glycine receptor in shsy5 cells

冰上收取细胞裂解液，按照说明书配制 ATP 检 测 工 作 液 ，用 Luminometer 检 测 测 定 RLU 值 ，根 据 标准曲线算出 ATP 浓度。 用 BCA 蛋白浓度测定试 剂盒测定 样本中的 蛋白浓度， 将 ATP 浓度换算成 nmol ／ mg 蛋白。 1．2．6 Western blot 实验
组的吸光度为 0．51±0．02， 与 5 mmol ／ L 甘氨酸保护 组相比有统计学意义（P ＜ 0．01）。 40 mmol ／ L 甘氨酸 保护组的 MTT 吸 光 度 为 0．52±0．07， 与 20 mmol ／ L 保护组相比无统计学意义（图 1）。
2．1．2 LDH 释放 进一步观察甘氨酸对细胞膜通透性的影响，未
SH-SY5Y 细 胞 接 种 于 含 10％ 胎 牛 血 清 的 RMPI-1640 培养液中，37℃、饱和湿度、5％ CO2 培养 箱中培养，至对数生长期用于实验。 1．2．2 细胞培养及处理
Hale Waihona Puke ·1064·南京医科大学学报
第 29 卷第 8 期 2009 年 8 月
实验中通过无糖培养液加呼吸链阻断剂导致 细胞 ATP 耗竭，无糖培养液中加入鱼藤酮和抗霉素 A（终浓度分别为 10 nmol ／ L、100 nmol ／ L），调整 pH 值至 7．4。 将生长正常的 SH-SY5Y 细胞按每孔 8 × 104 cells 和 5 × 103 cells 分别接种于 6 孔板和 96 孔 板 ， 生 长 24 h 后 用 于 实 验 。 甘 氨 酸 处 理 浓 度 为 5 mmol ／ L、20 mmol ／ L、40 mmol ／ L。 1．2．3 MTT 吸光度实验
用 鱼 藤 酮 和 抗 霉 素 A 处 理 的 细 胞 LDH 释 放 率 为 （21．3±2．7）％，ATP 耗竭 6 h 后， 细胞膜通透性明显 增大，LDH 释放率为（58．1±1．3）％。 加用 20 mmol ／ L 甘氨酸保护后，LDH 释放率下降为（32．1±3．6）％，与 ATP 耗竭组相比差异有统计学意义（P ＜ 0．01，图 2）。
1 材料及方法
1．1 材料
［基金项目］ 海外青年学者合作研究基金（30628017） *通 迅 作 者 ，E-mail：qichen＠njmu．edu．cn
SH-SY5Y 细胞株由本校神经药理实验室馈赠 ， 甘氨酸、鱼藤酮、抗霉素 A 及无糖培养基购于美国 Sigma 公司，MTT（四甲基噻唑蓝）购于美国 Amresco 公 司 ，RPMI-1640 培 养 基 购 于 美 国 Gibco 公 司 ， Glycine Receptor α1 抗体购于 美国 Chemicon 公司， FBS（胎 牛血清）购于 杭州四季 青公司，乳酸 脱 氢 酶 检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所，ATP 检 测试剂盒购于海门碧云天生物技术研究所。 1．2 方法 1．2．1 细胞系的培养和传代
第 29 卷第 8 期 2009 年 8 月
南京医科大学学报（自然科学版） ACTA UNIVERSITATIS MEDICINALIS NANJING（Natural Science）
甘氨酸在神经母细胞瘤细胞 ATP 耗竭损伤中的保护作用
曹剑秋，秦 霞，柏 惠，陈 琪* （南京医科大学动脉粥样硬化研究中心，江苏 南京 210029）
CAO Jian-qiu，QIN Xia，BAI Hui，CHEN Qi* （Artherosclerosis Research Center，NJMU，Nanjing 210029，China）
［Abstract］ Objective：To investigate the cytoprotection and mechanisms of glycine （Gly） on the ATP-depleted SH-SY5Y cells of neuroblastoma． Methods：SH-SY5Y cells were exposed to ATP depletion in the presence or absence of glycine． The cell injury was assessed by measurements of ATP concentration，lactate dehydrogenase （LDH）release and ceu activity． Glycine receptor expression was analyzed by Western blot． Results：Gly was found to ameliorate a reduce in ATP level within 60 minutes of treatment with rotenone and antimycin A． After the treatment for 6 hours，Gly could reduce the LDH release and enhance cell activity． Meanwhile，glycine receptor was overexpressed under the stress，which was decreased by addition of glycine to cells． Conclusion：These results demonstrated that Gly protected SH-SY5Y cells from ATP depletion injury and alleviated over-expression of glycine receptor under stress． ［Key words］ glycine； ATP depletion； glycine receptor； cytoprotection
3讨论 缺血、缺氧、中毒、代谢障碍等均可能影响细胞
内 ATP 的 生 成 过 程 ［3］，使 细 胞 处 于 ATP 耗 竭 状 态 。 在这种情况下，由于细胞能量代谢发生障碍，表现 出结构被破坏，细胞成分丧失，功能紊乱，最终造成 不可逆的损伤 。 ［4－5］ 近年来的研究显示，甘氨酸可能 通过抑制由 于 ATP 耗竭而 引起的细胞 膜通透性增 加，防止细胞内大分子物质的外流，从而缓解细胞 损伤［6］。 通过建立稳定表达甘氨酸受体的人肾胚细胞
本研究通过无糖培养液加呼吸链阻断剂的方 法建立细胞 ATP 耗竭模型。 无糖培养液用以防止糖 酵解产能，而呼吸链阻断剂鱼藤酮和抗霉素 A 能破 坏 ATP 生成过程中的电子传递，从而造成细胞处于 ATP 耗竭状态。 此外需将培养液 pH 值调至 7．4，可 避免由于培养液 pH 值的变化影响实验结果 。 ［12－13］
96 孔板接种细胞，按时间点处理后，每孔 200 μl 培养液中加入 25 μl MTT 工作液，37℃孵 育 4 h，弃 上 清 ， 每 孔 加 200 μl DMSO，492 nm 处 测 吸 光 度 。 1．2．4 LDH 释放实验
6 孔板接种细胞，分别收集各组细胞培养液，离 心取 上清， 剩余细 胞经 0．4％ TritonX-100 处 理 1 h 后离心取上清。 按说明书分别测定培养上清和细胞 中 LDH 活性。 细胞 LDH 释放率计算公式：LDH 释 放 率＝上 清 LDH 活 性 ／ （上 清 LDH 活 性＋细 胞 LDH 活性）×100％。 1．2．5 ATP 含量检测
冰上收取蛋 白 ， 处 理 后 的 蛋 白 样 品 进 行 SDSPAGE 电泳并电转移至 PVDF 膜，5％脱 脂奶粉室 温 封闭 3 h， 抗 GlyRα1 多克隆抗体 （1∶500） 或 抗 βactin 抗 体 （1∶500）4℃孵 育 过 夜 ，PBST 洗 膜 ，羊 抗 兔 抗体（1∶2 000）或羊抗鼠抗体（1∶2 000）室温孵育 2 h， TBST 洗膜，加入 ECL 液孵育，曝片。 1．3 统计学方法
用，通过 Western blot 检测甘氨酸受体的表达情况。 结果：耗竭 1 h 内，Gly 保护组细胞内的 ATP 含量高于耗竭组。 耗竭 6 h 后，
Gly 保护组细胞的 LDH 释放率较耗竭组明显下降，MTT 吸光度也明显上升。 同时，ATP 耗竭后细胞甘氨酸受体表达上调，这种
上调趋势在使用甘氨酸后有所缓解。 结论：甘氨酸可保护 ATP 耗竭的 SH-SY5Y 细胞，并缓解细胞应激时甘氨酸受体的表达上
调。
［关键词］ 甘氨酸； ATP 耗竭； 甘氨酸受体； 细胞保护
［中图分类号］ R730
［文献标识码］ A
［文章编号］ 1007-4368（2009）08-1063-04
Cytoprotection of glycine on the ATP-depleted SH-SY5Y cells of neuroblastoma
（HEK293）系以及其他实验均显示［7］，甘氨酸主要 通 过细胞膜上的甘氨酸受体发挥保护作用［8］。 已知神经 细胞同样表达有甘氨酸受体，同时还普遍表达离子型 谷氨酸受体（NMDA 受体、AMPA 受体等），并且每个 NMDA 受体上具有两个甘氨酸的结合位点 。 ［9－10］ 大剂 量的谷氨酸受体激动剂会导致细胞的大量死亡［11］。 因 此，同为离子型谷氨酸受体的共激动剂，甘氨酸在 神经细胞中是否仍具有保护作用？ 这些问题目前尚 未见研究，本研究旨在探索甘氨酸对神经细胞的具 体作用。
2．2 细胞内 ATP 含量测定 如图 3 所示，阻断细胞能量供应后，3 h 内细胞
ATP 的含量逐渐从（27．75±0．81） nmol ／ mg 蛋白下降 至接近于 0。 加用甘氨酸保护后，与耗竭组相比，细 胞内 ATP 含量略有升高，30 min 时尤其显著， 具有 统计学差异。 45 min 后，两组 ATP 含量不再有统计 学差异。 2．3 甘氨酸受体的表达
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［摘 要］ 目的：观察甘氨酸（glycine，Gly）对 ATP 耗竭的神经母细胞瘤细胞 SH-SY5Y 的保护作用及其可能机制。 方法：通过乳