响应葡萄根瘤蚜侵染的扩展蛋白基因筛选及其多克隆抗体的制备

园艺学报，2016，43 (1)：15–24.Acta Horticulturae Sinicadoi：10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0574；http：//www. ahs. ac. cn 15响应葡萄根瘤蚜侵染的扩展蛋白基因筛选及其多克隆抗体的制备季兴龙1，韩宁2，翟衡1，杜远鹏1,*（1山东农业大学园艺科学与工程学院，作物生物学国家重点实验室，山东泰安 271018；2齐鲁工业大学生物工程学院，济南 250353）摘 要：以对葡萄根瘤蚜敏感的‘克瑞森无核’葡萄（Vitis vinifera‘Crimson Seedless’）组培苗和抗性砧木‘1103P’组培苗为试材，通过荧光定量PCR技术从扩展蛋白基因家族中筛选到经根瘤蚜侵染后表达上调的扩展蛋白基因家族成员VvEXP A1。

采用RT-PCR方法克隆到VvEXP A1基因片段，连接至原核表达载体pET-32a中，转化大肠杆菌DE3菌株，测序确定构建的重组载体pET32a-VvEXPA1开放阅读框正确，并经IPTG诱导表达了融合蛋白。

该蛋白以包涵体的形式存在，纯化后免疫新西兰兔，制备扩展蛋白多克隆抗体，通过Western-blot和ELISA检测抗体的特异性及效价。

结果显示制备的抗体具有较高的特异性，ELISA显示效价为1︰51 200。

关键词：葡萄；根瘤蚜；扩展蛋白；VvEXPA1；多克隆抗体制备中图分类号：S 663.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2016）01-0015-10 Identification of VvEXP Gene from Grape Roots Infected by Phylloxera and Preparation of Polyclonal Antibody to Grape ExpansinJI Xing-long1，HAN Ning2，ZHAI Heng1，and DU Yuan-peng1,*（1College of Horticulture Science and Engineering，Shandong Agricultural University，State Key Lab of Crop Biology，Tai’an，Shandong 271018，China；2College of Bioengineering，Qilu Technology of University，Ji’nan 250353，China）Abstract：Based on qRT-PCR method，an expansin（VvEXP A1）was acquired and investigated from infected Crimson Seedless grape and 1103P grape rootstock in present study. VvEXP A1 was cloned into prokaryotic expression vector pET32a after identification by enzymatic digestion and sequencing，and then the recombinant plasmid with VvEXP A1 was transformed into E. coli DE3.The results showed that the protein was highly expressed in E. coli and the molecular weight of the recombinant protein was 41 kD. The specific antibody was prepared by immunizing rabbit with the purified protein，and then detected by Western-blotting and ELISA. Finally，the high specific antibody was obtained and the titers of anti-VvEXPA1 antibody were 1︰51 200.Key words：grape；phylloxera；expansin；VvEXP A1；poly-antibody preparation收稿日期：2015–11–10；修回日期：2016–01–18基金项目：国家自然科学基金项目（31201609）；山东省中青年科学家基金项目（BS2012NY007）；山东省自然科学基金项目（ZR2013CQ022）；高等学校博士学科点专项科研基金项目（20113702120007）* 通信作者Author for correspondence（E-mail：duyuanpeng001@）Ji Xing-long，Han Ning，Zhai Heng，Du Yuan-peng.Identification of VvEXP gene from grape roots infected by phylloxera and preparation of polyclonal antibody to grape expansin. 16Acta Horticulturae Sinica，2016，43 (1)：15–24.葡萄根瘤蚜（Daktulosphaira vitifoliae Fitch）是葡萄专性寄生害虫，侵染敏感葡萄品种后，侵染位点周围细胞开始加速生长（Kellow et al.，2004；Du et al.，2011），细胞体积加速膨大（杜远鹏，2010），外观上表现为产生膨大的瘤状组织（Forneck et al.，2001），根瘤蚜在瘤状组织上取食并完成整个发育周期产卵，瘤状组织能够提供根瘤蚜生长发育产卵所需的足够的营养物质（Granett & Timper，1987），因此能否形成瘤状组织是判断葡萄品种对根瘤蚜敏感性的重要指标（Boubals，1966）。

扩展蛋白在细胞膨大中起关键作用，其位于细胞壁（Lee et al.，2001；Lee & Kende，2002），是由250 ~ 270个氨基酸残基组成的单链蛋白，共分3个结构域（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）。

其N末端20 ~ 30个氨基酸残基属于信号肽，可引导扩展蛋白分泌到细胞壁，结构域Ⅱ由90 ~ 120个氨基酸残基组成，属于纤维素结合结构域（Sampedro & Cosgrove，2005）。

根据扩展蛋白基因组分析可将植物中的扩展蛋白家族分为4个亚家族EXPA、EPXPB、EXPLA和EXPLB（Kende et al.，2004；Sampedro & Cosgrove，2005）。

其中，EXPA和EXPB亚家族与细胞壁伸展有关，而EXLA和EXLB亚家族的功能尚不明确。

作为细胞壁蛋白质，扩展蛋白不属于结构蛋白，而是一种酶蛋白，可以打断细胞壁纤维素与半纤维素之间的共价键与非共价键，促使纤维素和半纤维素相互移位，引发细胞壁伸展（Cosgrove，2000），因此扩展蛋白可以参与植物细胞生长、果实软化、根毛发生、花粉管延伸、组织分化等生长发育过程，而且可能与植物在生物胁迫中形成的根结有关。

Greisser和Grundler（2008）发现，根结线虫侵染番茄形成的根结中，LeEXP A2、LeEXP A5和LeEXP A11基因表达明显上调；在拟南芥中，AtEXP A1、AtEXP A15和AtEXPB3基因上调表达也与根结的形成有关（Jammes et al.，2005；Wieczorek et al.，2006）。

然而根瘤蚜侵染形成的根结和根瘤是否与根部细胞壁扩展蛋白活性调控有关，至今并不明确。

本试验中从对根瘤蚜敏感的葡萄品种‘克瑞森无核’和抗性葡萄砧木‘1103P’根部扩展蛋白基因家族中筛选与根结形成相关的基因，克隆其全长，进行原核表达以制备蛋白的多克隆抗体，为进一步分析葡萄受根瘤蚜侵染后扩展蛋白功能研究奠定基础。

1 材料与方法1.1 材料试验于2014年4月进行。

以‘克瑞森无核’葡萄（Vitis vinifera‘Crimson Seedless’）和葡萄砧木‘1103P’无菌组培苗为试材。

组培室培养光周期为14 h/10 h，昼夜温度为25 ℃。

生长40 d后，挑取6 d的根瘤蚜虫卵采用Kellow等（1999）的方法灭菌后，放在无菌的培养皿中孵化，1 d后用毛笔挑取1龄幼虫200头放在1 cm × 1 cm的灭菌滤纸上，然后将滤纸放入组培苗中。

对照放入空滤纸，如图1所示。

接种完成后放在组培室培养，3 ~ 4 d后根部形成根结。

‘克瑞森无核’和‘1103P’各接种21瓶，分别于接种后的第0、4、8、16、24、48和72 h取样。

每次取样3瓶。

pET-32a载体、大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）、DH5α由实验室保存。

RNAplant Plus Reagent试剂盒购自天根生物科技有限公司；小量质粒抽提试剂盒和胶回收试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司；限制性内切酶、T4 DNA连接酶、异丙基硫化–β–D–半乳糖苷（IPTG）、反转录试剂盒（Cat#RR047A）购自大连宝生物公司；包涵体蛋白纯化试剂盒和Western-blot二抗（lot#J10309）购自全式金生物技术有限公司。

季兴龙，韩宁，翟衡，杜远鹏.响应葡萄根瘤蚜侵染的扩展蛋白基因筛选及其多克隆抗体的制备.园艺学报，2016，43 (1)：15–24 17图1 根瘤蚜接种方式（A）及根局部放大（B）Fig. 1 Injection methods of phylloxera（A）and partial zoom in root（B）1.2 定量PCR技术筛选响应根瘤蚜侵染的葡萄根扩展蛋白基因根据Santo等（2013）的方法，从葡萄基因组数据库中得到了12条VvEXP A和4条VvEXPB基因序列，利用Primer Premier 5.0设计半定量引物（表1）。

在‘克瑞森无核’葡萄和‘1103P’根部接种1龄根瘤蚜，并在接种0、4、8、16、24、48和72 h后分别收集根样品，使用RNAplant Plus Reagent 试剂盒提取根总RNA，反转录得到cDNA，取适量作为模板。

按照SYBR Premix Ex Taq TM（TaKaRa）操作指导，在Bio-Rad公司的My-IQ2荧光定量PCR仪上检测基因的表达量。