绿色荧光蛋白基因转染人骨髓间充质干细胞体外成脂肪诱导分化的研究

Ｔｈｅ ＥＧＦＰ ｉｓ ａ ｒｅｌｉａｂｌｅ仃ａｃｅｒ ｆｏｒ咖ｄ）ｒ ｉｎ｝ｌＭｓＣ ｍｕｈｉｄｉｆｆｅｉ℃ｔ，．ｉａｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．
ＪＬａｂ脚ｌ，２００９，１３：１０１９） Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ；ｈｍｎｍｌ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ （Ｃｈ／ｎ
文献标识码：Ａ ｂｏｎｅ ｎ瑚盯ｒ啷ｍｅｓｍＳａｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｅｅｉｌｓ
ＥＧＦＰ
ＣＨＥＮ五勘鼢，
Ａｂ醴眦ｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅ＂ｎｎａｔｉｏｎ ａｄｉｐｏｃｙｔｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍａｎｏｗ ｌｎｅ８一
ｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ（ｈＭｓＣ）ｗｉｔｈ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｃ０曲ｌｉｌｌｉｌｌｇ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＧＦＰ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ ｖｉｔｒｏ麟－
ｐａｎｄｅｄ ｈＭＳＣ ｔｒａｎｓｆｅｃ：ｔｅｄ ｗｉｔｈ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｔｏｒ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＥＧＦＰ，＆ｔｅｃｔｅｄ ｉｔｓ眦面ｃｅ ｍａｒｋｅｒ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｄｉｐｏｃｙｔｅ．
倒置显微镜下观察，ＥＧＦＰ－ＲＶ转染ｈＭＳＣ，经嘌 呤霉素筛选后仍生长迅速，６—７ ｄ即可融合，长梭形 细胞，紧密排列成辐射状，ｈＭＳＣ／ＥＧＦＰ细胞与未转 基因的ｈＭＳＣ在细胞形态及生长特点上无差异（图 ３、４）。
图１转染ＥＧＦＰ的ｈＭＳＣ（荧光显微镜２００Ｘ）
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。
图２ ＥＧＦＦ在ｈＭＳＣ中的表达
ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ．副Ⅲ触ｎⅡⅡｋｅｒ Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅｒｅ，ｗｅｒｅ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ
ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｈＭＳ＆ＥＧＦＰ ａｎｄ ｎｏｎ－ｔｒａｍｆｅｅｔｅｄ ｃｅｌｌｓ．ａｎｄ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｐｏｔｅｒ吐ｉａｌ ｔＯ ａｄｉｐｏｃｙｔｅ．Ｃｃ＿曲吲伽 Ｎｏ ｉｎｆｌｕｅｎｅａ ｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｍｉａｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｏ ａｄｉｐｏｅｙｔｅ ｏｆ ｈ碰＇３Ｃ ｃ０曲ＩｉＩｌｉＩｌｇ ＥＣＦＰ，
图３未转染的ｈＭＳＣ（普通倒置显微镜１００Ｘ）
图４ ｈＭＳＣ／ＥＢＦＰ（荧光倒置显微镜１００ ｘ）
２．３ ｈＭＳＣ／ＥＧＦＰ表面标志
转ＥＧＦＰ基因的ｈＭＳＣ／ＥＧＦＰ细胞仍高表达
ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤｌ０５抗原（图５），细胞均一性达（９８±
１．９８）％，与正常未转基因的同代的ｈＭＳＣ无差异（Ｐ
‘＞０．０５）。
合；加入含２∥ＩＩｌｌ嘌呤霉素（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）的ＭＳＣ培
养液筛选３ ｄ；加入ＭＳＣ培养液，扩增筛选后的ｈＭ． ＳＣ／ＥＧＦＰ，流式细胞仪检测阳性细胞百分比。 １．２．４ ｈＭＳＣ／ＥＧＦＰ的形态学观察倒置显微镜下 观察嘌呤霉素筛选获得的抗性克隆ｈＭＳＣ／ＥＧＦＰ的 形态及生长特点，比较ｈＭＳＣ／ＥＧＦＰ和ｈＭＳＣ两者有 无差异。 １．２．５ ＩｌＭＳＣ／ＥＧＦＰ表面标志 取生长良好的ｈＭ． ＳＣ／ＥＧＦＰ，分别加入ＰＥ标志的鼠抗人ＣＤ４４、ＣＤ２９、 ＣＤｌ０５单克隆抗体，室温孵育３０ ｍｉｎ，ＦＡＣＳ检测 ＭＳＣ表面抗原表达。 １．２．６ ｈＭＳＣ／ＥＧＦＰ成脂肪细胞诱导培养取生长 良好的ｈＭＳＣ／ＥＧＦＰ，以ｌ×Ｉ（Ｐ／孑Ｌ的密度接种于６ 孔板中（内含经多聚赖氨酸预处理的小玻片），实验 组和对照组各３复孔，待细胞生长融合达８０％一 ９０％后更换培养液，实验组加成脂肪细胞诱导培养 基，对照组加ＭＳＣ培养基，每３—４天换液，２周后取 出细胞爬片荧光显微镜下观察细胞形态，照相，进行 油红染色鉴定。 １．３统计学分析
万方数据
一１０２０—
Ｐｅｒｃｏｌｌ液分离单个核细胞（ＭＮｃ），贴壁法培养细胞， 当细胞生长融合达７０％一８０％时，用０．２５％胰蛋白 酶一０．０２％ＥＤＴＡ消化细胞，以１：３密度传代培养。 １．２．３人骨髓间充质干细胞的转染取生长融合 达卯％一７０％的ｈＭＳＣ，以ＰＢＳ洗涤１次，加入上述 收集备用的病毒液约４—５ ｍｌ／２５ ｃｍ２培养，同时加 入鱼精蛋白（终浓度为８ ｍｇ／Ｌ）；２４ ｈ后重复转染１ 次；转染后换用ＭＳＣ培养液培养至细胞达到完全融
转染ＥＧＦＰ基因对ｈＭＳＣ在体外成脂肪诱导能力无明显影响，ＥＧＦ可以作为研究ｈＭＳＣ多向分化潜能机制的一个有
效示踪工具。
关键词：绿色荧光蛋白；人骨髓间充质于细胞；诱导分化
中图分类号：Ｑ７８
ｈｍ ｅｏｎｔ蛐ｇ Ｓｔｍｌｙ Ｏｎ ｈ妇·ｏｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｄｉｐｏｅｙｔｅ ｏｆ
Ｈｏｓｐｉｔａｌ，．，溉‰毋，儡佣咖１３００２１，‰） ＳＯＮＧ ｙ瓣ｇｉｌ‘，１２ Ｗｅｉ，ｅｔ ａ１．（Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｆｉｒｓｔ
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肪分化潜能造成影响，证实了通过导入目的基因，并
与ｈＭＳＣ的多向分化潜能相结合，可将细胞治疗与
基因治疗结合起来，必将为ｈＭＳＣ的临床应用开辟
广阔的前景。
参考文献：
［１］Ｉ丑‰ＶＦ，ｓｃｈ哪嬲ｌｂ哪声Ｐ。Ｍｉｌｌｅｒ Ａ，ｅｔ ａ１．ＭｌＩ咖ｓｔｅｍ∞１１８，嘲·
ａ∞恻ｐｒｑｇｅｌｌｉｔｏｒ ｐｑ哪［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ，ａｎｄ ｓｔｒｏｍａｌ
诱导分化结果显示：ｈＭＳＣ／ＥＧＦＰ成脂诱导后形态发
生变化，胞浆内出现圆形空泡，并逐渐融合，油红染
色证实为脂滴形成，荧光显微镜下观察到成脂分化
的ｈＭＳＣ仍然有ＧＦＰ强阳性表达。本实验证实研究
中所建立的ｂＭＳＣ／ＥＧＦＰ在体外传代培养和成脂肪
诱导分化时ＧＦＰ的表达未受任何影响，始终呈强阳
性表达；ＧＦＰ的稳定表达也未对ｈＭＳＣ／ＥＧＦＰ的成脂
［４］Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ ＭＦ，Ｍａｃｋａｙ ＡＭ，Ｂｅｃｋ ＳＣ，ｅｔ ａ１．Ｍｕｌｆｉｌｉｎｅａｇｅ ｐｌ，ｔｌ玎ｌｔｉ丑Ｉ ｏｆ ａｄｕｌｔ ｈｕｍａｎ ｍ∞ｎ曲ｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｅｅｌｌｓＥＪ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，２８４：１４３．
·
２．４ ｈＭＳＣ／ＥＧＦＰ成脂肪诱导分化
转ＥＧＦＰ基因的ｈＭＳＣ／ＥＧＦＰ细胞，传代培养后 仍可诱导形成脂肪细胞（图６），表明转ＥＧＦＰ基因后
不影响ｈＭＳＣ的多向分化能力。
万方数据
·－－——１０２１·－－——
图５ ｈＭＳＣ／ＦｃＧＦＰ表面标记检测结果
荧光Байду номын сангаас微镜（２００×）
普通光学显微镜（２００×）
生垦塞堕途堑堂垫螋生§旦筮１３鲞复§塑 文章编号：１００７—４２８７（２００９）０６—１０１９—０３
·－－——１０１９—－———
绿色荧光蛋白基因转染人骨髓间充质干细胞 体外成脂肪诱导分化的研究
陈晓，宋艳秋，李薇，朱晶，王冠军
（吉林大学第一医院肿瘤中心，吉林长春１３００２１）
摘要：目的 以逆病毒为载体将绿色荧光蛋白基因（ＥＧＦＰ）转染人骨髓问充质干细胞（ｈＭＳＣ），研究对其成脂肪诱
，人骨髓间充质＿千细胞（ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍａｎ＇ｏｗ ＩＩ瞄． ｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ｈＭＳＣ）因具有多向分化潜能而受 到广大学者的关注【ｌ Ｊ，但其机制仍不明了，因此寻找 合适的标记分子作为ｈＭＳＣ细胞谱系追踪观察的标 志成为其体内、外诱导分化机制研究中的一项重要 课题【２｜ｏ ＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｌ＇ｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）是 一种用于检测细胞基因表达和蛋白定位的报告分 子，作为标记时可以进行活细胞的实时定位观察，本 研究以逆病毒为载体将绿色荧光蛋白基因转染入骨 髓间充质干细胞，研究对其成脂肪诱导分化的影响， 为研究ｈＭＳＣ分化机制提供实验基础。 １材料与方法 １．１材料与试剂 １．１．１细胞ＰＧｌ３／ＥＧＦＰ细胞：逆病毒（Ｒｖ）载体
异源细胞中稳定表达，ＧＦＰ的这一种属不依赖的特
性使其成为能被广泛运用的荧光标记分子。
本实验首先应用逆转录病毒载体将ＥＧＦＰ基因
转染入ｈＭＳＣ，通过细胞形态和流式细胞仪检测证实
转ＥＧＦＰ基因细胞株ｈＭＳＣ／ＥＧＦＰ可以长期、稳定、
高效表达ＥＧＦＰ；ｈＭＳＣ／ＥＧＦＰ细胞仍高表达ＣＤ２９、
ＣＤ４４、ＣＤｌ０５抗原，对ｈＭＳＣ／ＥＧＦＰ细胞进行成脂肪
绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）最初是从多管水母中发现 的一种蛋白质。当水母发光蛋白结合Ｃａ２＋后发出 蓝色荧光，该蓝光进一步激发ＧＦＰ产生绿色荧 光【５］５。ＧＦＰ激发后发出的荧光持续时间较长，且不 需要任何其他辅助因子的作用，且分子量小，蛋白性 质极为稳定，转染细胞后，不影响目的基因的表达及 目的蛋白的结构和功能，对细胞无毒性作用，能够在
ｐＲＥＴ６．ＥＧＦＰ－Ｐｕｒｏ导人小鼠成纤维细胞胸苷激酶缺 陷的ＮＩＩ－ＢＴ３．ＴＫ－来源的逆病毒包装细胞系ＰＧｌ３ 后，克隆筛选获得了稳定表达ＥＧＦＰ．ＲＶ的包装细胞 系ＰＧｌ３／ＥＧＦＰ。
１．１．２骨髓标本来源于吉林大学第一医院血液 科骨髓检查正常的健康志愿者，骨髓取自髂后上棘， 平均采集量５ ｌＩｌｌ，肝素抗凝。 １．１．３ 主要试剂 聚凝胺（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）、嘌呤霉素 （ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）、鱼精蛋白、ＤＭＥＭ．ＨＧ培养基、ＰＥ—ＣＤ４４、 ＰＥ．ＣＤ２９、ＰＥ—ＣＤｌ０５。成脂肪细胞诱导培养基：１０％ ＦＢＳ／ＤＭＥＭ—ＬＧ培养液内含４ ｍＭ Ｌ－谷氨酰胺、１０ ｍｇ／ｎａ牛胰岛素、０．２５ ｍＭ地塞米松、０．５ ｍＭ ＩＢＸＭ、 ５０ ｍＭ吲哚美辛。 １．２方法 １．２．１ 重组ＥＧＦＰ－ＲＶ液的制备 复苏ＰＧｌ３／ＥＧＦＰ 细胞，以含１５％胎牛血清的ＤＭＥＭ—ＨＧ培养液培养 传代，当细胞生长融合达８０％一９０％时，换液；２４ ｈ 后收集含重组ＥＧＦＰ－ＲＶ的上清，以０．４５ ｔａｎ无菌滤 膜过滤去除细胞碎片。滤过的病毒液封装入无菌瓶 中，４ ｈ内应用。 １．２．２人骨髓间充质干细胞的分离、培养和扩增 志愿者骨髓取自髂岳上棘，用相对密度１．０７３ ｇ／Ｌ的