一种纯化苏云金杆菌CrylAc蛋白的方法

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苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白提取和纯化

苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白提取和纯化摘要：苏云金芽孢杆菌是目前世界上研究最多、产量最大、应用范围最广的微生物杀虫剂，具有专一性强、对人畜无害、防治效果好、易生物降解及无残毒等优点。

通过对苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白提取和纯化得到伴孢晶体。

经过稀释分成不同的浓度分别去检测杀虫活性。

关键词：伴孢晶体，苏云金芽孢杆菌，纯化1 材料与方法1.1 材料1.1.1 仪器设备和试剂超净工作台，高压灭菌锅，离心机，冷冻干燥机，-80℃低温冰箱，透析袋，移液管，玻璃棒，电子秤，养虫缸。

超纯水，0.5M/L的Nacl，生理盐水，5%的丙酮溶液。

1.1.2 研究菌株本实验室分离自病蚕体内的苏云金芽孢杆菌。

1.1.3 供试昆虫菜青虫。

1.1.3 培养基种子培养基[1]:酵母浸膏0.5％，蛋白胨1.0％，NaC1 1.0％，pH值7.0。

121℃灭菌30 min。

蒸馏水1000 ml，pH值7.0（用NaOH调pH值）。

发酵培养基[2]：牛肉膏0.5％，蛋白胨1.0％，葡萄糖0.3％，NaC1 0.2％，MgS04·7H2O 0.03％，K2HPO4 0.03％，MnSO40.005％，蒸馏水1000 ml。

调pH 7.5，121℃灭菌30 min，灭菌后pH 7.3。

1.2 方法1.2.1 种子液的培养在无菌的条件下，从保藏管中分别挑一环接种有种子夜培养基，30℃培养14 h。

1.2.2 菌株发酵按照3％的接种量转接500ml的发酵培养基，30℃，120 r／min培养60 h，镜检观测80％以上的菌体裂解时停止培养，离心收集提取晶体蛋白。

1.2.3 伴孢晶体的分离纯化[4]氨基酸可以3种形式存在，即带正电荷、带负电荷和两性离子，如在酸性溶液中带正电荷、在碱性溶液中则带负电荷。

若在某一pH 值下氨基酸净电荷为零，且在电场中不移动时，此pH 值为它的PI值(等电点)。

因为净电荷为零，净电斥力不存在，大部分蛋白质于等电点的pH值下，其溶解度是最小的。

苏云金芽孢杆菌cry1Da5基因的克隆与表达

苏云金芽孢杆菌cry1Da5基因的克隆与表达苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis var. kurstaki）是一种常见的土壤细菌，被广泛应用于农业领域的生物杀虫剂中。

其杀虫作用主要来源于其产生的毒素，其中包括Cry（crystal）蛋白家族。

Cry蛋白是一类孢粉结晶蛋白，由于其高度的昆虫特异性和高毒性特点，被广泛应用于农业昆虫的防治。

不同的昆虫对Cry蛋白的敏感性存在较大差异。

为了提高其杀虫活性，进行Cry蛋白的改良和优化成为研究的一个热点。

在这篇文章中，我们主要关注苏云金芽孢杆菌的Cry1Da5基因的克隆与表达。

Cry1Da5是Cry蛋白家族的一员，对某些害虫如烟草霜霉病虫（Manduca sexta）具有较高的毒杀活性。

研究其基因的克隆与表达，有助于深入理解其杀虫机制，并为其应用于农业防治提供理论基础。

我们从苏云金芽孢杆菌中提取其基因组DNA，并使用特异引物进行PCR扩增Cry1Da5基因。

扩增产物通过凝胶电泳检测，保证其质量和纯度。

随后，我们将Cry1Da5基因克隆至适当的表达载体中。

常用的表达载体有原核表达系统和真核表达系统。

对于Cry1Da5基因的克隆与表达，我们通常采用原核表达系统。

这是因为苏云金芽孢杆菌本身就是一种原核细菌，其表达机制更为适合于Cry1Da5基因的表达。

在克隆至表达载体后，我们进行质粒酶切鉴定，确保正确的基因序列被克隆。

接着，我们将Cry1Da5基因的表达载体转化至表达宿主中，如大肠杆菌（Escherichia coli）中。

经过适当的培养和诱导条件，Cry1Da5基因的表达产物将被大肠杆菌表达出来。

我们对表达产物进行纯化和鉴定。

一般来说，我们采用亲和层析技术，如镍柱层析，使Cry1Da5蛋白与特定标签结合，然后经过洗脱和浓缩得到纯化的Cry1Da5蛋白。

我们对纯化的Cry1Da5蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳分析，确定其纯度和分子量。

通过以上的实验步骤，我们成功地克隆和表达了苏云金芽孢杆菌的Cry1Da5基因。

苏云金芽孢杆菌Cry毒素共性结构短肽串联表达及功能分析

河南农业科学，2024，53（1）：96‑104Journal of Henan Agricultural Sciencesdoi:10.15933/ki.1004-3268.2024.01.011苏云金芽孢杆菌Cry 毒素共性结构短肽串联表达及功能分析金嘉凤1，2，沈成2，3，孟萌2，4，陈蔚2，徐重新1，2，刘媛1，2，刘贤金2（1.江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江212013；2.江苏省农业科学院农产品质量安全与营养研究所/省部共建国家重点实验室培育基地—江苏省食品质量安全重点实验室，江苏南京210014；3.南京农业大学植物保护学院，江苏南京210023；4.江苏大学生命科学学院，江苏镇江212013）摘要：苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis ，Bt ）Cry 毒素是一类具有抗虫功能的微生物蛋白。

将前期基于Bt Cry 毒素家族氨基酸序列及结构信息设计获得的呈现Cry 毒素共性结构的3个短肽，拼接成为具有免疫原性的长链多肽（Bt Cry-GXJG-11），以期研发Bt Cry 毒素杀虫功能的模拟物及制备Bt Cry 毒素检测用广谱抗体的免疫原。

分子建模预测结果显示，Bt Cry-GXJG-11与Bt Cry 毒素靶标害虫棉铃虫（Helicoverpa armigera ）钙黏蛋白受体（HaCad-TBR ）存在互作效应，并初步明确了两者互作的关键氨基酸位点为244TYR 。

经原核表达，获得了质量浓度为0.5mg/mL 的Bt Cry-GXJG-11纯蛋白，测得其与HaCad-TBR 的亲和力常数（KD ）为2.151×10-7mol/L 。

室内生测试验表明，Bt Cry-GXJG-11对棉铃虫具有一定杀虫活性，校正死亡率为27.5%；且以其免疫的小鼠血清能同时识别6种Bt Cry 毒素（Cry1Ab 、Cry1Ac 、Cry1Ah 、Cry1B 、Cry1C 、Cry1F ）。

苏云金芽孢杆菌cryl基因、基因组合及表达载体[发明专利]

专利名称：苏云金芽孢杆菌cryl基因、基因组合及表达载体专利类型：发明专利
发明人：宋福平,张杰,黄大昉,陈中义,潘映红
申请号：CN01124163.2
申请日：20010820
公开号：CN1401772A
公开日：
20030312
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明为“苏云金芽孢杆菌cryl基因、基因组合及表达载体”，属生物防治技术领域。

进一步，本发明涉及对鳞翅目害虫高毒力的Bt crylle基因的核苷酸序列和其编码的蛋白质的氨基酸序列，涉及协同组合使用crylle基因与crylAb、crylBa等基因表达产物，还涉及表达上述基因序列的引物序列和本发明构建的广宿主穿梭表达载体pSXY422b。

通过使用上述基因或其组合，可使它们对鳞翅目害虫的毒力高于出发菌株和单基因表达产物，扩大它们对鳞翅目、鞘翅目、双翅目害虫的杀虫谱，并通过应用于转化微生物和植物，使它们表现出对相关害虫的毒性，克服或延缓昆虫对工程菌和转基因植物抗药性的产生。

申请人：中国农业科学院植物保护研究所
地址：100094 北京市海淀区圆明园西路2号
国籍：CN
代理机构：北京海虹嘉诚专利代理有限公司
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苏云金芽孢杆菌crylAcl5基因的克隆及原核表达

苏云金芽孢杆菌crylAcl5基因的克隆及原核表达许禔森【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2008(036)014【摘要】[目的]为了分析苏云金芽孢杆菌cryIAc15基因序列.[方法]以全长基因PCR产物的黏端定向克隆的方法,设计1对特异引物,分别引入Sal和Bam H I酶切位点.以Ly30质粒DNA为模板扩增crylAc全长基因,与表达载体pUCM-T相应的酶切产物连接,转化大肠杆菌,获得含有crylAc基因的重组质粒pUCLyIAc.[结果]crylAc基因编码区为3 564 bp,编码蛋白分子量为134 kD,含1 184个氨基酸,与cryiAc3同源性最高,该基因经诱导获得高效表达,SDS-PAGE电泳检测到明显的134kD蛋白带.[结论]诱导表达的cryIAc蛋白对棉铃虫、甜菜夜蛾等鳞翅目害虫幼虫均有较高的杀虫活性.【总页数】2页(P5788-5789)【作者】许禔森【作者单位】德州学院生物系,山东德州253023【正文语种】中文【中图分类】Q785【相关文献】1.苏云金芽孢杆菌cry1Ac28基因的克隆及原核表达 [J], 曲步云;李海涛;李明;高继国2.人类扭转蛋白A的基因克隆、表达与蛋白质纯化(Ⅰ)——DYT1基因克隆与原核表达 [J], 周雪莹3.苏云金芽孢杆菌分子伴侣基因p19的克隆和含有该基因的Bacillus thuringiensis表达载体的构建 [J], 曾少灵;余健秀;谢瑞瑜;蒙国基;谭乐;庞义4.枸杞木糖异构酶基因LbxylA的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备 [J], 赵建华;李浩霞;尹跃;王亚军;李彦龙;樊云芳;安巍;曹有龙5.二点委夜蛾非典型嗅觉受体AlepOrco的基因克隆、原核表达及多克隆抗体制备[J], 田彩红;刘晓光;黄建荣;王瑛;封洪强因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

两类苏云金芽胞杆菌CrylAc蛋白杀玉米螟活性的比较

两类苏云金芽胞杆菌CrylAc蛋白杀玉米螟活性的比较作者：田宇曦，刘晓艳，张志刚，等来源：《湖北农业科学》 2014年第23期田宇曦，刘晓艳，张志刚，杨自文（湖北省农业科学院／湖北省生物农药工程研究中心，武汉４３００６４）摘要：通过ＰＣＲ技术将２种不同来源的苏云金芽胞杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ，简称Ｂｔ）ｃｒｙ１Ａｃ蛋白基因克隆到大肠杆菌ｐＧＥＸ－６Ｐ－１表达载体，并转化到宿主菌ＢＬ２１，采用ＩＰＴＧ进行诱导表达，并用亲和层析法进行融合蛋白的纯化，纯化后的蛋白质进行玉米螟的室内生物测定试验。

结果表明，来自Ｂｔ菌株ＮＢＩＮ－８６６的Ｃｒｙ１Ａｃ蛋白杀玉米螟的ＬＣ５０为６５.３９μｇ／ｍＬ，来自Ｂｔ菌株ＮＢＩＣ－３８０的Ｃｒｙ１Ａｃ蛋白杀玉米螟的ＬＣ５０为１５.０７μｇ／ｍＬ，后者具有更高的杀虫活性。

氨基酸序列比对发现来自菌株ＮＢＩＣ－３８０的Ｃｒｙ１Ａｃ氨基酸序列的７１位和３９３位都为丝氨酸Ｓ，而ＮＢＩＮ－８６６的都为脯氨酸Ｐ，推测这两个位点的氨基酸的变化可能是影响毒性大小的重要因素。

关键词：苏云金芽胞杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）；Ｃｒｙ１Ａｃ；融合蛋白；玉米螟；活性比较中图分类号：Ｓ１８８中图分类号：S476文献标识码：A文章编号：0439－８114（２０14）23－5742-03DOI:10.14088/ki.issn0439-8114.2014.23.029苏云金芽胞杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ，简称Ｂｔ）是一种土壤革兰氏阳性细菌，具有较广的杀虫谱。

其主要的杀虫活性物质是杀虫晶体蛋白（Ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌｃｒｙｓｔａｌｐｒｏｔｅｉｎ，ＩＣＰ）［１］。

苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白对鳞翅目、双翅目、鞘翅目等５００多种昆虫及线虫等原生动物有毒杀活性［２］。

目前关于Ｃｒｙ蛋白中Ｃｒｙ１Ａｃ蛋白结构以及功能方面的研究，国内外均有报道，如在Ｃｒｙ１Ａｃ蛋白末端融合其他蛋白以提高杀虫活性［３－５］或者将另一种蛋白与其一起共表达来提高杀虫活性［６］。

Cry1Ia蛋白的表达与纯化

山西农业科学2019，47（5）：748-750，769Cry1Ia 蛋白的表达与纯化郭小琴1,2,钱红梅1,2,郭星1,高佳丽1,张义茹1,2,高建华1,2,王兴春1,2（1.山西农业大学生命科学学院，山西太谷030801；2.山西农业大学农业生物工程研究所，山西太谷030801）摘要:苏云金芽孢杆菌表达的Cry1Ia 蛋白对鳞翅目和鞘翅目昆虫具有较好的杀虫活性。

为便于后期评价不同的Cry1Ia 蛋白，建立了Cry1Ia 蛋白的表达与纯化体系。

将一个cry1Ia 基因的编码基因接入pET28aDel 表达载体，并将其转化大肠杆菌BL21（DE3）star 菌株。

在大肠杆菌中诱导Cry1Ia 蛋白的表达，并与Bt 中的表达产物进行比较。

最后，利用Cry1Ia 蛋白C 端包含的组氨酸标签，对大肠杆菌表达的Cry1Ia 蛋白进行纯化。

结果显示，大肠杆菌中Cry1Ia 蛋白随着表达时间的延长，产物积累显著，并且其表达量高于Bt 菌株，因此，其更适宜生产完整的Cry1Ia 蛋白。

对大肠杆菌表达的Cry1Ia 进行纯化，获得了理想的结果。

研究构建了Cry1Ia 蛋白的大肠杆菌表达体系，并成功对其进行纯化，可为进一步研究此类蛋白的杀虫活性和机制奠定基础。

关键词:苏云金芽孢杆菌；大肠杆菌；cry1Ia ；蛋白表达；蛋白纯化中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:1002-2481（2019）05-0748-04Expression and Purification of the Cry1Ia ProteinGUO Xiaoqin 1，2，QIAN Hongmei 1，2，GUO Xing 1，GAO Jiali 1，ZHANG Yiru 1，2，GAO Jianhua 1，2，WANG Xingchun 1，2（1.College of Life Sciences ，Shanxi Agricultural University ，Taigu 030801，China ；2.Institute of Agricultural Bioengineering ，Shanxi Agricultural University ，Taigu 030801，China ）Abstract ：Cry1Ia proteins of Bacillus thuringiensis showed ideal insecticidal activity against Lepidoptera and Coleoptera pests.To evaluate different Cry1Ia proteins,the expression and purification system of Cry1Ia protein was established.A cry1Ia gene was inserted into the pET28aDel expression vector and transformed into Escherichia coli BL21（DE3）star strain.The expression of Cry1Ia protein was induced and were compared with that of Bt strain.Finally,the Esoherichia coli expressed Cry1Ia protein was purified by the histidine tag located at the C-terminus.The results showed that the Cry1Ia protein in Escherichia coli accumulated significantly with the prolongation of expression time,and the expression level was higher than that of Bt strain,so it was more suitable to produce the intact Cry1Ia protein.The constructed Cry1Ia protein could be purified successfully.In this study,the Escherichia coli expression and purification system of Cry1Ia protein was established which laid a foundation for further study of the insecticidal activity and mechanism of these proteins.Key words ：Bacillus thuringiensis ;Escherichia coli ;cry1Ia gene;protein expression;protein purification收稿日期:2019-01-27基金项目:国家自然科学基金项目（31601690）；山西省研究生教育创新项目（2018BY066）作者简介:郭小琴（1991-），女，山西吕梁人，在读硕士，研究方向：蛋白质的原核表达。

苏云金芽孢杆菌Cry2Aa蛋白的体外表达及纯化

苏云金芽孢杆菌Cry2Aa蛋白的体外表达及纯化摘要：根据大肠杆菌密码子偏好性对苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）cry2Aa基因进行优化，并合成全长基因，将cry2Aa基因克隆到表达载体pET-44a 上，转化到大肠杆菌Rosetta中进行诱导表达，优化表达条件，采用亲和层析和SDS-PAGE胶回收纯化，Western blot鉴定回收产物。

结果表明，IPTG浓度为0.50 mmol/L、27 ℃诱导4 h时Cry2Aa蛋白表达量最高，SDS-PAGE胶回收Cry2Aa 纯化蛋白所得的产量高于亲和层析法。

关键词：苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）；Cry2Aa蛋白；表达；纯化苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是一种能够产生多种杀虫晶体蛋白（Cry）的土壤细菌[1，2]，Bt的cry基因已成功转入很多主要农作物（Bt 农作物），包括玉米、棉花、西红柿等，使它们具有抗虫特性[3-6]。

Cry1类杀虫晶体蛋白对鳞翅目害虫具有特异毒性，在微生物和植物基因工程中得到了广泛的应用，但其存在着杀虫谱狭窄、昆虫产生抗药性等问题[7，8]。

Cry2类蛋白在结构和杀虫机制上不同于Cry1类，如Cry2Aa既对鳞翅目害虫有毒性又能杀害双翅目害虫[9]。

研究显示转cry2Aa基因的鹰嘴豆对豆荚蛀虫有较强的毒性[10]，而转cry2Aa基因的水稻对其传粉昆虫如中华通草蛉无危害性[11]。

本研究合成密码子优化的cry2Aa基因，体外重组表达Cry2Aa蛋白并进行优化，以期为进一步求证Cry2Aa的安全性奠定基础。

1 材料与方法1.1 材料苏云金芽孢杆菌Cry2Aa蛋白序列由华中农业大学林拥军教授提供，与NCBI （http：//）中相关序列（M31738）仅有少数氨基酸不同。

pET-44a 质粒、大肠杆菌TOP10和Rosetta菌株由广州市过敏反应与临床免疫重点实验室保存；Strep Trap HP预装柱和低分子量蛋白Marker购自GE公司；StrepⅡ标签抗体购于Merck公司。

苏云金杆菌cryIA(c)基因在蜡质芽孢杆菌中营养期表达质粒的构建[发明专利]

专利名称：苏云金杆菌cryIA(c)基因在蜡质芽孢杆菌中营养期表达质粒的构建
专利类型：发明专利
发明人：张青文,徐静
申请号：CN01109976.3
申请日：20010328
公开号：CN1319669A
公开日：
20011031
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及苏云金杆菌杀虫毒蛋白基因cryIA(c)的分离和克隆方法、在蜡质芽孢杆菌中构建营养期表达质粒的方法以及由此获得的质粒,还涉及含有该质粒的棉花内生工程菌－蜡质芽孢杆菌。

所构建成的棉花内生工程菌不仅在产孢期产生杀虫毒蛋白,在营养生长期也能产生杀虫毒蛋白,而且该工程菌接种棉花后,能够在棉株体内定植、扩增,表达杀虫毒蛋白,在棉花的整个生长季节都能表现杀虫活性。

申请人：张青文,徐静
地址：100094 北京市海淀区圆明园西路2号中国农业大学(西区)植物保护学院
国籍：CN
代理机构：北京科龙环宇专利事务所
代理人：孙皓晨
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从苏云金芽孢杆菌中鉴定、定量和纯化杀昆虫蛋白质[发明专利]

专利名称：从苏云金芽孢杆菌中鉴定、定量和纯化杀昆虫蛋白质
专利类型：发明专利
发明人：P·C·玛丽安,R·C·保尔,矢口诚,L·提莫斯
申请号：CN94107241.X
申请日：19940627
公开号：CN1114358A
公开日：
19960103
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：公开了鉴定由苏云金芽孢杆菌基因表达的蛋白质前毒素的方法。

根据该方法，首先在pH约为9.5的含水悬浮液中用胰蛋白水解酶对含前病毒材料如苏云金芽孢杆菌的多分结晶进行有限的水解以产生子毒素。

然后在大于10的恒定pH下在渐增的盐较好是氯化钠的梯度中用高效阴离子液相层析法分离子毒素。

利用具有渐增浓度盐的并在预定时间和以一定速度被引入的一系列缓冲液达到对所使用的柱特异的梯度条件。

申请人：加拿大国家研究院
地址：加拿大渥太华
国籍：CA
代理机构：中国国际贸易促进委员会专利商标事务所
代理人：黄革生
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苏云金芽孢杆菌晶体蛋白分离纯化新方法研究

苏云金芽孢杆菌晶体蛋白分离纯化新方法研究杨开杰【摘要】There are many methods such as liquid double phase, density gradient, sediment, bio-physics separation and so on, frequently used to isolate and purify the protein crystal from bacillus thuringiensis (Bt). However, these methods have their own defects as well as advantages. In this paper, the isolation cost, the equipment, the purity, the output and the activity were considered. Three improvements on ultrasonic wave process, suspension liquid preparation and ultraviolet ray radiation were made. Thus, a new method to separate crystal protein from Bt was set up. This technology has a characteristic of low cost, simple operation and high application. The production ratio is improved from 20% to 28% with the product purity of 90%.%分离苏云金芽孢杆菌(Bt)晶体蛋白常用的方法有液体双相法、密度梯度法、沉淀法、生物-物理分离法等，但这几种方法各有优缺点。

苏云金杆菌cryⅠA（a）,cryⅠA（b）和cryⅠA（c）基因型的PCR？…

苏云金杆菌cryⅠA（a）,cryⅠA（b）和cryⅠA（c）基因
型的PCR？…
黄志鹏;黄必旺
【期刊名称】《福建农业大学学报》
【年(卷),期】1998(027)004
【摘要】根据苏云金杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）杀虫晶体蛋白基因的结构特点，合成了ｃｒｙⅠ基因５‘端特异引物和３’端共同引物，利用ＰＣＲ扩增，使不同基因引物产生不同长度的扩增产物。

通过扩增产物片段的分子量大小来确定菌株所含杀虫基因类型。

本研究对福建农业大学生物技术中心分离和保存的２０个菌株进行了ｃｒｙⅠＡ（ａ－ｃ）基因类型的ＰＣＲ鉴定。

【总页数】4页(P440-443)
【作者】黄志鹏;黄必旺
【作者单位】福建农业大学生物技术中心;福建农业大学生物技术中心
【正文语种】中文
【中图分类】S476.11
【相关文献】
1.苏云金杆菌新菌株WB9 cry1基因型的PCR-RFLP分析 [J], 黄志鹏;关雄
2.转Cry1Ab和Cry1Ac融合基因型抗虫水稻对田间二化螟和大螟种群发生动态的影响 [J], 李志毅;隋贺;徐艳博;韩兰芝;陈法军
3.cry4Aa、cry4Ba和cryllAa基因在苏云金杆菌无晶体型菌株中的表达 [J], 孙钒;
袁志明;李田勇;蔡全信;张用梅
4.梅花鹿粪便中苏云金杆菌分离株的生物学特性及其cry基因型鉴定 [J], 吴昌标;关怡;邱津津;黄张敏;张爱华
5.转cry1Ab/cry1Ac基因水稻TT51-1中外源基因多重PCR检测方法 [J], 查中萍; 万丙良; 殷得所; 杜雪树; 李进波; 夏明元; 戚华雄; 李圆梦
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苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白CryIA单克隆抗体的制备及在转Bt基因棉毒蛋白检测上的应用

苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白CryIA单克隆抗体的制备及在转Bt基因棉毒蛋白检测上的应用王保民;何钟佩;田晓莉【期刊名称】《棉花学报》【年(卷),期】2000(021)001【摘要】The spore/crystal complex was pre pared from Bacillus thuringiensis var. kurstaki HD-1 and HD-73 during sporulation. The parasporal crystal was isolated from the spore crystal/complex by liquid two phased methods. CryIA and CryIA (c) were precipitated from parasporal crystal on PI4.4. The 130～140 kDa molecular weight protein was separated with sodium-dodecy-sulfate polyacrylamide gel (SDS - PAGE ) electrophoresis. Two polyclonal antibodies were acquired using CrylA , CryIA (c)as antigens. ELISA titer of the two antisera were＞ 1/100000, ＞ 1/100000, respectively. Four monoclonal antibodies ( A4FSF11, B4E6C7, B4E6D8 and B4FSG11) were produced using CryIA insecticidal crystal protein (ICP) to immune BALB/C mouse. A double sandwich ELISA coated with anti-CryIA (c) polyclonal antibody was established with B4E6D8 as sandwich antibody. The toxin level of NUCOTN33B and CCRI-30 in leaf was detected. The content was 23. 4 a nd 24. 7 ng·g-1 FW,respectively. The result was identical with the insecticidal effect.%用苏云金杆菌菌株HD-1和HD-73分别发酵培养制备了孢晶混合物,孢晶混合物经分离、纯化、电泳得到CryIA、CryIA(c)杀虫晶体蛋白.用CryIA和CryIA(c)分别免疫家兔制备了两种多抗.用CryIA免疫小鼠,经细胞杂交、融合、克隆后筛选出4个单克隆株系A4F5F11、B4E6C7、B4E6D8、B4F5G11.用CryIA(c)多抗包被,B4E6D8上清液作为夹心抗体成功地建立了双抗夹心 ELISA,并检测了中棉所30、NUCOTN33B蕾期叶片中毒蛋白的含量,结果分别为23.4ng·g-1 FW、24.7ng·g-1 FW.【总页数】6页(P34-39)【作者】王保民;何钟佩;田晓莉【作者单位】中国农业大学作物化控中心,北京,100094;中国农业大学作物化控中心,北京,100094;中国农业大学作物化控中心,北京,100094【正文语种】中文【中图分类】S562.035【相关文献】1.转Bt基因植物中杀虫蛋白的酶联免疫检测技术研究Ⅰ.Bt菌HD-1的杀虫晶体蛋白抗原制备 [J], 严吉明;叶华智;张敏;伍光庆2.转Bt基因植物中杀虫蛋白的酶联免疫检测技术研究Ⅱ.Bt杀虫晶体蛋白抗体的制备 [J], 严吉明;崔林开;叶华智;张敏;伍光庆3.杀虫晶体蛋白基因CryIA（c）表达载体构建与表达研究 [J], 秦新民;刘佩瑛4.苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白Cry1D新基因的克隆与特性 [J], 余宗兰;贺利业;孙宏伟;李平;郑爱萍5.转Bt基因棉花杀虫晶体蛋白的表达及光合特性的研究 [J], 孙彩霞;陈利军;武志杰;吴琼;陈翠薇因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

苏云金芽孢杆菌Cry2Aa蛋白的体外表达及纯化

苏云金芽孢杆菌Cry2Aa蛋白的体外表达及纯化高洁荣;何颖;邹泽红;艾云灿【期刊名称】《湖北农业科学》【年(卷),期】2013(052)003【摘要】根据大肠杆菌密码子偏好性对苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)cry2Aa基因进行优化,并合成全长基因,将cry2Aa基因克隆到表达载体pET-44a上,转化到大肠杆菌Rosetta中进行诱导表达,优化表达条件,采用亲和层析和SDS-PAGE胶回收纯化,Western blot鉴定回收产物.结果表明,IPTG浓度为0.50 mmol/L、27℃诱导4h时Cry2Aa蛋白表达量最高,SDS-PAGE胶回收Cry2Aa纯化蛋白所得的产量高于亲和层析法.%cry2Aa gene of Bacillus thuringiensis was optimized according to codon preference of Escherichia coli,which was then synthesized and cloned into expression vector pET44a and transformed into E.coli Rosetta strain.The expression of Cry2Aa protein was induced under optimized conditions.The expressed protein was purified by affinity chromatography and SDS-PAGE gel extraction,and identified by Western blot.The results showed that expression of Cry2Aa protein was the highest when induced by 0.50 mmol/L IPTG at 27 ℃ for 4 h.Yield of purified recombinant protein Cry2Aa obtained by SDSPAGE gel extraction was higher than that of affinity chromatography.【总页数】4页(P702-705)【作者】高洁荣;何颖;邹泽红;艾云灿【作者单位】中山大学生命科学院/有害生物控制与资源利用国家重点实验室,广州510275;广州医学院第二附属医院/呼吸疾病国家重点实验室变态反应研究室/广州市过敏反应与临床免疫重点实验室,广州 510260;广州医学院第二附属医院/呼吸疾病国家重点实验室变态反应研究室/广州市过敏反应与临床免疫重点实验室,广州510260;广州医学院第二附属医院/呼吸疾病国家重点实验室变态反应研究室/广州市过敏反应与临床免疫重点实验室,广州 510260;中山大学生命科学院/有害生物控制与资源利用国家重点实验室,广州510275【正文语种】中文【中图分类】S476+11【相关文献】1.克隆、表达及纯化核糖体蛋白S6用于体外激酶活性检测 [J], 刘安玲;赵莉;贾春宏;李明2.苏云金芽孢杆菌cry2Aa操纵元蛋白对杀虫蛋白晶体形成作用的研究 [J], 姚江;张杰;陈中义;李长友;黄大昉3.二化螟钙黏蛋白CAD1的原核表达及与Cry1Ac、Cry2Aa蛋白的结合 [J], 周浩;李博;牛林;邱林;王永4.苏云金芽孢杆菌Cry2Aa型杀虫晶体蛋白的分类与构效 [J], 施茹玲; 郭幼红5.苏云金芽孢杆菌Cry2Aa型杀虫晶体蛋白的分类与构效 [J], 施茹玲;郭幼红因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。