7下 _第七章

菌悬液涂布在完全培养基上， 置于许可温度下培养
影印到一个完全培养基和两个基 本培养基平板上
取基本培养基一皿为一组，置于许可温度下培养；
另取完全培养基和基本培养基各一皿，置于非许可温度下培养
根据菌落生长情况，可分两大类：
1）非必需基因突变形成的温度敏感突变株
在许可温度下的基本培养基上生长，非许可温度的 基本培养基上不生长而在完全培养基上生长。是一类 突变引起失去单一酶但可以补偿功能的TS突变株。 2）必需基因突变引起TS突变株 在许可温度的基本培养基上生长，而非许可温度的 基本培养基和完全培养基上都不生长； 在许可与非许可温度下基本培养基和完全培养基上全 部生长，则为野生型菌株。
原生质体再生
◆ 再生是原生质体育种的一个十分关键的问题 ◆ 不同微生物，即使是非常近似的种，所要求 的再生的最适条件往往不同
如何求原生质体形成率和再生率？
1）将用酶处理前的菌体经无菌水(或高渗溶液)系列稀 释，涂布在完全培养基平板上培养，计出原菌数，该数 值为 A 。 2）将用酶处理后得到的原生质体分别经如下两个过程处 理。 a) 用无菌水适当稀释，在完全培养基上培养计数。由 于原生质体在低渗透压下会破裂失活，所以长出的菌落 数为未形成原生质体的原菌数，该数值为 B 。 b) 用高渗透压液适当稀释，在再生培养基平板上培养计 数，生长出的菌落数为原生质体再生的菌数和未形成原
杂 交 系 分 析 法
三） 原生质体融合育种
原生质体融合（protoplast fusion） ：
就是把两个亲本的细胞壁分别通过酶解作用加 以瓦解，在高渗环境中释放出只有原生质体膜 包裹着得原生质体球状体。
在高渗条件下由聚乙二醇作为助融剂，使之接 触、穿透并融合，实现基因重组。
简便、有效、重复性强、适应性广
三） 原生质体融合育种 一般步骤
原生质体融合的基本过程
五大步骤：
1. 直接亲本及其遗传标记选择 2. 双亲本原生质体制备与再生 3. 亲本原生质体诱导融合 4. 融合重组体（融合子）分离 5. 遗传特性分析与测定
经纯化的亲株1
经纯化的亲株2
具有遗传标记的亲株1
菌体培养
具有遗传标记的亲株2
菌体培养 酶解细胞壁
生质体的原菌数之和，该数值为 C 。
B
C
A
原生质体形成率
A B 100 % A
原生质体再生率
CB 100 % A B
３、亲本原生质体融合（和再生）
◆ 促融剂（诱导融合） 常用 聚乙二醇 (polyethyleneglycol; PEG) 4000 和 6000 ◇ PEG可使原生质体的膜电位下降，然后原生质体通 过Ca2+交换而促进凝集 ◇ PEG渗透压的脱水作用，扰乱了分散在原生质体膜 表面的蛋白质和脂质的排列，提高了脂质胶粒的流动 性，从而促进了原生质体的相互融合。
方法：将混合培养的孢子稀释液分离到基本培养基平 板上，培养10-15d，出现较大的菌落，这些菌落除了回 复突变和互养杂合系菌株之外几乎都属原养型重组体。
原养型重组体往往具有两亲本的优良性状。
杂合系分析：
取混合培养孢子悬浮液分离到基本培养基平板上， 适温培养3-5d，形成大小不同的菌落，其中较大的是一 些原养型菌落，较小的是一些杂合系菌落。 杂合系所产生的孢子，重新分离到产生它们的基本培 养基上时，容易发生遗传分离，几乎都成了两亲本分离 子，重组体较少，也几乎没有杂合系菌落生长。
三） 原生质体融合育种
优点
1 、大幅度提高亲本之间重组频率，可发生多次交换。
原生质体剥离了细胞壁，去除了细胞间物质交换的主 要障碍，也避免了修复系统的制约；再加上促融剂的 如天蓝色链霉菌的种内重组频率可达20% 2、扩大重组的亲本范围。 诱导作用，重组频率显著提高。 去除了细胞壁的障碍，亲株基因组直接融合、交换， 3、原生质体融合时亲本整套染色体参与交换，遗传物 实现重组，不需要有已知的遗传系统。 质转移和重组性状较多，集中双亲优良性状机会更大。 4、可以和其它育种方法相结合，把由其他方法得到的优 良形状通过原生质体融合再组合到一个单株中。
例如 可在培养基中加入抑制诱导酶合成的物质，使组 成型菌株处于选择优势 以-半乳糖苷酶为例： 含有乳糖的培养基中加入抑制物邻硝基--D-岩藻糖苷
-半乳糖苷酶的合成被抑制，因此诱导型菌株不能 利用乳糖，故不能生长
而组成型菌株能合成该酶，利用乳糖生长，使组成 型菌株被富集
◆ 通过显色反应可在平板上识别组成型菌株 ◆ 在不含诱导物，但含有经酶解后能呈现 颜色变化的底物的平板上进行培养，可方便 快速地检出组成型菌株 如 用邻硝基苯乳糖苷作为底物筛选半乳糖苷酶组成型突变株
杂交育种使用的配对菌株称为配子。
①配子应带有遗传标记 如 营养、颜色、形态、抗性、产量、酶活力等。 营养缺陷型是最常用的遗传标记之一。 营养缺陷型菌株 多是经过诱变剂处理后产生的一种生化突变株； 特征为：失去合成某种有机物质的能力，在基本 培养基中不能生长，需要补加所“缺陷”的该种 有 机物质后才能生长。
３、亲本原生质体融合（和再生）
◆ 电融合法 作用原理是基于电解和双向电泳 ◇ 原生质体在电场作用下进行电泳的同时，
膜被击穿形成微孔
◇相邻原生质体可通过微孔发生融合 微孔的形成是可逆的
4、融合体的复制和再生
二） 放线菌杂交育种
重组过程可能出现的现象：
2、接合现象
菌丝间接触融合后，相同细胞质里不同基因型的 细胞核在双方增殖过程中，发生部分染色体的转 移或遗传信息的交换称为接合现象。
其结果是导致部分合子的形成
1）受体的部分染色体与供体的完全染色体结合 2）两个亲本的染色体都不完整
原核生物只有一条环形染色体
影印培养法检出营养缺陷型
夹层培养法检出营养缺陷型
点植法检出营养缺陷型
2、抗性突变株的筛选
◆ 育种标记 抗生素
金属离子
温度 噬菌体 ◆ 提高某代谢产物的产量 如 抗氯霉素的解烃棒杆菌突变株比亲株产生的棒杆 又如，蜡状芽孢杆菌的抗利福平无芽孢突变株的-淀 菌素高3倍。（氯霉素是棒杆菌素的结构类似物） 粉酶产量提高了7倍。
③单孢子悬液的制备： 混合接种的斜面培养后长出一层孢子，待孢子成熟后， 制备单孢子悬液； 洗去可能携带的完全培养基成分；
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浓度要求：10 —10 /ml
④重组体检出： （原养型重组体检出）
原养型重组体是两亲本各带遗传标记的染色体片断 重组在一起，由于营养互补作用，对营养要求表现了两 个原始亲本的表型，但从基因型而言，是新的基因型重 建。
２、原生质体的制备与再生
多用酶解法
细菌、放线菌 溶菌酶
酵母菌
霉菌
百度文库蜗牛酶
纤维素酶等
影响原生质体制备的因素：
1）菌体的预处理 2）菌体的培养时间
3）酶浓度
4）酶解温度 5）酶解时间 6）渗透压稳定剂 必须在高渗或等渗溶液中 对不同菌种，应采用不同的稳定剂 细菌、放线菌 酵母 霉菌 一般采用蔗糖、丁二酸钠 采用山梨醇、甘露醇 采用KCl和NaCl
显现突变型性状的温度
注：TS突变株 在许可温度下能正常生长，其表型和野生型没 有区别；在非许可温度下不能生长或微弱生长，表型与野生 型不同。
原因:
TS突变株的一种重要酶蛋白（例如 DNA 聚合酶、氨 基酸活化酶等）在某种温度下呈现活性，而在另一种温 度下却是钝化的。 原因是由于这些酶蛋白的肽链中更换了几个氨基酸， 从而降低了原有的抗热性。 TS突变株在代谢过程中的各个环节，如核酸合成、蛋 白质合成、细胞膜或细胞分裂过程中，某种酶的合成或 功能由温度所控制。 例如，有些大肠杆菌菌株可生长在 37℃下，但不能在 42℃生长； T4 噬菌体的几个突变株在 25℃下有感染 力，而在 37℃下则失去感染力等。
局部结合子
杂合系
重组体
a 供体部分染色体与受体整套染色体相结合 b 供体与受体都是部分染色体相结合
二） 放线菌杂交育种
重组过程可能出现的现象：
3、异核系的形成
部分合子形成后，产生了杂合的无性繁殖系细胞 核；在繁殖复制过程中，两种不同基因型的染色 体进行一次交换，产生了杂合系，为经过一次单 交换而产生的异核系染色体组。
交换后的染色体不是封闭的环状结构而是呈线状， 且在染色体末端具有串联的重复体。
二） 放线菌杂交育种
重组过程可能出现的现象：
4、重组体的形成
异核系不稳定，在菌落生长过程中染色体重叠的 两节段的不同位置上发生交换后有产生重组体。 杂合系是形成重组体所必须的阶段
2）放线菌杂交技术 1. 混合培养法 2. 玻璃纸法
4、抗反馈调节突变株的筛选
反馈抑制 →酶的活性
反馈阻遏
→酶的合成
调节基因或操纵基因发生突变， 使产生的阻遏蛋白不再能和终 产物结合或结合后不能作用于 已突变的操纵基因 结构基因突变，使变构酶不再 具有结合终产物的能力，但仍 具有催化活性
解除反馈阻遏
解除反馈抑制
5、组成型突变株的筛选
组成酶
酶
诱导酶 ◆ 调节基因或操纵基因发生突变，都有可能获得组成型 突变株 ◆ 筛选原则 设计某种有利于组成型菌株生长，并限制诱导型菌株生 长的培养条件，造成组成型菌株生长优势或适当的分辨两 类菌落的方法，选出组成型突变株
酶解细胞壁
原生质体1 再生
再生频率 测定
＞106
＞106
原生质体2 再生
再生菌落 性状测定
融合
再生频率 测定
再生菌落 性状测定
直接选择法
融合子
间接选择法
杂交性状测定
１、直接亲本及其遗传标记的选择
◆ 优良性状 ◆ 所用的亲株均要有一定的遗传标记，以便于选择 ◆ 一般以营养缺陷型和抗药性等为标记 ◆ 目的基因并不一定与标记基因连锁，但确实可 大大减少工作量，提高育种效率
第4节 基因重组技术
传统的优良菌株选育主要采用诱变育种；
但多次使用会影响菌体正常代谢，以及诱变剂 对人的危害。
杂交育种概述 将两个基因型不同的菌株经接合使遗传物质 重新组合，通过分离和筛选获得具有新性状 的菌株。
杂交育种的目的
①使不同菌株的遗传物质进行交换和重新组合，改 变原有菌株的遗传性状，获得新的重组体； ②克服长期用诱变剂处理造成的菌株生活能力下降 等缺陷； ③扩大变异范围，提高产品质量和有效组分含量； ④分析杂交结果，促进遗传学理论的发展； ⑤恢复或提高对诱变剂的敏感性，有利于再使用诱 变育种。
3. 平板杂交法
以下以 混合培养法为例
介绍
混合培养法
①直接亲本选择 ： 要求携带不同的营养缺陷型或抗性作为遗传标记；同 时，配对亲本最好还带有颜色标记或产量标记，一般要 求两亲本各具有不同孢子颜色或不等的产量性能。 ②斜面混合接种：
取两亲株孢子或菌丝，重叠接种到完全培养基斜面， 培养。
混合培养时要注意两亲株的孢子萌发时间和菌丝生长 速度的同步性，生长速度慢的亲株要提前接种。
◆ 筛选检出抗药性突变株可用梯度培养皿法
筛选抗噬菌体突变株
以高浓度噬菌体平板筛选抗性菌株
3、温度敏感突变型筛选
TS（Ts; ts）突变株 （temperature-sensitive mutant） 指仅在某个温度范围内显示与野生型不同表型的突变型。
高温敏感突变型：在某个温度以上显示出和野生型不同表型。 低温敏感突变型：在某个温度以下显示出与野生型不同表型。
如果发生这类突变的基因控制的特性是生长繁殖不可缺少
的，那么就会形成条件致死突变型。
温度敏感突变型（高温）是最常用的一类条件致死突变型 基因功能研究、育种
许可温度(permissive temperature)
保持原来正常性状的温度
限制性温度(restrictive temperature〉 非许可温度 (non-permissive temperature)
一） 细菌杂交育种
1、细菌杂交的发现 2、细菌杂交的方式：转导 转化 接合
二） 放线菌杂交育种
在细菌杂交研究的基础上建立
放线菌和细菌一样属于原核微生物，但却像霉 菌那样以菌丝形态生长，且形成分生孢子。
所以就本质来说，放线菌的基因重组过程近似于 细菌，但就育种方法来说，却有许多与霉菌相似 的方面。
二） 放线菌杂交育种
重组过程可能出现的现象：
1、异核现象
混合培养的过程中形成的，同一条菌丝或同一个 细胞含有不同（多个）基因型的细胞核 这种异核体与霉菌异核体不同，在复制过程中染 色体不发生交换；在基本培养基上表现为形成的 菌落都是原养型，当它们产生的分生孢子进一步 培养时，形成的菌落却都分别属于两亲本类型。