大肠杆菌 感受态制备
(完整版)大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞的制备标签：tr..,Ca..,co..分类：细胞技术> 感受态细胞来源：实验管理实验概要大肠杆菌感受态细胞的CaCl2法制备及质粒转化实验原理处于对数生长期的细菌经CaCl2 处理后接受外源DNA的能力显著增加。
细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态，以摄取外源DNA。
转化（Transformation）是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体（R-,M-），它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法（如电击法，CaCl2 ，RbCl(KCl)等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞（Compenent cells）。
进入受体细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（Transformant，即带有异源DNA 分子的受体细胞）。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存（半年），因此CaCl2法使用更广泛。
主要试剂(1)0.1mol/L CaCl2溶液(2)LB液体培养基(3)30%甘油：30mL甘油溶于100mL蒸馏水，高压灭菌。
大肠感受态制备方法
大肠杆菌感受态细胞的制备
1.大肠杆菌涂LB平板，37℃过夜培养（16-18h）
2.挑取LB平板的单菌落于5 mL液体LB培养基中，37℃培养过夜（17h左右）
3.按10%接种量，5 mL 50 mL LB液体培养基，37℃培养1.5h~2h，OD600为
0.5~0.6
4.冰浴预冷培养物、无菌离心管、无菌0.1M氯化钙、0.1M氯化镁、含20%甘
油的0.1M氯化钙
5.把培养物到入无菌离心管，离心，4℃，3 min，4000 rpm
6.弃上清，加入10 mL 0.1M氯化镁，混匀。
7.放置冰上5 min
8.离心，4℃，3 min 4000 rpm
9.弃上清，加预冷的0.1M氯化钙4 mL，混匀
10.放于冰上至少15min
11.离心，4℃，3min 3000rpm
12.弃上清，加入2 mL 氯化钙(含20%的甘油)
13.分装，每管100 uLl，并立即放于冰上
14.冰上放置8-10 h后放于-80℃保存箱中。
试剂：
1. LB培养基：胰蛋白胨 1%、酵母提取物 0.5%、NaCl 1%
2. 0.1mol/L MgCl2
3. 0.1mol/L CaCl2.2H2O
4. 20%甘油的0.1mol/L CaCl2.6H2O。
大肠杆菌感受态的制备
五、本实验所需要掌握内容
掌握大肠杆菌感受态的制备及转化的原理 熟悉实验的具体操作步骤，掌握无菌操作技术。
8. 将上述混合物转移到预热到42℃的水浴锅中，热休 克90秒 (不要摇动试管)，然后将试管迅速转移到冰 浴，冷却1－2分钟。
9. 向管内加入800ul的LB培养液。然后37 ℃培养45分 钟。
10. 取适量体积的转化细胞转移到含有适当抗生素的 LB固体平板上，用灭过菌的玻璃棒涂布均匀。室温放 置几分钟
5. 4℃ 4500g离心5分钟收集细胞后，加2 ml ,100mM 的冰冷CaCl2溶液轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即 成感受态细胞悬液。
6.感受态细胞分装成200μl的小份,暂且不用的贮存 于-70℃可保存半年。 取其中一份进,轻度摇晃混合 后于冰上放置30分钟。
实验二、大肠杆菌感受态的制备
一、实验原理
目前，感受态细胞的制备常用冰预冷的CaCl2处理细菌的方法制 备，即用低渗CaCl2溶液在低温（0℃）时处理快速生长的细菌， 从而获得感受态细菌。此时细菌膨胀成球形，外源DNA分子在此 条件下易形成抗DNA酶的羟基－钙磷酸复合物粘附在细菌表面， 通过热激作用促进细胞对DNA的吸收。
试剂： 1.LB固体和液体培养基。 2.含特定抗生素的LB固体培养基。 3.100mM CaCl2溶液。 4.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2: 称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml 甘油,定容至100ml,高压灭菌。 5. 待转化质粒。
三、实验步骤
11. 倒置平板于37 ℃培养12－16个小时。
四、实验注意事项
为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素： 1. 细胞生长状态和密度: 细胞生长密度以刚进入对数生长期时 为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。 2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态 DNA(cccDNA)。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细 胞体积的5％。 3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR. 或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。 4. 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下 进行。
大肠杆菌培养感受态制备质粒转化及鉴定
大肠杆菌的培养1.LB培养基配制：（液体培养基）①取1L的烧杯，加入适量的一蒸水（＜1000ml），称取胰蛋白胨 10g , 酵母提取物 5g , Nacl10 g 倒入烧杯中②加入磁子搅拌，至完全溶解③用NaoH调PH=7.0，定容至1L④分装后高压蒸汽灭菌（固体培养基）①在液体培养基的基础上加入琼脂糖：1L液体培养基→15g琼脂糖（用水先溶解）②在电炉子上边加热边搅拌至煮沸溶解③分装后高压灭菌抗生素的加入温度要求：高压灭菌后，将融化的LB固体培养基置与55℃的水浴中，待培养基温度降到55℃时（手可触摸）加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。
注意事项：①电炉子温度不要太高，烧杯直接加热时电炉子上要加石棉网高压灭菌时，瓶盖上要插上针头，防止灭菌时瓶盖喷出2.倒平板：培养皿要提前进行灭菌、烘干，在超净工作台里，打开酒精灯，在酒精灯的火焰旁进行操作，倒完后做好标记3.接种（平板划线分离法）：接种环挑取大肠杆菌进行接种：图式：注意：每次划线前接种环都要灼烧灭菌，再冷却。
4.37°恒温培养箱培养：接种好的培养皿正置15分钟，然后倒置放入培养箱过夜培养倒置培养原因：恒温培养时，培养基中的水分会以水蒸汽的形式蒸发，倒置培养皿则会使水蒸汽凝结成水滴留在盖上。
如果正方，则水分形成的水滴会落入培养基表面并扩散开。
如果培养皿中已形成菌落，则会导致菌随水扩散，很难再分成单菌落，达不到分离目的。
大肠杆菌感受态的制备及转化感受态：细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
转化：是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。
一、制备：步骤从大肠杆菌DH5α的培养平板上挑取一个单菌落接于2mLLB液体培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。
↓以1%的接种量将以上过夜培养物接种于液体培养基中↓37℃振荡培养2～3h↓将菌液转移到50mL离心管中，冰上放置10min↓4000rpm，离心10min回收细胞↓倒出培养液，将管倒置1min以便培养液流尽↓用冰冷的0.1mol/L CaCl 2 10mL，悬浮沉淀↓立即放在冰上保温30min↓4℃，4000rpm，离心10min，回收细胞↓用冰冷的0.1mol/L CaCl 2 2mL悬浮细胞（务必放冰上）↓分装细胞，每200μl一份。
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将分装后的菌体放入 -80 ℃冰箱里冷冻约 20min （或者使用液氮快速冷冻细胞悬液）后 , 取 出待其融化。 5. 细胞破碎 融化之后破碎细胞 ,用超声波细胞粉碎机破碎 ,每次 10s, interval 20s, 20 次 .若量大可用压榨 机来破碎 .
6. 离心 离心细胞破碎液 ,12500rpm,1h,4 ℃ ,然后收集上清并转另一个 1.5ml 管 ,再加 100μl 1M Tris
所用的 CaCl2 等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配制，最好分装保存于 ⑶、防止杂菌和杂 DNA 的污染
4 ℃。
整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿， 如离心管， 移液枪头等最好是新的， 并经
高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、
DNA 酶或杂 DNA 所污染，
否则均会影响转化效率或杂 DNA 的转入。
(3)30% 甘油： 30mL 甘油溶于 100mL 蒸馏水，高压灭菌。 主要设备 (1) 超净工作台 (2) 冷冻离心机 (3) 恒温摇床 (4) － 70 ℃冰箱 (5)10mL 移液管 (6) 吸耳球 (7)1mL 、200 μＬ移液枪（配套枪头） (8)50mL 离心管 (9)1.5mL 离心管
大肠杆菌感受态细胞的制备
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实验管理实验概要
大肠杆菌感受态细胞的 CaCl2 法制备及质粒转化
实验原理 处于对数生长期的细菌经
CaCl2 处理后接受外源 DNA 的能力显著增加。细菌处于容易吸
收外源 DNA 的状态叫感受态。
在自然条件下， 很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，
OD600 控制。对
感受态大肠杆菌制备方法
感受态大肠杆菌制备方法四川大学生命科学学院试剂配制：A液：1M，MnCl2；mol/LB液：1M，HEPES，pH=6.2-6.8，用无菌水配，配后不需灭菌；C液：称取CaCl20.10g，KCl 1.18g，全部转入细口试剂瓶，然后加入46ml三蒸水（一级水），轻轻振荡使所有组分充分溶解。
将瓶塞盖上并用牛皮纸、棉线包扎，然后放入灭菌锅121℃高压灭菌备用。
TB缓冲液：方法步骤：1、溶液配制取1管B液（0.6ml），全部加入C液(46ml)中，混匀后，再用1ml移液器加入3.3ml A液，混匀冰浴即可使用。
2、划线得到单菌落37℃培养箱培养过夜（约17h），挑取2-4个形态饱满的单菌落接种于装有100ml SOB培养基的三角瓶,37℃剧烈振荡（300rpms）培养3-4小时,将培养温度调至18℃剧烈振荡（328rpms）培养，3、其余与普通感受态差不多，每管加入4ml TB缓冲液，轻轻振荡，使菌体重新悬浮，4、加入280ml DMSO（可用国产分析纯），混匀后分装入1.5ml EP管，冰上静置15分钟。
5、用纱布将所有装有感受态的EP管包好，用棉线系好后放入液氮中速冻，在液氮中静置12小时以上6、取出感受态放入-70℃超低温冰箱备用。
效率非常高，一般可到10×8，好时可到10×9，特别适宜于大片段与文库构建及珍贵材料的连接转化。
洁净是最重要的。
无菌都无所谓，在操作台上可正常操作。
离心力要注意不要超过2500g,建议1500-2000g5min。
涂板要注意，不要觉得不匀而多次反复，轻轻在平板上带一下感觉板上大部分地方走过即可，特别在冰箱中保存过或在温箱中温浴2小时以上的板。
涂完后建议空气晾干（20-30分钟）这样会减少卫星菌落出现。
预冷是必要的。
整个过程的低温也并非特别重要，只要注意就行了，我在去残液时经常在室温倒置1min，对感受态效率提高有帮助，第一次多加一点缓冲液，我经常加至20ml，效果不错。
大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于生物技术领域。
在生物技术中，大肠杆菌感受态细胞的制备是非常重要的一步。
感受态细胞是指细胞表面有特定的受体，能够感受到外界的信号，从而引发细胞内的反应。
下面将介绍大肠杆菌感受态细胞的制备方法。
1. 菌株的选择首先需要选择适合的大肠杆菌菌株。
常用的菌株有DH5α、BL21等。
这些菌株具有较高的转化效率和稳定性，适合用于感受态细胞的制备。
2. 受体的构建感受态细胞的制备需要构建受体。
受体是一种蛋白质，能够与外界的信号分子结合，从而引发细胞内的反应。
常用的受体有蛋白激酶、离子通道等。
构建受体需要进行基因克隆、表达、纯化等步骤。
3. 质粒的构建构建受体需要使用质粒。
质粒是一种环状DNA分子，能够在细胞内自主复制。
常用的质粒有pET、pGEX等。
构建质粒需要进行基因克隆、转化、筛选等步骤。
4. 细胞的转化将构建好的质粒转化到大肠杆菌中。
转化是指将外源DNA导入到细胞内，使其表达外源蛋白。
转化需要进行化学转化、电转化等步骤。
5. 细胞的培养转化后的细胞需要进行培养。
培养条件包括温度、氧气、营养物质等。
培养时间需要根据不同的实验目的进行调整。
6. 受体的表达和纯化经过培养后，细胞内的受体会被表达出来。
为了得到纯净的受体，需要进行蛋白质纯化。
常用的纯化方法有亲和层析、离子交换层析等。
7. 受体的功能验证得到纯净的受体后，需要进行功能验证。
功能验证是指验证受体是否能够与外界的信号分子结合，并引发细胞内的反应。
常用的功能验证方法有荧光共振能量转移（FRET）、酶联免疫吸附实验（ELISA）等。
大肠杆菌感受态细胞的制备需要进行菌株的选择、受体的构建、质粒的构建、细胞的转化、细胞的培养、受体的表达和纯化、受体的功能验证等步骤。
这些步骤需要严格控制，才能得到高质量的感受态细胞。
感受态大肠杆菌制备方法.
感受态大肠杆菌制备方法A液：1M，MnCl2：B液：1M，HEPES，pH=6.2-6.8，用无菌水配，配后不需灭菌；C液称取CaCl2 0.10g，KCl 1.18g，全部转入细口试剂瓶，然后加入46ml三蒸水，轻轻振荡使所有组分充分溶解。
将瓶塞盖上并用牛皮纸、棉线包扎，然后放入灭菌锅121℃高压灭菌备用。
取1管B液（0.6ml），全部加入C液(46ml)中，混匀后，再用1ml移液器加入3.3ml A液，混匀冰浴即可使用。
划线得到单菌落,37℃培养箱培养约17小时，挑取2-4个形态饱满的单菌落接种于装有100ml SOB 培养基的三角瓶,37℃剧烈振荡（300 rpms）培养3-4小时, 将培养温度调至18℃剧烈振荡（3280 rpms）培养，其余与普通感受态差不多，每管加入4ml TB缓冲液，轻轻振荡，使菌体重新悬浮，加入280ml DMSO（可用国产分析纯），混匀后分装入1.5ml EP管，冰上静置15分钟。
用纱布将所有装有感受态的EP管包好，用棉线系好后放入液氮中速冻，在液氮中静置12小时以上。
取出感受态放入-70℃超低温冰箱备用。
效率非常高，一般可到10*8，好时可到10*9，特别适宜于大片段与文库构建及珍贵材料的连接转化。
洁净是最重要的。
无菌都无所谓，在操作台上可正常操作。
离心力要注意不要超过2500g,建议1500-2000g 5min。
涂板要注意，不要觉得不匀而多次反复，轻轻在平板上带一下感觉板上大部分地方走过即可，特别在冰箱中保存过或在温箱中温浴2小时以上的板。
涂完后建议空气晾干（20-30分钟）这样会减少卫星菌落出现。
预冷是必要的。
整个过程的低温也并非特别重要，只要注意就行了，我在去残液时经常在室温倒置1min，对感受态效率提高有帮助，第一次多加一点缓冲液，我经常加至20ml，效果不错。
关于大肠杆菌的感受态制备及转化的方法很多，最复杂的莫过于电转化，而最简单的则是将LB平板上的菌落直接挑入装有缓冲液的EP 管冰箱即开始转化。
大肠杆菌感受态制备
摇床
用于大肠杆菌的振 荡培养。
恒温振荡器
用于大肠杆菌的恒 温振荡培养。
03 实验步骤
细菌培养
01
02
03
培养基选择
选择适合大肠杆菌生长的 培养基，如LB培养基，以 保证细菌正常生长。
培养温度
将细菌培养在37℃恒温摇 床中，振荡培养至对数生 长期。
细菌密度
通过观察细菌的生长情况， 控制细菌密度，通常在 OD600值为0.6-0.8时进 行后续操作。
参考文献2
02
03
参考文献3
大肠杆菌感受态制备技术进展， 作者：XXX，出版日期：XXXX 年X月，出版社：XXX出版社。
大肠杆菌感受态制备实验指南， 作者：XXX，出版日期：XXXX 年X月，出版社：XXX出版社。
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实验原理
感受态
感受态是指细菌处于一种生理状态，能够接受外源DNA并与之结合， 进而发生转化。
转化过程
外源DNA通过细菌的细胞膜进入细胞内，并在DNA结合蛋白的作 用下与细菌染色体上的同源序列发生交换，从而实现基因的克隆和 表达。
影响因素
影响感受态形成的因素包括细菌生长状态、培养基成分、温度、渗透 压等。
转化子的筛选和验证
筛选方法
转化子可以通过抗生素筛选、蓝白斑筛选等方法进行 筛选。
验证方法
验证转化子是否含有目的基因，可以通过PCR、酶切、 测序等方法进行。
注意事项
在筛选和验证过程中，需要注意避免假阳性或假阴性 的结果，确保实验结果的准确性。
优化实验条件
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温度
感受态细胞的转化需要在一定的温度下进行，不 同的温度可能会影响转化效率，因此需要选择适 宜的温度进行实验。
大肠杆菌感受态制备及测序
回收扩增产物连接到pMD19-T vector 转化大肠杆菌感受态，筛选阳性克隆子测序：1.配置含蛋白胨1%，酵母膏0.5%，氯化钠1%，pH7.0的LB液体和LB固体（另加琼脂粉至1.5%）培养基各100ml。
2.培养基和培养皿灭菌，液体LB于4℃备用，固体LB待冷至60℃时倒板，平板倒置于4℃备用。
3.从-80℃贮存的大肠杆菌单克隆菌液中吸取10ul 接种于三角瓶内的10ml LB液体培养基。
4.37℃，225rpm，培养6h以上至OD600 =0.5左右。
5.吸取100ul菌液接种于一个三角瓶中新鲜的10mlLB液体培养基上。
6.37℃，250rpm，培养约2.5-4h至OD600 = 0.5左右。
7.将菌液转入1个15ml无菌离心管中，冰水浴10min。
8.5000rpm,4℃离心6min。
9.弃上清，用4ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2轻轻重悬菌液至均匀。
10.冰水浴30min。
11.5000rpm,4℃离心6min。
12.弃上清，用0.5-1ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2轻轻重悬菌液至均匀。
13.用无菌1.5ml离心管分成每管100ul的小份，冰水浴保存2-7h后用于转化，4d内有效。
14.也可加无菌甘油至终浓度12.5%左右-80℃长期保存备用。
大肠杆菌感受态转化目的片段与载体连接产物：1.如果是冰冻保存的感受态，则于冰水浴中至刚解冻备用，如果是冰水浴保存，则直接备用。
2.将连接产物轻轻均匀地加入1管DH5a感受态中，轻轻混匀。
3.冰水浴30min。
4.42℃热激60sec。
5.迅速冰水浴2min.6.沿壁轻轻加入900ul室温LB液体培养基。
7.37℃，180rpm复苏培养90min,同时在37℃倒置预热一个LB平板。
8.先在平板上涂布20ul抗生素（Amp）与80ul LB的混合物至完全吸入。
9.复苏结束后，吸取100ul菌液用灭菌冷却后的涂布棒均匀涂布于平板上，10.37℃倒置培养18-24h至长出大小合适的菌落。
大肠杆菌感受态的制备
大肠杆菌感受态的制备原理: 热激法是利用冰冷的CaCl2处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受态”，易于摄取外源DNA。
转化效率为106 ～107转化子/μg DNA。
材料：Top10、pcDNA3.0, TB buffer（现用现配）、超纯水、碎冰。
LB液体培养基200 ml（不含AMP）、LB固体培养基（含AMP）、LB固体培养基（不含AMP）10ml圆底离心管（玻璃或塑料）、100ml锥形瓶、2.0 ml离心管、各型号枪头, 刻度移液管均需灭菌处理甘油：100ml (高压灭菌)氨苄（母液100mg/ml，终浓度为100ug/ml）： 1ml母液需氨苄100mg 过滤除菌。
仪器：滤器、0.22um微孔滤膜、刻度吸量管、恒温摇床、恒温培养箱, 分光光度计、比色杯、低温离心机、制冰机、超净工作台, 移液器。
步骤：1）从冻存的E.coli .Top 10, 划线接种至LB固体培养基（不含AMP）. 37℃培养O/N, 16h左右。
2) 从新活化的E.coli .Top 10菌平板上挑取一单菌落，接种与2ml LB液体培养基（10ml圆底离心管）中，37℃振荡培养O/N, 16h左右。
备注: E.coli . Top 10, 20%无菌甘油, －70℃保存。
3)将该菌悬液以(400UL)1:100～1:50转接于20 ml LB液体培养基中，37℃振荡扩大培养，当培养液明显混浊后，2.5~3小时后测一次OD(600nm)，至OD600nm≤0.6时停止培养.摇菌期间, 配TB buffer，开制冰机。
TB buffer置于冰上预冷(20~30分钟). 低温离心机预冷(20~30分钟)以下步骤需在超净工作台和冰上操作；4）细菌置于冰上,10min。
5）取12管, 1.5 ml细菌培养液3000 g 4℃离心5min,弃上清。
6) 每管加200 ul 预冷的LB，轻轻混匀, 均成2管, 置冰上20~30分钟，3000 g 4℃离心5min,弃上清。
2 大肠杆菌超级感受态制备.
2014-5-7感受态细胞的制备1.取-80℃冻存的大肠杆菌菌株接种于100ml SOC培养基中，18℃过夜培养，直到OD600=0.6。
2.将培养物转移到50ml离心管中，冰浴15 min；4℃ 5,000rpm/min离心10min。
3.弃上清，将离心管倒置于滤纸上，使培养液被吸干。
4.取1ml刚配的TB溶液打散菌体沉淀，再加入1/3体积的起始培养液的TB，冰浴10-15min，4℃ 5,000rpm/min离心10min。
5.弃上清，沉淀重悬于4ml TB，冰浴10min。
6.加入280μl DMSO，缓缓滴入并轻轻摇晃，使其充分混合均匀。
7.将菌液分装于1.5mL EP管中，每管50uL，液氮速冻，-80℃长期保存。
SOB的配制：蛋白胨20g酵母提取物5gNaCl 0.58gKCl 0.186g100×Mg++溶液10ml溶解并加水定容至1L，121℃×20min高压蒸汽灭菌100×Mg++溶液：MgCl2﹒6H2OMgSO4﹒7H2O溶解并加水定容至100ml，121℃×20min高压蒸汽灭菌100mL SOB+1M gluocse 1mL，配制成SOCTB溶液的配制：1M KCl 5ml0.55M MnCl2 2ml0.5M CaCl2 0.6ml0.1M K-Pipes(pH 6.7) 2mlddH2O 10.4mlTotal 20ml上述溶液混匀后过滤除菌，现配先用。
0.1M K-Pipes(pH=6.7)的配制：称取3.02g Pipes粉末溶于80ml dd H2O中，此时粉末不能完全溶解，用10N KOH或KOH固体调节PH值，只有当PH接近6.7时粉末才能完全溶解，此时当小心少量地加入KOH直至达到所需PH值Chilton et al., PNAS 1974。
大肠杆菌感受态制备及转化
影响转化率的因素
► 细胞生长状态和密度。
DNA 的质量和浓度。 ► 试剂的质量。 ► 防止杂菌和其它外源 DNA 的污染。
► 转化的质粒
实验0.1mol/LCaCl2溶液（预冷） 氨苄青霉素 pUC18质粒
实验步骤
菌株活化 感受态细胞制备 外源DNA的转化
CaCl2法转化感受态原理
► 在0°下外源DNA（质粒）可吸附到感受态细
胞表面，短时间的热刺激（42°C，90S）， 诱导细胞吸收DNA。转化了质粒DNA的大肠 杆菌随后在培养基中37°C培养1小时，可使 质粒编码的抗生素抗性基因得到表达，因此， 转化了质粒的大肠杆菌细胞可在含有相应抗 生素的培养基上涂布生长。而没有转化的细 胞则无法生长。
对照组
以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操 作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素 的LB平板上应没有菌落出现。
实验步骤
转化
11. 取10μlDNA加入大肠杆菌感受态细胞中，于冰
上放置30min 12. 于42℃水浴90S（12步为转化关键，动作要轻 柔） 13. 冰上放置2min 14. 加入800μl LB液体培养基于37培养1小时 15. 取 200μl 培养液均匀涂布在含 Amp+ 的培养基 平板上 16. 将平板放置于 37℃恒温培养箱中培养 12-14个 小时，然后观察结果。
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将培养液转入 1.5ml离心管中，在冰上放置 15－30min 4000rpm离心5min,弃上清 加入0.2ml预冷的0.1mol/l MgCl2-CaCl2,悬浮 沉淀,冰浴10min。 4000rpm离心5 min,弃上清 加入0.8ml预冷的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀
大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法
大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法感受态细胞(Competent cells) ：常态的细胞不能摄入外部溶液中的DNA，所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。
受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA 的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。
转化：是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。
进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。
α-互补现象：因为许多载体都带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码α-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补（α-互补）。
当这种载体转入可编码?－半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。
所以称这种现象为α-互补现象。
由互补产生的α-半乳糖苷酶(LacZ)能够作用于生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源DNA片段时，会造成LacZ(α)基因的失活，破坏α-互补作用，就不能产生具有活性的酶。
所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。
方法一：TSS方法制备感受态细菌（又称一步法）一、准备工作1、缓冲液1×TSS的配制事先配制1M的氯化镁：20.3g氯化镁(6分子水结晶)，定容于100ml去离子水后封装，不用灭菌。
取干净的100ml 量筒和100ml 烧杯，用量筒量取100ml去离子水，加入至烧杯中，取1 g 蛋白胨，0.5g 酵母抽提物，0.5g 氯化钠，10 g PEG(MW= 3350)，5ml DMSO，5ml 的1 M氯化镁，溶解后用盐酸或者氢氧化钠调整pH为6.5，混匀后用0.22um 滤器过滤除菌。
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大肠杆菌感受态制备
1、挑取大肠杆菌到装有5ml LB的15ml培养管中37℃过夜培养，与第二天转移到含500ml
（1：100）的LB液体培养基的锥形瓶中，于37℃培养200到300rpm 培养2到3小时。
每20 min测量一次OD值（大肠杆菌20min一代），当OD达到0.4~0.6时收细菌。
2、0.1M CaCl2 及甘油已经预先放置在4℃冰箱中,1.5mlEP管3盒和3块板子放入-20或-80℃冰箱中预冷
3、取50ml离心管放置
4、将500ml 培养过的LB培养基分装至上述离心管中,在冰上预冷至少15min。
5、4000rpm，4℃，20min，去上清
6、每管5ml CaCl2 悬浮，然后两管合为1管，然后每管在加20mlCaCl2
7、放冰上30~40min，
8、4000rpm，4℃，20min，去上清
9、每管4ml CaCl2 悬浮
10、加入1ml甘油，混匀（即保存细菌的甘油终浓度在10~30，我做的使其终浓度的为20%）
11、分装150ul一EP管。