第3章高效液相色谱分析
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1．分析对象
GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，
高沸点、挥发性差、热稳定性差、 离子型及高聚物的样品不可检测 占有机物的20%
HPLC：溶解后能制成溶液的样品， 不受样品挥发性和热稳定性的限制 相对分子质量大、难气化、热稳定性差及高分子 和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80%
2．流动相差别
GC：流动相为惰性气体 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 HPLC：流动相为液体 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、 改善分离度增加了因素，对分离起很大作用 流动相种类较多，选择余地广 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性 3．操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小） 提高柱内填料装填的均匀性,减小粒度
2 3 1
3 3 1 5 1
5 4
5
蕹菜
冬苋菜
对照品
HPLC法测定中药辛弗林的含量
辛弗林
辛弗林
标准品色谱图
样品色谱图
HPLC法测定血清中延胡乙素的血药浓度
延胡乙素
延胡乙素
对照品色谱图
样品色谱图
HPLC分析银杏叶提取物中懈皮素及总黄酮的含量
懈皮素 懈皮素 山萘酚
异鼠李素
对照品色谱图
样品色谱图
MECC分离中药黄芩中六种黄酮类成份
肝组织样色谱图
标准色谱图
HPLC法测定健康人血清中的头孢唑啉(CEZ)
CEZ
健康人空白血清色谱图
给药后人血清色谱图
HPLC法测定肺癌患者血清中维生素A、维生素E 番茄红素、 β-胡萝卜素
VA VE VA VE L β L β
标准色谱图
血清样色谱图
HPLC法测定中草药提取物中紫杉醇的含量
紫杉醇
紫杉醇
二者均具分离能力高、灵敏度高、分析速度快，操作方 便等优点，但沸点太高的物质或热稳定性差的物质难以 用气相色谱进行分析。而只要试样能够制成溶液，既可 用于HPLC分析，而不受沸点高、热稳定性差、相对分子 量大的限制。
P109：解：二者都是根据样品组分与流动相和固定相
相互作用力的差别进行分离的。
从仪器构造上看，液相色谱需要增加高压泵以提高流动 相的流动速度，克服阻力。同时液相色谱所采用的固定 相种类要比气相色谱丰富的多，分离方式也比较多样。 气相色谱的检测器主要采用热导检测器、氢焰检测器和 火焰光度检测器等。而液相色谱则多使用紫外检测器、 荧光检测器及电化学检测器等。但是二者均可与MS等联 用。
Alliance
产品名称：液相色谱仪器
大连依利特 返回
四、HPLC的特点和应用
“三高” “一快” “一广”
高柱效(n=3万片/米), 柱效高（远高于一般LC） 高灵敏度(紫外检测器最小检出量达纳克级) 高压(150*105~350*105Pa) 分析速度快 应用范围广泛（可分析80%有机化合物）
三、高效液相色谱仪流程图
1．贮液器（滤去颗粒状物质） 2．高压泵（15000~35000KPa)流量稳定 及梯度洗提装置 3．进样装置 4．色谱柱——分离 5．检测器——分析 6．废液出口或组分收集器 7．记录装置
灵敏度高，重复性好 、线性范围宽、死体 积小以及对温度和流 量的变化不敏感
高效液相色谱仪的色谱柱
内径：4.6mm或3.9mm；长度：15~30cm
填料颗粒度：3~5μm 湿法匀浆装柱技术
不规则形填料
球形填料
HPLC 柱 = 空柱管 + 填料(分离介质)
价格?
空柱管: 200-300元 国产填料 国产装填 进口填料 国产装填 原装 进口柱
= 800-1000 元 = 1200-1500 元 = 2400-3000 元
柱内径1~3cm，固定相粒径>100μm 且不均匀 常压输送流动相 柱效低（H↑，n↓） 分析周期长 无法在线检测
2．HPLC：分离和分析
柱内径2~6mm，固定相粒径<10μm（球形,均匀装柱） 高压输送流动相 柱效高（H↓，n↑） 分析时间大大缩短 可以在线检测
二、HPLC与GC差别
相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 主要差别：分析对象的差别和流动相的差别
第三章
高效液相色谱分析
高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典 液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相 色谱法
一、HPLC与经典LC区别
二、HPLC与GC差别
三、高效液相色谱仪流程图
四、特点及应用
一、HPLC与经典LC区别 主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段 1．经典LC：仅做为一种分离手段
ATP
Crp
ATP Crp ATP
标准品色谱图
对照组色谱图
FDP组色谱图
HPLC法分析大鼠脑缺血再灌注后肌酸、腺苷和三磷 酸腺苷的含量变化
Cr
Cr
ADO
ATP
ADO
ATP
标准色谱图
脑组织样色谱图
HPLC法分析经缺血预处理后大鼠移植肝脏中 三磷酸腺苷的含量变化
AMP AMP
ADP
ATP
ADP
ATP
检测器：紫外光度检测器、荧光检测器、 示差折光检测器、电导检测器、 蒸发光散射检测器
高效液相色谱仪的生产厂家
Waters
Agillent Perkin Elmer 戴安 Varian 北京东西电子研究所 Shimadz 大连依利特公司
高效液相色谱仪LC-2010HT 岛津（香港）有限公司
新一代液相色 谱∶Alliance
AMP
Cr
AMP
ADP
Cr
ADP ATP
ATP
Crp
Crp
正常对照组Fig 2 (control group)
源自文库Cr
AMP
诱导后3天组(Hydrocephalus ofthe3day)
Cr
AMP ADP
ADP ATP
ATP
Crp
Crp
诱导后8天组 (Hydrocephalus of the 8day)
对照品色谱图
样品色谱图
大鼠尿中83-1除草剂及其代谢产物的HPLC分离图
4
*5
1
2
3
空白尿样
染毒尿样
大鼠肝微粒体中叶枯灵及其代射产物分离的HPLC色谱图
1
a
b
a. 对照组
b.样品组
大鼠肝灌流中叶枯灵、代谢产物及其内标的色谱图
*
(7)
*
*
二、食品、药物的分析
HPLC法测定9种蔬菜中的类胡萝卜素
HPLC应用
医药方面：生物组织 、血样、尿样分析，药剂组 分测定，药物生产控 制，药代研究。 生化方面：主要用于氨基酸、蛋白质、酶、糠尿。 食品方面：果汁，饮料，酒类等中的添加剂。 环境方面：饮用水，废水中质量标准的控制。 大气、土壤污染研究
一.生物样品的分析
狗脑积水不同时期脑组织中肌酸、磷酸肌酸及磷酸腺苷酸的含量变化
诱导后4月组(Hydrocephalus of the 4 month)
HPLC法分析心脏衰竭过程中黄连素对心脏 能量的保护作用
Cr Crp AMP
Cr
ADP
ATP
ADP AMP
ATP
Crp
标准色谱图
心肌样品色谱图
HPLC法分析人的心脏换瓣术中1，6-二磷酸果糖 对高能磷酸复合物含量的影响
Crp
GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，
高沸点、挥发性差、热稳定性差、 离子型及高聚物的样品不可检测 占有机物的20%
HPLC：溶解后能制成溶液的样品， 不受样品挥发性和热稳定性的限制 相对分子质量大、难气化、热稳定性差及高分子 和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80%
2．流动相差别
GC：流动相为惰性气体 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 HPLC：流动相为液体 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、 改善分离度增加了因素，对分离起很大作用 流动相种类较多，选择余地广 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性 3．操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小） 提高柱内填料装填的均匀性,减小粒度
2 3 1
3 3 1 5 1
5 4
5
蕹菜
冬苋菜
对照品
HPLC法测定中药辛弗林的含量
辛弗林
辛弗林
标准品色谱图
样品色谱图
HPLC法测定血清中延胡乙素的血药浓度
延胡乙素
延胡乙素
对照品色谱图
样品色谱图
HPLC分析银杏叶提取物中懈皮素及总黄酮的含量
懈皮素 懈皮素 山萘酚
异鼠李素
对照品色谱图
样品色谱图
MECC分离中药黄芩中六种黄酮类成份
肝组织样色谱图
标准色谱图
HPLC法测定健康人血清中的头孢唑啉(CEZ)
CEZ
健康人空白血清色谱图
给药后人血清色谱图
HPLC法测定肺癌患者血清中维生素A、维生素E 番茄红素、 β-胡萝卜素
VA VE VA VE L β L β
标准色谱图
血清样色谱图
HPLC法测定中草药提取物中紫杉醇的含量
紫杉醇
紫杉醇
二者均具分离能力高、灵敏度高、分析速度快，操作方 便等优点，但沸点太高的物质或热稳定性差的物质难以 用气相色谱进行分析。而只要试样能够制成溶液，既可 用于HPLC分析，而不受沸点高、热稳定性差、相对分子 量大的限制。
P109：解：二者都是根据样品组分与流动相和固定相
相互作用力的差别进行分离的。
从仪器构造上看，液相色谱需要增加高压泵以提高流动 相的流动速度，克服阻力。同时液相色谱所采用的固定 相种类要比气相色谱丰富的多，分离方式也比较多样。 气相色谱的检测器主要采用热导检测器、氢焰检测器和 火焰光度检测器等。而液相色谱则多使用紫外检测器、 荧光检测器及电化学检测器等。但是二者均可与MS等联 用。
Alliance
产品名称：液相色谱仪器
大连依利特 返回
四、HPLC的特点和应用
“三高” “一快” “一广”
高柱效(n=3万片/米), 柱效高（远高于一般LC） 高灵敏度(紫外检测器最小检出量达纳克级) 高压(150*105~350*105Pa) 分析速度快 应用范围广泛（可分析80%有机化合物）
三、高效液相色谱仪流程图
1．贮液器（滤去颗粒状物质） 2．高压泵（15000~35000KPa)流量稳定 及梯度洗提装置 3．进样装置 4．色谱柱——分离 5．检测器——分析 6．废液出口或组分收集器 7．记录装置
灵敏度高，重复性好 、线性范围宽、死体 积小以及对温度和流 量的变化不敏感
高效液相色谱仪的色谱柱
内径：4.6mm或3.9mm；长度：15~30cm
填料颗粒度：3~5μm 湿法匀浆装柱技术
不规则形填料
球形填料
HPLC 柱 = 空柱管 + 填料(分离介质)
价格?
空柱管: 200-300元 国产填料 国产装填 进口填料 国产装填 原装 进口柱
= 800-1000 元 = 1200-1500 元 = 2400-3000 元
柱内径1~3cm，固定相粒径>100μm 且不均匀 常压输送流动相 柱效低（H↑，n↓） 分析周期长 无法在线检测
2．HPLC：分离和分析
柱内径2~6mm，固定相粒径<10μm（球形,均匀装柱） 高压输送流动相 柱效高（H↓，n↑） 分析时间大大缩短 可以在线检测
二、HPLC与GC差别
相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 主要差别：分析对象的差别和流动相的差别
第三章
高效液相色谱分析
高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典 液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相 色谱法
一、HPLC与经典LC区别
二、HPLC与GC差别
三、高效液相色谱仪流程图
四、特点及应用
一、HPLC与经典LC区别 主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段 1．经典LC：仅做为一种分离手段
ATP
Crp
ATP Crp ATP
标准品色谱图
对照组色谱图
FDP组色谱图
HPLC法分析大鼠脑缺血再灌注后肌酸、腺苷和三磷 酸腺苷的含量变化
Cr
Cr
ADO
ATP
ADO
ATP
标准色谱图
脑组织样色谱图
HPLC法分析经缺血预处理后大鼠移植肝脏中 三磷酸腺苷的含量变化
AMP AMP
ADP
ATP
ADP
ATP
检测器：紫外光度检测器、荧光检测器、 示差折光检测器、电导检测器、 蒸发光散射检测器
高效液相色谱仪的生产厂家
Waters
Agillent Perkin Elmer 戴安 Varian 北京东西电子研究所 Shimadz 大连依利特公司
高效液相色谱仪LC-2010HT 岛津（香港）有限公司
新一代液相色 谱∶Alliance
AMP
Cr
AMP
ADP
Cr
ADP ATP
ATP
Crp
Crp
正常对照组Fig 2 (control group)
源自文库Cr
AMP
诱导后3天组(Hydrocephalus ofthe3day)
Cr
AMP ADP
ADP ATP
ATP
Crp
Crp
诱导后8天组 (Hydrocephalus of the 8day)
对照品色谱图
样品色谱图
大鼠尿中83-1除草剂及其代谢产物的HPLC分离图
4
*5
1
2
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空白尿样
染毒尿样
大鼠肝微粒体中叶枯灵及其代射产物分离的HPLC色谱图
1
a
b
a. 对照组
b.样品组
大鼠肝灌流中叶枯灵、代谢产物及其内标的色谱图
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(7)
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二、食品、药物的分析
HPLC法测定9种蔬菜中的类胡萝卜素
HPLC应用
医药方面：生物组织 、血样、尿样分析，药剂组 分测定，药物生产控 制，药代研究。 生化方面：主要用于氨基酸、蛋白质、酶、糠尿。 食品方面：果汁，饮料，酒类等中的添加剂。 环境方面：饮用水，废水中质量标准的控制。 大气、土壤污染研究
一.生物样品的分析
狗脑积水不同时期脑组织中肌酸、磷酸肌酸及磷酸腺苷酸的含量变化
诱导后4月组(Hydrocephalus of the 4 month)
HPLC法分析心脏衰竭过程中黄连素对心脏 能量的保护作用
Cr Crp AMP
Cr
ADP
ATP
ADP AMP
ATP
Crp
标准色谱图
心肌样品色谱图
HPLC法分析人的心脏换瓣术中1，6-二磷酸果糖 对高能磷酸复合物含量的影响
Crp