：
主要用不同抗生素基因筛选。常用的 抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、 氯霉素、四环素、链霉素等；
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2）细胞转化
(1) 分别取3个100µl感受态细胞悬液(如是冷 冻保存液，则需化冻后马上进行下面的操 作)，第一组，加入10 µl重组质粒DNA(体 积不超过10µl)+ 100µl感受态细胞，此管为 转化实验组。第二组，插入DNA片段对照 组，即酶切后DNA片段25ng+100µl感受态 细胞悬液；第三组，质粒DNA对照组，即 1ng 未酶切pBluescript 质粒DNA十100µl感 受态细胞悬液。
组
含抗菌素的平板 结果说明
转化实验组
插入DNA片 段对照组 质粒对照组
白色菌落和少量 蓝色菌落
无菌落或极少量 白色菌落 蓝色菌落
说明有重组质粒导入细 胞中（有时还需要酶切 进一步鉴定〕
说明插入片段比较纯或 有少量模板DNA存在
可以判断感受态细胞的 效率
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转化体总数＝菌落数×（转化反应原液总体积/涂 板菌液体积） 插入频率＝蓝色菌落数/白色菌落数 转化频（效）率＝转化体总数/加入质粒DNA的量 （计算出每微克的转化菌落数）
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(2) 将以上各样品轻轻摇匀，冰上放置2030min ， 于 42℃ 水 浴 中 保 温 1 － 2min ， 然 后 迅速冰上冷却2min
(3) 立即向上述管中分别加入0.4ml LB液体 培养基（不需在冰上操作），使总体积到 0.5ml ， 该 溶 液 称 为 转 化 反 应 原 液 ， 摇 匀 后 于37℃振荡培养约45-60min ，使受体菌恢复 正常生长状态，并使转化体表达抗生素基因 产物(Ampr)。
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（6）弃去上清液，加入100µl冰冷的0.1mo1／ L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻 后，即制成了感受态细胞悬液； （7）制备好的感受态细胞悬液可直接用于转 化实验，也可加入占总体积15％左右高压灭菌 过的甘油，混匀后分装于1.5ml离心管中，置 于-70℃条件下，可保存半年至一年。
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重组DNA转化细菌过 程示意图
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3．仪器、材料和试剂
无菌超净台，电热恒温水浴，分光光度计，离心 机，移液器，微型离心管等；
菌株：E.coli DH5α
质粒：pBluscript KS+DNA 片段的重组质粒以 及pBluscript KS 空质粒；
LB培养基；含抗菌素的LB平板培养基（氨苄青霉 素 ， 浓 度 50-100µg ／ mL ， X-gal 20-48µg/ml, IPTG 100 µg/ml。一般将抗生素、X-gal和IPTG 配 制 成 1000 储 备 液 ， 用 时 按 培 养 基 的 量 再 加 入）；
预冷CaCl2溶液（0.1mol／L） 13
4．操作步骤
1）大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法)
（1）从新活化的E.coli DH5α菌平板上挑取 一单菌落，接种于3～5ml LB液体培养中， 37℃振荡培养12h左右，直至对数生长期。将 该菌悬液以1:100～1:50转接于100ml LB液体 培养基中，37℃振荡扩大培养，当培养液开 始 出 现 混 浊 后 ， 每 隔 20 ～ 30min 测 一 次 OD600nm，至OD600nm≤0.5时停止培养；
大肠杆菌感受态细胞的制备、 重组DNA的转化、克隆筛选
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1. 实验目的和要求
通过本实验学习氯化钙法制备大肠杆 菌感受态细胞和外源质粒DNA转入受 体菌细胞的技术以及筛选转化体的技 术。了解细胞转化的概念及其在分子 生物学研究中的意义。
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2. 相关知识及原理
感受态细胞(Competent cells): 受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl， RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的 通透性发生变化，成为能容许多有外源 DNA 的 载 体 分 子 通 过 的 感 受 态 细 胞 (competent cell) 。
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转化（transformation）：
是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细 胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程 等研究领域的基本实验技术。
进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现 遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性 状。转化过程所用的受体细胞一般是限制－修 饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和 甲基化酶的突变株。
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将经过转化后的细胞在选择性抗生素培养 基中培养，才能较容易地筛选出转化体， 即带有异源DNA分子的受体细胞。否则， 如果将转化后的菌液涂在无选择性抗生素 的培养基平板上，会出现成千上万的细菌 菌落，将难以确认哪一个克隆含有转化的 质粒。虽然只有那些含有被转化质粒的细 菌才能在含有抗生素的平板上生长和繁殖， 但对于连接混合物而言，此时并不能确定 哪个克隆含有插入片段。
用 CaCl2法制备的感受态细胞，可使每微克 超螺旋质粒 DNA产生5106-2107个转化菌 落。在实际工作中，每微克有105以上的转化 菌落足以满足一般的克隆实验。
20
4) 检出转化体和计算转化率
统计每个培养皿中的菌落数，各实验组 培养皿内菌落生长状况应如表所示:
21
各实验组在培养皿内菌落生长状况及结果分析
18
3) 平板培养（有时需要稀释）
(1)取各样品培养液0.1ml，分别接种于 含 抗菌素 LB平 板 培养基 上 ， 涂 匀 （如果用玻璃棒涂抹，酒精灯烧过 后稍微凉一下再用，不要过烫）。
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(2) 菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿， 于37℃恒温培养箱内培养过夜(12-16小时)， 待菌落生长良好而又未互相重叠时停止培养， 对于可以蓝白斑筛选的质粒和菌株来说，此 时应该能清楚地看到蓝色和白色菌落。
列和头146个氨基酸的编码信息，编码-互补 肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型-半乳糖 苷酶实现基因内互补（ -互补）。当这种载 体转入可编码－半乳糖苷酶C端部分序列的 宿主细胞中时，在异丙基--D硫代半乳糖苷 （IPTG）的诱导下，宿主可同时合成这两种 肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但它们 可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所
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重组质粒克隆的鉴定
鉴定带有重组质粒克隆的方法常用的有互补、小规模制备质粒DNA进行酶切分析、 插入失活、PCR以及杂交筛选的方法。最 常用的方法是小规模制备质粒DNA进行酶 切分析，对于带有LacZ基因的载体还可以 结合-互补现象来筛选。
-互补现象：
因为有些载体都带有一个LacZ基因的调控序