广西沼泽型水牛IL_1_基因的克隆及在发情周期内水平动态变化
转基因体细胞克隆水牛与广西水牛的遗传特性研究的开题报告
转基因体细胞克隆水牛与广西水牛的遗传特性研究的开题报告一、研究背景及研究意义随着转基因技术的不断发展，转基因体细胞克隆已经成为生物学及农业领域研究的热点之一。
在水牛的繁殖领域，水牛的繁殖效率普遍较低，且传统繁殖方法耗费时间长，效率低下。
转基因体细胞克隆技术可以大幅提高水牛繁殖的效率，并且使水牛品种更加丰富，适用于不同地区的农业发展。
因此，通过研究转基因体细胞克隆水牛与广西水牛的遗传特性，可以探究转基因技术在水牛繁殖领域的应用，为该领域提供新的思路和方法。
二、研究目的本研究的主要目的为：通过比较转基因体细胞克隆水牛与广西水牛的遗传特性，探究转基因技术对水牛遗传特性的影响。
三、研究内容1. 收集广西水牛和转基因体细胞克隆水牛的基因组数据，分析其基因组结构和基因型分布的异同；2. 分析两种水牛群体基因型多样性、遗传距离和群体遗传结构的差异；3. 比较两种水牛群体不同性状的表现型和基因表达谱的差异，探究转基因技术对水牛遗传特性的影响，分析其可能的遗传机制和生理生化基础。
四、研究方法本研究采用以下方法：1. 收集广西水牛和转基因体细胞克隆水牛的样本并提取DNA，利用高通量基因测序技术获得两个群体基因组数据；2. 利用比对技术对两个群体的基因组数据进行比对，分析基因型分布的异同、基因型多样性的差异等；3. 利用分子生物学技术分析两个群体基因型分布的异同、遗传距离及群体结构的差异；4. 筛选两个群体中代表性的性状进行跟踪观测，同时采集细胞和组织样本，利用基础生物学方法和生物信息学技术对转基因体细胞克隆水牛和广西水牛的表达谱进行测定和比较。
五、预期结果通过对比广西水牛和转基因体细胞克隆水牛的遗传特性，预计将得到以下结果：1. 转基因技术对水牛基因型的影响；2. 转基因技术对水牛表型和基因表达的影响；3. 转基因技术对水牛繁殖力和抗病能力的提高。
六、研究意义本研究将探究转基因体细胞克隆技术在水牛繁殖领域的应用，为推广该技术提供理论依据和实践指导。
水牛染色体gc带核型的观察
１对亚中部着丝点染色体及 １对亚端部着丝点 染色体组成，按相对长度递减排列，第 １，４，５号 是 中部着丝点染色体，第 ２号是亚端部着丝点 染色体，第 ３号是亚中部着丝点染色体。该组 各染色体容易识另曳
Ｂ组（６－２３）：由 １８对端部着丝点染色体 组成 ，按相对长度递减排列。
（二）Ｇ分带分析 通过对西林水牛和南宁水牛各 １３个细胞
伽 １４ ．
染 色体 编号
叹１ ︐乙 电Ｊ ４ １Ｉ ︸
染 色体 编号
︐ 且 ︐ ‘ 几ｊ ４ ～１沙
表 ３ 水牛染色体 臂比值
西 林 水 牛 ‘》 富 钟 水 牛 ｘ） 南宁水 牛，）
１．３７土 ０．１１ ３．０５＋ ０．４０ ２．３０土 ０．２８ １．５３士 ０．１８ １．５０士０．１６
１．３２＋ ０．０９ ３．２０士 ０．３６ ２．２６＋ ０．２１ １．６４土 ０．２９ １．５２士 ０．２９
互比较带型，这两种水牛的Ｇ分带基本一致。根 体属小型的端部着丝点染色体、但不是核型中
据Ｇ分带带型绘制了水牛染色体Ｇ分带模式图 最小的端部着丝点染色体，它的长度与Ｘ染色
（图 １）０
体长度的比值为 ０．３６３５，大于Ｂ组的 ２３号染色
（三）Ｃ分带分析
体（见表 ５）０
用西林水牛和南宁水牛各 １０个 ｃ分带照
１．２７士０．０８ ３．０６土０．４７ ２．２６士０．２０ １．４３士０．１６ １．５７士０．２２
表 ４ 水牛染色体， 丝点指数
西林水牛，》 富 钟 水 牛 幻 南 宁水牛，）
４２．２０士 １．８１ ２４．９８土 ２．３４ ３０．５８士 ２．４７ ３９．６６士 ２．８５ ３９．９０士 ２．９３
４３．０３士 １．６６ ２３．９６士２．１５ ３０．２４＋ １．４７ ３８．７２士２．４８ ４０．１０士３．９６
水牛发情周期生殖激素变化规律及唾液结晶的分析
中国畜牧兽医2019,46(4)：1101-1107China Animal Husbandry&Veterinary Medicine水牛发情周期生殖激素变化规律及唾液结晶的分析贾银海S李芳芳蒋世强3,李铭S徐文文S王国利S潘能庆3,杨秀荣"，蒋和生"(1广西大学动物科技学院，南宁530004%.广西壮族自治区畜禽品种改良站，南宁530021；3.广西巴弗罗牧业投资有限公司，南宁530003)摘要：试验对水牛发情周期血清和唾液中雌二醇(E2)和孕酮(巳)的浓度变化规律、水牛唾液结晶与卵泡发育变化分别进行了分析研究，为进一步探讨水牛发情规律、指导生产提供依据。
采用酶联免疫分析法(ELISA)测定发情母水牛血清和唾液中E2和P4的浓度变化,并对血清和唾液的激素变化规律进行相关性分析。
结果表明，水牛血清和唾液中的E2和P4呈波动性变化。
发情前期，唾液中P4浓度一直维持在6.50〜7.10ng/mL,发情第13天达到1109ng/mL,随后快速下降。
唾液中E?浓度在发情第3〜5天出现一个峰值17853pg/mL,在第14〜17天唾液中E2浓度显著升高，出现第二个峰值17910pg/mL&母水牛唾液中E?和P°浓度的变化趋势与其在血清中的变化趋势基本一致，均呈显著相关(P V0.05)；唾液中E2与巳浓度呈极显著相关(P V0.01)水牛发情当天唾液结晶呈现明显的蕨类作物形状且分维值显著低于其他时间点(P V0.05)水牛发情周期唾液结晶图形的变化与卵巢卵泡发育基本同步，可作为监测水牛发情及预测排卵的可靠指标之一&关键词：水牛；生殖激素；唾液结晶中图分类号：S814.1文献标识码：ADoi：10.16431/ki1671-7236.201904017The Variations and Correlation Analysis of Saliva Reproduction Hormones andCrystallization Patterns During Estrus Cycle in BuffaloesJIA Yinhai1,LI Fangfang2,JIANG Shiqiang3,LI Ming2,XU Wenwen1,WANG Guolf,PAN Nengqing3!YANG Xiurong1"!JIANG Hesheng1"(1.College of Animal Science and Technology,Guangxi Univer-Uy,Nanning530004,China；2.Guangxi Work Station of live-lock&Poultry Breed Improvement,Nanning530021,China；3.Guangxi Buffalo Husbandry Inee-tment Co.,Ltd.,Nanning530003,China)Abstract:The aim of the experiment was to explore the buffalo estrus and provide theoretical references for bu f alo production by studying the change laws of estradiol(E2)andprogesterone (P4)concentrationsduringestruscycleofsalivaryandserum investigatingthesalivaryferning and the development of ovaries in buffalo.The concentrations of E2and P4were determined by the enzymelinkedimmunosorbentassay(ELISA)inestruscycleandthecorrelationbetweentheser-umandsalivahormoneswereanalyzed$TheresultsshowthattheconcentrationsofE2andP4var-led fluctuantly.The concentration of saliva P4was maintained from6.50to7.10ng/mL at the be-ginningofestrus!0ndre0ched11.09ng/mL0t13dofestrusthenfe l f0st.Theconcentr0tionof收稿日期:2018-09-07基金项目：广西水产畜牧科技推广应用项目(桂渔牧科201633033^桂渔牧科201528001、桂渔牧科201528043)；南宁市科学研究与技术幵发计划项目(201721342);南宁市青秀区科学研究与技术幵发计划项目(2017039)作者简介：贾银海(1977-)，男，山西晋中人，博士，研究方向：动物遗传育种,E-mail:yinhail8@"通信作者：蒋和生(1962-)，男，广西桂林人，博士，研究方向：动物遗传育种,E-mail：hsjiang@杨秀荣(1979-)，女，广西桂林人，博士，研究方向：动物遗传育种,E-mail:xiurongyang09@1102中国畜牧兽医46saliva E2had two peaks,respectively at3-5d(178.53pg/mL)and1417d(179.10pg/mL)of estrus.The change trends of E2and P4levels in salivary and serum had the same change trends, the concentrations of salivary P4and E2had significant correlations with that in serum(P V0.05),while the salivary E2concentration also had a extremely significant correlation with thesalivaryP4concentration(P V0.01).Salivashowedatypicalfern-likecrysta l izationpa t ernsat 0dofestrus!withsignificantlylowerfractaldimensionvaluescomparedwiththeotherdaysofes-trus(P V0.05).Theresultswerealsoshowedthebasicsynchronizationbetweensalivacrysta l i-zationandovarianfo l icle.Inconclusionsalivacrysta l izationcouldbeusedasareliableindexfor monitoringestrusandpredictingovulationinbu f alo.Key words:buffalo；reproduction hormones；salivary crystallization水牛适应性强，肉和奶都具有较高的经济价值其与其他牛科动物相比繁殖率相对较低，发情外部症状和发情规律不明显，在印度有18%〜40%的水牛表现为发情不明显或者不育⑵。
沼泽型水牛发情周期生殖激素变化的研究
牛血清 中上述 生殖激 素的变化 规律及 其相互 关系 ， 为下一步结合 卵泡波 的分 析做 好理 论基础 。
１ 材 料 与 方 法
１１ 试 验 牛 的 选 择 ． 试 验 牛 选 自广 西 本地 区 的 生 殖道 机 能正 常 的沼泽 型 母水 牛 ， 青年 水 牛 ２ ３ ～ 岁， 体重 ３ ０ １ ｇ 经 产 水 牛 （ 少 已产过 一 ３ ￣４ ０ ｋ ， 至 胎 ） ． ～４ ０岁 ， 重 ３ ０ ９ ｇ ３５ ． 体 ７ ￣３ ０ ｋ 。 １ 试 验牛 的同期发 情处 理及所 用药 品 － ２ 所有 试
对较 高的水平 （ ０ ７ ． １ ７ ． ９ ±０２ ２ｎ ／ Ｌ ，第 １ ～１ ０ ８ ±０Ｏ ６ ～０２ ６ ． ８ ｇｍ ） ． ｄ呈明显的上升趋 势，之后迅速下降；Ｅ ３ ８ ２ 水平除在发情第 ２ 、２ 各 出现一个峰值 ，第 ２ ～２ 迅速升高外 ，其他时间基本恒定。 、１ ０ ３ｄ ０ ３ｄ
素 （ Ｈ 、 二醇 （ ２ 和孕酮 （ ４ Ｌ）雌 Ｅ） Ｐ ）的浓度 ， 析水 分
次， 记录 发情 时间 ， 发情 当天记为 第 ０天 。 １ 血 样 的 采 集 方 法 （ ） 血 部 位 ： 静 脉 ； Ｉ ４ １采 颈
（ ） 血 时间： Ｐ 理 的当天开始 ， 续采 到下 ２采 从 Ｇ处 连 次 发情 当天止 ，时间恒 定在 每天 上午 ８ ３ ～９ Ｏ ：０ ： ０ （ 发情 当天记 为第 ０天 ） 除发情 当天 每 隔 ４ ， ～６ ｈ 采血一 次外 ， 其他 时间 １ ／ ，０ ５ ｍ ／次 。 次 天 ｌ ～ｌ Ｌ １５ 血 清 的 制 备 与储 存 ． 血 样 采集 后 立 即置 于
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畜牧 兽 医科 技
２０ 年 （ ３ 卷） 期 ０８ 第 ３ 第
微卫星标记分析广西水牛遗传多样性
第27卷第1期Vol 127,No 11广西农业生物科学Journal of G uangxi Agric 1and Biol 1Scie nce2008年3月Mar 1,2008 收稿日期22; 修回日期8223。
基金项目国家863高科技研究发展计划项目(665);广西大学科研基金项目(X 66)。
作者简介崔奎青(52),女,山东菏泽人,广西大学讲师,博士;2q @x 11。
文章编号:100823464(2008)0120001206微卫星标记分析广西水牛遗传多样性崔奎青1,刘庆友1,李秀林1,黄银花2,王志强1,石德顺1,李宁2(1 广西大学动物科学技术学院,广西南宁530005;2 中国农业大学农业生物技术国家重点实验室,北京100094)摘要:为研究广西沼泽型水牛(B uba lus bubalis )核基因组的多态性,采用23对荧光标记微卫星引物,对随机抽取的60个广西本地水牛样本进行了PCR 检测。
结果表明,23对引物中,有19对可以获得特异性产物且存在多态,平均有效等位基因数为410189,基因座ILS TS086含有13个等位基因;各微卫星基因座的平均杂合度变化范围为011852～014722,ILS TS019基因座平均杂合度最高(014722),而IL STS017平均杂合度最低(011852);群体基因平均多态信息含量(PIC)为016639,19个标记中有18个P IC 大于015,属高度多态位点。
关键词:微卫星;水牛;遗传多样性中图分类号:S81312 文献标识码:AG enetic diver sity of buffa los in Guangxi ba sed onmicr osatellite mar ker s st udyCU I Kui 2qi ng 1,L IU Qi ng 2you 1,L I X i u 2l in 1,HU AN G Y i n 2hua 2,WAN G Zhi 2qiang 1,S HI De 2shun 1,L I Ni ng 2(1 College of Animal Science and Technology ,Guangxi University ,Nanning 530005,China;2 National Laboratory for Agribiotechnology ,China Agricultural University ,Beijing 100094,China )A bstract :Twent y t hree microsatellit e loci were sel ected to observe t he genet ic va riation ofG uangxi swamp buffalo population 1Ni neteen p ri mer pai rs amplified discret e product s a nd gave polymorphic band pat terns o n a pa nel of 60buffaloe s 1The mean eff ecti ve number of alleles pe r polymorphic marker wa s 410189,mean heterozygosit y per pol ymorp hi c marker ra nged from 011852t o 014722,mean polymorphi sm i nformation cont ent s (P IC)for Guangxi buffalo was 016639,ei ghteen microsatellit e loci di splayed hi gh polymorphi sm 1K ey w or ds :microsatellit e ;buffalo ;ge netic di ve rsi t y短片段重复序列(short tandem repeat ,STR ),也叫微卫星(mi crosatellit e )DNA ,广泛存在于人类及哺乳动物的基因组中,在哺乳动物进化中以不同的多态性位点存在于每一动物个体。
广西沼泽型水牛IL-1β基因的克隆及在发情周期内水平动态变化
中 国兽 医 杂 志 ２ １ ０ ０年 （ ４ 第 ６卷 ） ２期 第
２ ７
广 西 沼 泽 型 水 牛 Ｉ － 因 的 克 隆 Ｌｌ ｐ基 及 在 发情 周 期 内水 平 动 态 变化
内 注射 Ｉ－￣ 结 果如 同注 射促 性 腺 激 素 一样 ， 以 ＬＩ， 可 诱 发排 卵［ 。一 般 认 为 ，Ｌ １ ４ ］ Ｉ 一Ｂ对 妊 娠 具 有 促 进 作
用， 其合 成能力 与胚 胎 附值 成 功与否 呈正相 关Ｅ ， ｓ 它 ］
ＲＮＡ于 一８ ℃保存 备用 。 ０ １ ４ Ｉ 一ｊ基 因 ＲＴ Ｐ Ｒ 反应 ＲＴ反 应 体 系 ： ． Ｌ１ ３ —Ｃ 取
５Ｔ Ｔ Ｔ Ｃ ＇ Ｃ Ｔ ＡＧ ￣ＡＧ ＧＡ Ｇ Ｔ Ｃ一 由上 海捷瑞 － Ａ Ｇ ＧＴ Ｔ ３，
生 物 工 程 有 限公 司 合 成 ， 下 游 引 物 跨 度 为 ８ ４ｂ 。 上 ０ ｐ １ ３ 淋 巴 细 胞 的 分 离 培 养 、 导 及 总 ＲＮＡ 的 提 取 ． 诱
体外 试 验 过 程 中 ， 们 发 现 Ｉ 一 类 似 于 Ｌ 或 人 Ｌ１ Ｈ ｈ Ｇ可 以诱导 排 卵＿ ］ Ｃ １ 。在母 马 排 卵 时期 往 其 卵泡 。
ＲＮ １ｐ ， Ｌ Ｏｌ ｏ（ Ｔ ， 匀 后 于 ７ ℃ 水 浴 ５ Ａ ｔ １ ｉ ｄ ） 混 ｇ ｇ ０
既 能刺激 滋养 层细 胞 合成 和分 泌 孕 酮 ， 能刺 激 子 也
宫 内膜 上 皮 细 胞 合 成 Ｐ Ｅ Ｇ ２和 Ｉ 一 ， 调 节 动 物 生 Ｌ６ 来 殖 机 能 。 还 有 学 者 发 现 卵 巢 囊 肿 与 其 分 泌 水 平 密 切 相 关 ＿ 。 由 此 可 见 ，Ｌ ｌ在 动 物 的 生 殖 生 理 学 方 面 ６ ］ Ｉ— 有 着不可 忽视 的作用 。
广西沼泽型水牛IL-4和IL-5基因的克隆及其序列分析
９ ． ． ８４％ ａ ｄ５ ． ０４％ ７ ． ｎ ９６％ ａ ｎ ｃ ｏ ｌｇ ｔ ｏｅｏ ｕ ａ Ｉｄａ， ｏ ｉｅ ｓｅｐ ｐｇａ ｄｈ ｒ ，ｅｐｃｉ ｌ．Ｌ５ ｍｉ ａｉ ｈ ｍｏｏ ｗｉ ｔ ｓ ｆ ｆ ｌ ｎ ｉ）ｂ ｖｎ ， ｈｅ ， ｉ ｎ ｏｓ ｒｓｅｔ ｅｙ Ｉ－ ｏ ｄ ｙ ｈｈ ｂ ｏ（ ｅ ｖ
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第２卷 第 １ ９ ０期
２０ 年 ０７ ｌ 月 ０
中 国 预
防 兽
医 学 报
Ｖｏ ． ９ Ｎｏ １ １ ． ．０ ２ Ｏｃ． ２ ０ ｖ ｎ ｉ ｅ Ｖｅｅ ｎ ｒ ｅ ｉ ｉ ｅ ｉ ｅ ｅ Ｊ ｕ ｎ ｌ ｆＰ ｅ ｅ ｔ ｔｒ ａｙ Ｍ ｄ ｃｎ ｖ ｉ
氨 基 酸 水平 的 同源 性 分 别 为 ９ 、 ７８％、９ ． ６２％、 ８ ． ５９％和 ８ 、 ６７％。本 研 究 为进 一 步 了解 水牛 Ｉ ． Ｌ４和 Ｉ． Ｌ ５的 结 构 和
水牛 免 疫 学特 性 奠 定 了基 础 。 关键 词 ：沼 泽 型 水牛 ；单 个核 细 胞 ；Ｉ．；Ｉ－；克 隆 ；测 序 Ｌ４ Ｌ５ 中 图分 类 号 ：Ｑ ８ ７５ 文 献 标 识 码 ：Ａ 文章 编 号 ：ｌ０ ．５９２０ ）００６ ． ０８０８ （０７ ｌ．７８０ ５
Ｐ ＢＭ Ｃｓ ｉｃ ｂ ｔ ｄ ｆ ｒ９ ｈ ａ ｄ ｌ ｈ ｒ ｓ９ ． ％ ， ９ ３ ％ ， ４ １％ ， ４． ％ ， ０ ６ ％ ｎ ｃ ｅ ｔ ｅ ｈ ｍｏ ｏ ｙ ａ ｄ ９ ． ｎ ｕ ａ ｅ ｏ ｎ ｈ ｓ ａ ｅ ８ ８ ７ ９ ． ９ ． ８ ８ ８ ． ｕ ｌｏ ｉ ｏ ｌ ｇ ｎ ６ ３％ ， ８ ５ ％ ， ｄ ９．
（ ｏｌ ｅｏ ｎｍａ Ｓ ｉ ｃ ｎ ｅｈ ｏｏｙ Ｇ ａ ｇ ｉ ｎｖｒｉ ， ｎ ｉｇ５ ０ ０ ， ｉａ Ｃ ｌ ｇ ｆＡ ｉ ｌ ｃｅ ｅａ ｄＴ ｃｎ ｌｇ ， ｕ ｎｘ ｉｅｓｙ Ｎａｎｎ ３ ０ ５ Ｃｈｎ ） ｅ ｎ Ｕ ｔ
沼泽型水牛发情期血清生殖激素的变化规律研究
果表明 ： 同期发情的水牛在 处理 后至发情 当天均有 ２个 Ｅ 峰 出现 ， １个在发 情前 ， ２个在发 情后并与 Ｌ ① 第 第 Ｈ
峰 同时 或 之 前 ２ｈ ② Ｐ Ｇ（ 注） Ｐ 肌 注） ； Ｍｓ 肌 ＋ Ｇ（ 处理 的 水 牛 出现 发 情 前 Ｅ 峰 、 情 后 Ｆ Ｈ 峰 和 Ｌ 峰 的 时 间 为 处理 发 Ｓ Ｈ
比 ， 期 发 情 处 理 可 显 著 影 响 其 友 情 期 的 Ｆ Ｈ 和 Ｌ 内 源性 分 泌 水 平 （ ００） 而 对 Ｅ 和 Ｐ 均 没 有 产 生 显 著 性 同 Ｓ Ｈ Ｐ＜ ． ； ５ ：
的 变 化 （ ＞ ００ ） Ｐ ．５。
关 键 词 ： 殖激 素 ； 情 期 ； 牛 生 发 水 中 图 分 类 号 ： ８３３ ￥２． 文 献 标 识 码 ：Ｂ 文 章 编 号 ： ２８ ７３ （ ０ ８ ０ — ０ ８ ０ ０ ５ — ０ ３ ２ ０ ）５ ０ １— ３
等… 究 了 Ｐ Ｆ 研 Ｇ 处 理对 水牛血 清孕 酮（ ４的影 响 ， Ｐ） Ｒ ｏ ｆ 定 了水 牛 Ｐ 水 平 在 不 同 季节 的浓 度值 ， ａ等 ２ ］ 测 ４ Ｋ ｎｉ ３ 究 了水牛 发情周 期促 黄体 素（ Ｈ） 雌二 ａａ 等ｆ Ｊ 研 Ｌ 、 醇 （ 和 Ｐ 的变 化情 况 ， ｏ ｌ等ｆ 究 了水 牛 Ｌ Ｅ） ４ Ｍ ｉｉ ４ ｏ ］ 研 Ｈ 峰 与排 卵 的关 系 ， 以及 王祖 昆 等［ 究 了水 牛性 周 ５ ］ 研 期血清性 激素 的变 化规律 ，但对 沼泽型水 牛发情 期 促卵泡 素 （Ｓ 、Ｈ、： Ｐ 变 化规律 的研 究报 道 Ｆ Ｈ） Ｌ Ｅ 和 ４ 还 很少 。因此 ，本研 究对不 同繁殖 状态下 的沼泽 型
水牛催乳素受体基因克隆及序列分析
Ｊ 急 盔 Ａ ． Ｂ ｉ。
文 章 编 号 ：１ ０ ３ ６ （ ０ ８ ０ ０ ２ — ５ ０ ８— ４ ４ ２ ０ ） ４— ３ ０ ０
水 牛 催 乳 素 受体 基 因克 隆及 序 列 分 析
下 一 步 实 验 检 测 体 外 培 养 的水 牛 乳 腺 上 皮 细 胞 中催 乳 素 受 体 基 因 的 表 达 水 平 。根 据 已 报 道 的 奶 牛 催 乳 素 受
体 基 因 ｃ Ａ 序 列 的保 守 区 ，设 计 一 对 特 异 性 引 物 。提 取 广 西 本 地 水 牛 的 乳 腺 组 织 总 Ｒ ＤＮ ＮＡ，并 以其 为 模
ｗｅ ｅ ｆ ｕｒ ｒ ｏ ｎｕ ｌｏｔｄ ｓ ｃ ｅ ｉ ｅ ｍｕｔ ｔｏ ｏｃ ｕ ｒ ｄ ｎ ｈ ｓ ｇ ｎｇ ｅ ｔｄ ｏ ＰＲＬＲ， ａ ｄ ｎｅ ｗａ ｎ ｎｓ ｎｓ ａ ｉ ｎｓ ｃ ｒ ｅ ｉ ｔ ｅ ｉ ｎｉ ｐ ｐ ｉ ｅ ｆ ｎ ｏ ｓ ｏ ｅ ｅ ｍｕｔ ｔｏ ．Ｔｈ ｓ ｒ ｅ ｈａ ｈ ｅ ｕｅ ｅ ｉ ｗａ ａ ｉｎ ｅ ｅ ｐ ｏｖ ｄ ｔ ｔｔ ｅ ｓ ｑ ｎｃ ｓ ｓ ｍｐ ｂｕｆａ ｏ ｐ ｏ ａ ｔｎ ｒ ｃ ｐｔ ｅ ． ｆ ｌ ｒ ｌ ｃ ｉ ｅ ｅ ｏｒｇ ｎｅ
板 ， 以下 游 特 异 性 引 物 为 反 转 录 引物 ，在 反 转 录 酶 （ ＡＭＶ） 作 用 下 合 成 ｃ ＮＡ 用 Ｅ — ａ Ｄ ｘＴ ｑ酶进 行 Ｐ Ｒ扩 Ｃ 增 ，得 到 催 乳 素 受 体 基 因 的保 守 序 列 ，长 度 为 ５ １ｂ 。该 扩 增 产 物 经 纯 化 后 ，连 接 到 ｐ ７ ｐ ＭＤ１一 载 体 上 扩 ８Ｔ
朱佳 杰 ，何荆洲 ，王新平 ，蒋钦杨 ，冯 雪萍 ，郭亚芬 ，兰干球 ，韦英 明，蒋 和生
沼泽型水牛发情周期卵泡发育波的发育动态观察
像打 印机 ， 子宫灌 液枪 ， 医用超声耦合 剂 。
牛处 理之前 经直肠检
查， 有功能黄体 的青年母 水牛 ８头 ， 经产母 水牛 ４头用
于试验 。实验牛先肌 肉注射 Ｐ Ｇ ｌ ０ ２ ＭＳ ０ ０Ｉ ４ｈ后肌 Ｕ，
试 验牛 选 自广西 本地 区 的沼泽 右 观察 ， 连续 观察一 个情期 。 每天均 记录 卵巢 上卵泡 的个数 并测量 其大小 。 Ｉ － 统计 分析 Ｉ４ ４ 各 数据 之 间差 异 显著性 检 验 采用
１１ 实 验牛 的选择 ．
型 水牛 ， 年母水 牛年龄 ２３岁 ， 青 ～ 体重 ３０４０ｋ ， ３～ １ ｇ经
１ 材料 与方法
上 、下午各 １ 次观察母 水牛 的发情情 况 ，记 录发情时 １ ． 实验 牛 的卵泡 发育 动态 观察 注 射 Ｐ ｃ的 当 ．３ ４ Ｇ 天开 始 ， Ｂ超观察 卵泡发育 情况 ， 母牛 发情期 ， 用 在 每
１ ２ｈ观察 １ ， 到排 卵 ， 次 直 其余 时间 每 天早 ０ ：０左 ９０
中固毫 患 囝 徽东
摘
１０ ６ ３０ ２）
要 ： Ｂ 型超声波观察 ９ 用 一 头沼泽型母水牛的 卵泡发育动态 ， 沼泽型母水牛 的发情周期 由 ２ 发现 个或 ３ 个卵泡发
育波（ 简称 卵泡波） 组成， ２个卵泡波为主 。 ２个卵泡波的母 水牛 中， 以 在 波的长度 为 １。 ， ９ ９ｄ 青年牛 第 １２波分别在发 ２ 、 情周期 的第 １ ５ ９ ５天 出现 ， １２波征集 、 ． 、。 ２ ７ 第 、 选择 的卵泡数分别为 ６ ５３２ 。 、． ２ ５和 ５ ２ 、． ； ． ５３ ７ ５个 经产牛第 １２波分别在 、 第 １ 、 １． 天 出现 ， ．第 ２ ３ ０ ３ 其征集、 的卵泡数分别为 ８ 、． 和 ６ ７４ ３个。 选择 ． ４ ７ ． 、。 ０ ６ ６ ３ ３个卵泡波的母水牛， 波的长度为 ２ ｄ３个 ３ ， ５ 波分别在发情周期的第 １ 、．和 １．天 出现 ， ． ８０ ５ ５ ５ 征集 、 选择的 卵泡数 分别为 １．、．，２ 、， １ ．、。 １ ４ １． ４ ０ ０ ５ ５和 ２ ５ ０ ５个。以上这些
广西水牛唾液和血清生殖激素在发情周期的变化规律及相关性分析
科 学试 验
广 西 水 牛 唾 液 和 血 清 生 殖 激 素 在 发 情 周 期 的 变 化 规 律 及 相 关 性 分 析
贾银 海 ，莫 志 辉 ，潘 能 庆 ，徐 文 文 ，蒋世 强。，邓 辉 ，杨 秀 荣卜 ，蒋和 生
较 好 。母 水牛唾 液 和血 清样 品的 Ｐ４浓度 相 关性 显 著 （Ｒ一０．４０８０；Ｐ＜０．０５），母 水 牛唾 液
和 血 清 标 本 的 Ｅ２浓 度 相 关 性 显 著 （Ｒ一０．５１ｌ３；Ｐ＜ ０．０５）母 水 牛 唾 液 Ｅ２和 Ｐ４浓 度 相 关 性
非常 显著 （Ｒ一０．７７５４；Ｐ％０．０１）。［结论］唾 液和 血液 中的这 两种激 素水 平起 伏 变化基 本 趋
水 牛 是我 国 的主 要 畜 种 之 一 ，全 国水 牛 的分 布 又 以广 西 居首 。水 牛 属 于 单 胎 动 物 ，但 因 其适 应 性 强 ，肉和奶 具有 较高 的经 济价 值而 受 到普遍 关 注ｌ１］。 与 其他 牛科 动 物相 比繁 殖 率 相 对较 低 ，其 表 现在 发 情 外部 症状 和发 情规 律不 明显ｌ２］。影 响水牛 繁 育 的 因素很 多包 括 营养 、管 理 、气 候 环境 、年份 或 季节 和 疾 病等 ［３］。应用 现代 辅助 生殖 技术 也不 能有 效 的提 高 水牛 的妊 娠率 ＿４］，因此 ，掌握 有效 的水 牛发 情 鉴定 及 最佳 配 种时 间 的确定在 水 牛生产 中具有非 常 重要 的意义 。 目前 国内 外 主要 是 通 过 测 定 水 牛 血 液 ］、 尿 液［６］、粪便 等 中 的激 素 水平 来 对 水 牛 的发 情 进 行 鉴定 。但 血液 样 本 的采 集 难 度较 大 ，若 操 作 不 当 会 给水 牛造 成生 理 上 的伤害 和各种 应 激反应 。祝 晓 丽 等＿８］对 广 西沼 泽型水 牛 发情 淡季 的生 殖激 素 的变 化 规律 进行 了研 究 ，发现 水 牛血 样 中 Ｅ２和 Ｐ４呈 波 动性 变 化 ，且 存 在 显 著 性 相 关 。谢 炳 坤 等［５ 对 广 西 黄 牛和 水牛 发情 周期 血清 生殖 激素 变化 规律 进行 了 研究 ，发现 与 自然发 情 的水 牛相 比 ，水 牛 同期 发情 处
水牛甲状旁腺素1受体基因CDS区克隆与生物信息学分析
驼 同源 性 比对 结 果 显 示 ，其 同 源 性 分 别 为 ９９．４ 、９３．２ 、９３．５％ 、９５．３ 、９８．１ 和 ９３．９ ，物 种 之 间 同 源 性 较 高 ，
进 化 树 分 析 结 果 与 其 亲 缘 关 系远 近 一 致 ，表 明 水 牛 ＰＴＨＩＲ 基 因 编 码 区 在 进 化 过 程 中 比较 保 守 。蛋 白理 化 性 质 分
上 所 述 ，ＰＴＨ１Ｒ 基 因 编码 区在 长期 生 物进 化 过 程 中具 有 较 强 的 保 守 性 ，ＰＴＨ ＩＲ 基 因 的成 功 克 隆 及 分 析 为 进 一 步
揭 示 其 遗 传 特 性 提 供 了理 论 依 据 。
关 键 词 ：水 牛 ；甲状 旁 腺 素 １受 体 （ＰＴＨ１Ｒ）基 因 ；克 隆 ；生 物 信 息 学 分 析
定 蛋 白 。脂 肪 系 数 为 ８８．６１，总 平 均 亲 水 性 为 ０．００７，该 蛋 白属 于 不 可 溶 性 蛋 白 。二 级 结 构 分 析 显 示 ，水 牛 ＰＴＨＩＲ
基 因蛋 白 中包 含 有 ２１８个 螺旋 、１１４个 延 伸 链 、４４个 ８一转 角 、２１３个 无 规 则 卷 曲 ，与 三 级 结 构 预 测 结 果 相 一 致 。综
中 图分 类 号 ：Ｑ７８
文 献 标识 码 ：Ａ
文 章 编 号 ：１６７１－７２３６（２０１８）０２—０２９１－１１
Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ ａｔｉｃｓ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｎ ＰＴＨ １Ｒ ｇｅｎｅ ＣＤＳ ｉｎ Ｂｕｆｆａｌｏ
ＬＵ Ｘｉｎｇｒｏｎｇ，ＬＩＡＮ Ｇ Ｘｉａｎｗｅｉ，ＬＩＡＮ Ｇ Ｓｈａｓｈａ，ＤＥＮ Ｇ Ｔｉｎｇｘｉａｎ，ＤＵ ＡＮ Ａ ｎｑｉｎ， Ｍ Ａ Ｘｉａｏｙａ，ＰＡＮＧ Ｃｈｕｎｙｉｎｇ
中国水牛分子育种的研究进展
中国水牛分子育种的研究进展马云;白芳;左春生;宋新强;马慧芳;李爱民【摘要】概述了中国水牛分子育种的研究进展,包括水牛遗传的多样性和起源研究,产奶性状、免疫功能、繁殖性状基因的研究,功能基因的克隆与分析以及生产性能的微卫星标记等方面的内容.指出目前中国水牛分子育种研究中存在的问题,并展望了水牛分子育种的前景.%Progress on molecular breeding for Chinese buffalo,including the buffalo and the origin of genetic diversity studies,milk production traits,immune function,reproductive traits gene research,cloning and functional analysis,and production performance of microsatellite markers and so on were summarized in this paper.The problems and prosbect of the molecular breeding research progress for water buffalo were pointed out.【期刊名称】《德州学院学报》【年(卷),期】2012(028)002【总页数】6页(P63-68)【关键词】水牛;分子育种;研究进展【作者】马云;白芳;左春生;宋新强;马慧芳;李爱民【作者单位】信阳师范学院生命科学学院,河南信阳464000;信阳师范学院生命科学学院,河南信阳464000;信阳农业高等专科学校动物科学系,河南信阳464000;信阳师范学院生命科学学院,河南信阳464000;信阳师范学院生命科学学院,河南信阳464000;西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌712100【正文语种】中文【中图分类】O157.5自从对中国水牛开展分子遗传学研究以来，研究的功能基因已超过40个，研究的内容涉及功能基因的编码序列和非编码序列.编码序列主要包括与中国水牛的产奶性状，免疫功能，繁殖性状等相关的基因，非编码序列包括微卫星DNA序列和线粒体DNA的D－Loop序列.本文就现阶段我国水牛分子育种方面的研究进展作一综述，以期为中国水牛起源进化和遗传多样性提供科学依据，同时也为水牛遗传资源保护及定向育种提供基础资料.1.1 水牛产奶性状相关基因的研究进展关于中国水牛产奶性状的候选基因研究较多，主要涉及GH、GHR、DGAT1、PRL、PRLR、STAT、α－乳清蛋白基因等多个功能基因.耿荣庆等［1］发现GH除了能加快肌肉骨骼的生长外，还能参与调节性腺的发育成熟.王锦等［2］发现水牛和黄牛的GH－intron3和GH－extron5基因片段存在的差异可能会引起产奶性状的不同.Yuan等［3］克隆并通过SSCP检测到DGAT1全基因组序列中的7个多态性位点.Tantia等［4］发现印度水牛的DGAT1基因为K232（K232A）等位基因型，这两个非保守性的突变与奶中高脂肪产量，高乳脂率和蛋白率有关.朱佳杰等［5］使用RT－PCR技术，第一次扩增出广西本地沼泽型水牛PRLR基因部分保守序列，与奶牛相比，形成4个氨基酸变异.但这些变异与乳房发育，产奶功能的关系尚不清楚.杜挺媛等［6］发现PRL 基因的第三外显子可能是影响产奶和繁殖性能的关键部分.有研究显示，STAT1的一个SNP的突变C显著增加奶业协作组织DNA样本库奶牛的乳脂率和乳蛋白率.但此基因在水牛身上的研究尚未获得突破性的进展.研究发现水牛奶中α－乳清蛋白的含量比普通牛高出一倍多［7］.樊宝良等［8］克隆了水牛α－乳清蛋白基因的部分序列，与牛的相应序列相比存在一些碱基差异.姜一等［9］对水牛α－乳清蛋白基因的3′端调控区进行了PCR扩增及重组质粒的酶切鉴定.刘建忠等［10］克隆并测定了水牛α－乳清蛋白全基因的核苷酸序列，发现在5′调控区发生的多处突变可能与水牛乳汁中α－乳清蛋白的高水平表达有关.Dlugos CA等［11］发现在α－乳清蛋白基因片段上存在串联重复拷贝，也可能与水牛奶中高乳清蛋白含量有关.A.M.H.等［12］采用PCR－RFLP技术，对水牛κ－酪蛋白基因的研究结果显示，只有纯合的BB基因.1.2 水牛免疫功能相关基因的研究进展关于免疫功能相关基因的研究主要集中在白细胞介素受体（interleukine，IL）基因和干扰素（interferon，IFN）基因.白细胞介素和干扰素在抗肿瘤、抗病毒、免疫调节及感染性疾病的治疗中具有重要作用［13，14］.阳玉梅等［15－18］采用常规PCR和RTPCR技术，分离出水牛的IL－2、IL－4、IL－5、IL－10、IFN－γ、IL－18和IFN－α基因.李恭贺等［19］扩增出了IL－lp基因的完整编码区，有16处的核苷酸位点发生了突变.史喜菊等［20］从福安和富钟水牛基因组中克隆了IFN－α基因，并从中发现了BoIFN－αI和BoIFN－αJ两个亚型.徐贤坤等［21］将水牛IFN－γ基因亚克隆至PGEX－6P－1中，采用ELISA和Western－blot试验鉴定，结果显示，获得的重组蛋白具有良好的免疫活性.Sukumar等［22］通过体外诱导，分离出水牛的GNLY／NK－lysin（NKL）基因，并对其表达机制进行研究，证明GNLY／NK－lysin（NKL）在水牛的免疫反应起重要作用.1.3 水牛繁殖性状相关基因的研究进展在中国水牛繁殖性状的研究中，目前主要是针对牛的双胎性状开展了一些研究.涉及的基因主要有FSH、FSHR、FS、INH－α亚基基因等.陈宝剑等［23］发现广西沼泽型水牛与印度水牛的FSH－β亚基cDNA序列的同源性达99%.牛金涛等［24］用PCR扩增合成的FSHR基因5′端侧翼序列片段在720bp处有1个碱基缺失，可能与水牛FSHR基因的转录启动和表达调控有关.邓继贤等［25］通过RT－PCR技术扩增得到的水牛的FS cDNA序列有两处氨基酸的突变，这些突变可能影响到FS正常的生物学功能发挥以及水牛的繁殖机能.谢体三等［26］采用RT－PCR方法扩增得到水牛的INH－α亚基基因序列，并对其进行原核表达.为深入研究抑制素对FSH的反馈调节机制以及利用水牛INH－α亚基基因提高繁殖力提供了基础.O.Suneel等［27］分离出摩拉水牛的CYP19基因，SSCP结果显示，在exon2上发生了突变，为预测水牛发情期，降低不孕率提供基础.在中国水牛上，一些基础研究也在不断深入，特别是对一些重要功能基因的分子遗传特征、功能和表达的研究.农微等［28，29］首次扩增出扮演信号分子的Ia型内源性配体（Ghrelin）成熟蛋白编码cDNA序列.并发现Ghrelin可促进水牛体外受精和孤雌激活胚胎囊胚的形成.李恭贺等［30］扩增得到的水牛Ghrelin cDNA片段与黄牛前原Ghrelin基因仅有6个碱基的差异.Hua等［31］对影响性别的SRY 基因5′侧翼序列进行初步分析表明，SRY基因的核心启动子位于其5′侧翼310bp 富含GC区.付强等［32］证明SRY基因为雄性特异.张毅等［33］对比中国沼泽型水牛和河流型水牛SRY基因序列，存在1个错义意突变G／C，沼泽型水牛为G，河流型水牛为C.Saket K等［34］从水牛cDNA中成功的分离出MHC－DQA1和MHC－DQA2基因，并证实了它们为非等位基因.Miao Y等［35］发现水牛MC1R基因中的河流型等位基因EBR或携带c.310A（p.104S）的等位基因与其黑色表型相关.袁志栋等［36］首次报道了克隆、分析水牛朊蛋白成熟片段基因，为疯牛病的研究奠定了基础.李秋玲等［37］对4个品种151头牛的UCP3基因的多态性及其与血清生化指标的相关性研究结果显示，在两个水牛品种上优势基因型AA略占优势.Strazzullo M等［38］用比较基因法获得水牛的MYOD1和MYF6基因序列，并对MYOD1基因的多态性进行检测，为水牛肌肉功能基因的研究提供基础.Yindee M等［39］对水牛Y染色体上的DBY、ZFY和SRY基因片段分析的结果显示，江河型和沼泽型水牛起源不同.微卫星DNA在水牛中的研究较多，但这些研究大多数用于分析水牛的亲缘关系和起源进化，与生产性状相关联的分析研究较少.张毅等［40］对海南兴隆水牛47个样品30个微卫星座位检测发现，26个微卫星座位具有多态性.杨泽宇等［41］对德宏水牛81个个体的15个微卫星座位进行检测，发现德宏水牛群体遗传多样性较丰富.刘庆华等［42］对4个福安水牛群体的微卫星标记结果表明，福安水牛也具有较丰富的群体遗传多样性.许明等［43］对峡江水牛、海子水牛、西林水牛、恩施山地水牛、江汉水牛及一个对照群体尼里一拉菲水牛进行聚类分析，提出了群体间亲缘关系的远近与其所处地理位置远近紧密相关.田强等［44］分析得到贵州6个地方水牛群体的遗传多样性较高，且黔南水牛与毕节水牛之间的遗传距离最远.崔奎青等［45］对60个广西本地水牛样本进行检测，23对引物中，有19对可以获得特异性产物且存在多态.王冬蕾等［46］应用13个微卫星标记结合荧光－多重PCR技术，对8个品种水牛进行遗传结构分析，发现7个群体具有特有的等位基因，有11个座位为高度多态位点.田强等［47］还提出了贵州白水牛是其产地的普通水牛群的一个突变群.张毅等［48］对沼泽型水牛群体、河流型水牛品种和杂交水牛群体研究分析表明，中国水牛总体上具有纯正的沼泽型水牛血统.中国水牛分子育种多态性研究较多，主要是在线粒体DNA（mtDNA）和细胞色素b（Cytb）上.陈智华等［49］利用PCR－RFLP方法，对德昌水牛DRB3基因第二外显子进行检测，结果表明，德昌水牛具有10种基因型，具有丰富的遗传多态性.齐国强等［50］在我国10个地方水牛品种110个个体的mtDNA D－loop区序列上共检测到107个核苷酸多态位点，提出中国水牛可能有两个母系起源.谢文关等［51］用PCR扩增、测序和生物信息学方法检测中国水牛21个群体232条线粒体DNA D－loop全序列，和齐的结果一致.同时他认为还可以细分为B1和B2两个亚支.谢文美等［52］发现涪陵水牛mtDNA具有丰富的遗传多样性，并发现存在沼泽型水牛支系A和B.刘若余等［53］对30头温州水牛的研究也得到了与谢相似的结果.蔡欣等［54］的研究结果表明，水牛基因Cytb序列中碱基A和T的含量较高，中国水牛和沼泽型水牛具有较近的亲缘关系，也可能有2个或者2个以上的母系起源.张春梅［55］对29头德宏水牛的Cytb全序列的测序和分析，表明德宏水牛具有丰富的遗传多样性，德宏水牛可能起源于2个母系.李世平等［56］对18头海子水牛CytbZH基因全序列的分析也显示，海子水牛可能存在两种甚至更多不同的母系起源.这些多态性的研究结果在中国水牛的起源问题上是大致相同的.中国水牛分子育种研究已取得较大进展，获得了许多关于中国水牛分子遗传特征的信息，也发现了一些与生产性状有关联的功能基因和基因类型，为今后中国水牛的进一步研究奠定了一定的基础.但是，中国水牛分子育种研究目前还处于起步阶段，存在系统性不够、研究经费不足、群体的稳定性差等问题.随着分子生物学研究的不断深入，分子育种将在水牛的研究中得到广泛的应用，从而加快水牛的育种进程，大大提高水牛奶用和肉用性能，有望成为未来水牛新品种培育和品种改良的主要工具之一.【相关文献】［1］耿荣庆，王兰萍，冀德君，等.牛生长激素基因（BGH）编码区的遗传变异特征［J］.云南农业大学学报，2009，24（4）：494－496.［2］王锦.水牛产奶数量性状基因多态性研究［D］.南宁：广西大学，2008.［3］YuanJ，zhouJ，dengX，et al.Molecular cloning and single nucleotide polymorphism detection of buffalo DGTA1gene［J］.Biochem Genet，2007，45（7－8）：11－ 21.［4］Tantia M S，Vijh R K，Mishra B P，et al.DGAT1and ABGG2polymorphism in Indiancattle（Bosindicus）and buffalo（Bubalus bubalis）breeds［J］.BMC Vet 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沼泽型水牛VASA基因启动子的克隆及转录活性检测
沼泽型水牛VASA基因启动子的克隆及转录活性检测段安琴;庞春英;朱鹏;邓廷贤;陆杏蓉;陈明.棠;杨炳壮;梁贤威【摘要】[目的]克隆沼泽型水牛VASA基因5'侧翼序列,对启动子进行生物信息学分析及转录活性检测,为后续水牛繁殖性能的分子机理研究奠定基础.[方法]根据GenBank已公布的河流型水牛(Bubalus bubalis)的VASA5'侧翼序列,经过同源比对,设计PCR引物.以沼泽型水牛血液基因组为模板扩增VASA基因5'侧翼序列并进行测序和生物信息学分析.将扩增的VASA基因5'侧翼片段插入pEGFP-1多克隆位点处,构建pVASA-EGFP-1载体.载体经脂质体转染HEK-293T和CHO细胞系,分析其转录活性.[结果]成功克隆沼泽型水牛VASA 5'侧翼序列及部分CDS区序列,共3 081 bp,同源性分析表明,沼泽型水牛VASA基因5'侧翼序列与河流型水牛、黄牛、绵羊、山羊、小鼠和人的相似性分别为99％,96％,93％,95％,90％和79％.对其5'侧翼序列2 000 bp进行启动子预测及转录因子结合位点预测,发现在其翻译起始位点上游-635-586处存在TATA box,启动子区存在Nobox、Stat1、Stat3、Stat4、Stat5a、Stat5b、Stat6、Gata3、Smad2、Smad3和Smad4等反式作用因子结合位点,其中Stat家族基因在VASA启动子区存在多个结合位点,且同一位点又存在多个Stats基因结合的情况.水牛VASA启动子能启动EGFP在HEK-293T细胞中的表达,但非常微弱;能启动EGFP在CHO细胞中表达,且启动活性与CMV启动子相似.[结论]成功克隆了沼泽型水牛VASA基因启动子,分析了其启动子序列特征并成功验证其组织特异性和转录活性.【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2016(044)011【总页数】8页(P8-14,22)【关键词】沼泽型水牛;VASA基因;生物信息学分析;转录活性【作者】段安琴;庞春英;朱鹏;邓廷贤;陆杏蓉;陈明.棠;杨炳壮;梁贤威【作者单位】中国农业科学院广西水牛研究所广西水牛遗传繁育重点实验室,广西南宁530001;中国农业科学院广西水牛研究所广西水牛遗传繁育重点实验室,广西南宁530001;中国农业科学院广西水牛研究所广西水牛遗传繁育重点实验室,广西南宁530001;中国农业科学院广西水牛研究所广西水牛遗传繁育重点实验室,广西南宁530001;中国农业科学院广西水牛研究所广西水牛遗传繁育重点实验室,广西南宁530001;中国农业科学院广西水牛研究所广西水牛遗传繁育重点实验室,广西南宁530001;中国农业科学院广西水牛研究所广西水牛遗传繁育重点实验室,广西南宁530001;中国农业科学院广西水牛研究所广西水牛遗传繁育重点实验室,广西南宁530001【正文语种】中文【中图分类】S823.8+3;Q78水牛具有适应性强、耐高温高湿、耐粗饲、抗病力强、使用年限长、静默发情、繁殖力低和产奶量低等生物学特点，非常适合于我国南方地区养殖[1-2]。
我国奶水牛基因组选择育种技术取得突破性进展
我国奶水牛基因组选择育种技术取得突破性进展
中国农业科学院
【期刊名称】《吉林农业》
【年(卷),期】2017(000)018
【总页数】1页(P29)
【作者】中国农业科学院
【作者单位】
【正文语种】中文
近日，中国农业科学院水牛研究所研究员梁贤威主持完成的科技部国际科技合作专项“奶水牛遗传改良关键技术的合作研究与应用”通过验收，这表明我国奶水牛基因组选择育种技术取得突破性进展，该研究是水牛研究领域国际科技合作的又一项代表性成果。
该项目围绕我国奶水牛产业育种领域共性的关键问题，与意大利农业经济委员会联合开展研究，通过引进意大利水牛芯片技术和评估、沼泽型水牛高通量测序、中国奶水牛芯片研发和全基因组关联分析等系列研究，经消化、吸收、再创新，成功研发了一款高密度的通用型奶水牛SNP200K芯片；筛选出了一批显著影响奶水牛产奶性状的标记；构建了一套奶水牛基因组选择育种技术，并应用该技术初步在养殖示范区开展了高产奶水牛核心群的选择，这对解决我国当前产业面临的种源匮乏以及产奶量低的问题，迅速增加良种奶水牛存栏量，加快水牛产业的发展，促进农民增收、产业增效，具有重要的意义。
通过该项目的合作，以此为契机于年月建立了中意水牛联合研究中心，推进我国
在水牛科技国际合作领域迈入了一个新的台阶，也为开展水牛遗传改良研究找到了新的突破口。
该研究取得的突破，标志着我国奶水牛选育初步进入了现代分子育种的新时代，开启了奶水牛基因组选择育种研究的“大门”，并对我国奶水牛产业健康发展提出了新要求，即进一步加强了奶水牛基础数据库建设。
水牛促卵泡素受体(FSHR)基因启动子克隆、生物信息学分析及转录活性检测
水牛促卵泡素受体(FSHR)基因启动子克隆、生物信息学分析及转录活性检测朱鹏;庞春英;邓廷贤;段安琴;陆杏蓉;陈明棠;杨炳壮;梁贤威【摘要】试验旨在对广西本地水牛FSHR基因5'侧翼序列进行克隆、生物信息学分析及其转录活性检测.根据GenBank已公布的黄牛FSHR 5'侧翼序列,本试验设计引物,以广西本地水牛血液基因组为模板扩增FSHR基因5'侧翼序列并进行生物信息学分析.结果显示本试验成功克隆了广西本地沼泽型水牛FSHR 5'侧翼序列及部分CDS区序列,共2 979 bp,同源性比对分析结果表明其与河流型水牛、黄牛、绵羊、山羊、猪和人的同源性分别为100％、99％、93％、92％、91％和75％.对其5'侧翼2 000 bp序列进行启动子预测及转录因子结合位点预测,结果显示在其翻译起始位点上游-147 bp附近存在TATA box,启动子区存在GATAs、FOXO1、FOXO3、Nobox、STAT1、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、STAT6和YY1等反式作用元件结合位点,其中GATAs家族基因在FSHR启动子区存在多个结合位点,且同一位点又存在多个GATAs家族基因结合的情况.水牛FSHR启动子能启动EGFP在HEK 293T细胞系中的表达,但表达非常微弱;也能启动EGFP在CHO细胞系中表达,且与CMV启动EGFP在CHO细胞系中的强度相似,结果表明水牛FSHR是个强启动子.总之,本研究成功克隆了沼泽型水牛FSHR基因启动子,分析了其启动子序列特征并成功验证其组织特异性的转录活性,为后期水牛繁殖性能分子机理阐明及基于卵巢特异性表达外源基因的转基因水牛奠定了基础.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2015(042)011【总页数】10页(P2833-2842)【关键词】水牛;FSHR;克隆;生物信息学分析;转录活性【作者】朱鹏;庞春英;邓廷贤;段安琴;陆杏蓉;陈明棠;杨炳壮;梁贤威【作者单位】中国农业科学院广西水牛研究所,广西水牛遗传繁育重点实验室,南宁530001;中国农业科学院广西水牛研究所,广西水牛遗传繁育重点实验室,南宁530001;中国农业科学院广西水牛研究所,广西水牛遗传繁育重点实验室,南宁530001;中国农业科学院广西水牛研究所,广西水牛遗传繁育重点实验室,南宁530001;中国农业科学院广西水牛研究所,广西水牛遗传繁育重点实验室,南宁530001;中国农业科学院广西水牛研究所,广西水牛遗传繁育重点实验室,南宁530001;中国农业科学院广西水牛研究所,广西水牛遗传繁育重点实验室,南宁530001;中国农业科学院广西水牛研究所,广西水牛遗传繁育重点实验室,南宁530001【正文语种】中文【中图分类】Q78水牛具有适应性强、耐高温高湿、耐粗饲、抗病力强、使用年限长、静默发情、繁殖力低和产奶量低等生物学特点［1－3］，非常适合于中国南方农村饲养，据FAO 2013年数据统计显示，2011年底中国水牛存栏量达2 338．2万头，仅次于印度11 291．6万头和巴基斯坦3 172．6万头，位居世界第三，在中国畜牧业产业中占有重要地位。
沼泽型水牛卵泡发育波及其生殖激素变化的试验研究
沼泽型水牛卵泡发育波及其生殖激素变化的试验研究
刘瑞鑫;蒋如明;韦英明;周虚
【期刊名称】《广东畜牧兽医科技》
【年(卷),期】2008(33)6
【摘要】运用B超跟踪观察经同期发情处理后的沼泽型水牛的卵泡发育动态,并应用放射免疫测定法(RIA)测定其发情周期中血清促卵泡素(FSH)、促黄体素(LH)、雌二醇(E2)、孕酮(P4)等生殖激素的含量,分析了沼泽型水牛的卵泡波情况,并比较了四种生殖激素在发情周期不同时间段及不同卵泡波类型之间的差异性.发现沼泽型水牛的发情周期由2个或3个卵泡波组成,以2个卵泡波为主;2个或3个卵泡波中各个波征集、选择的卵泡数之间无显著差异;血清FSH、LH、E2、P4水平在表现为不同卵泡波类型的青年水牛无显著差异(P>0.05).
【总页数】4页(P24-27)
【作者】刘瑞鑫;蒋如明;韦英明;周虚
【作者单位】广西大学动物繁殖研究所,广西,南宁,530005;广西畜牧研究所,广西,南宁,530001;广西畜牧研究所,广西,南宁,530001;吉林大学畜牧兽医学院,吉林,长春,130062
【正文语种】中文
【中图分类】S823.8
【相关文献】
1.广西沼泽型母水牛发情淡季生殖激素的变化规律研究 [J], 祝晓丽;许惠艳;刘晓华;谭世俭;卢克焕;石德顺
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3.不同卵泡波类型水牛生殖激素变化的试验研究 [J], 刘瑞鑫;蒋如明;韦英明;周虚
4.沼泽型水牛发情期血清生殖激素的变化规律研究 [J], 谢炳坤;覃兆鲜;公方强;韦英明;莫毅;蒋和生
5.沼泽型水牛发情周期卵泡发育波的发育动态观察 [J], 韦英明;刘瑞鑫;周虚;蒋如明
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广西培育出世界首例亚种间克隆水牛
广西培育出世界首例亚种间克隆水牛
无
【期刊名称】《河南畜牧兽医：市场版》
【年(卷),期】2008(029)003
【摘要】近日，由广西水牛研究所主持的农业部“948”项目“水牛胚胎克隆技术的引进与应用”取得重大突破，一头受体母水牛顺利产下1头雌性亚种间克隆水牛犊，取名“元圆”。
利用国外优质种牛和本地水牛成功克隆出亚种问水牛，这在全世界尚属首例。
目前广西水牛所还有7头采用这种技术怀孕的受体母牛，在近期内还将有亚种间克隆水牛出生。
【总页数】1页(P41)
【作者】无
【作者单位】无
【正文语种】中文
【中图分类】S858.23
【相关文献】
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广西沼泽型水牛IL 1 基因的克隆及在发情周期内水平动态变化李恭贺,雷 利,何宝祥,覃广胜,宁淑芳,杨丰利,蒋和生(广西大学动物科学技术学院,广西南宁530004)中图分类号:S857.2 文献标识码:B 文章编号:0529 6005(2010)02 0027 02白介素 1(IL 1)具有广泛的免疫调节作用,并有致热和介导炎症的作用,它有两个亚型:IL 1 和IL 1 。
在动物繁殖领域里,很多研究显示IL 1直接或间接参与调节卵母细胞的成熟和排卵。
在卵巢体外试验过程中,人们发现IL 1 类似于LH或hCG可以诱导排卵[1 3]。
在母马排卵时期往其卵泡内注射IL 1 ,结果如同注射促性腺激素一样,可以诱发排卵[4]。
一般认为,IL 1 对妊娠具有促进作用,其合成能力与胚胎附值成功与否呈正相关[5],它既能刺激滋养层细胞合成和分泌孕酮,也能刺激子宫内膜上皮细胞合成PGE2和IL 6,来调节动物生殖机能。
还有学者发现卵巢囊肿与其分泌水平密切相关[6]。
由此可见,IL 1在动物的生殖生理学方面有着不可忽视的作用。
广西水牛就占全国数量的1/6,大约400多万头,其中大部分属于沼泽型水牛。
本研究从水牛外周血淋巴细胞中扩增出了IL 1 基因的完整编码区(ORF),比较了与其他动物在核苷酸和氨基酸水平上的同源性,而且还在水牛发情期内检测了IL 1水平的动态变化,为研究其生物学活性和疾病预防奠定了良好的基础。
1 材料与方法1.1 主要材料及试剂 水牛外周血采自广西大学实习牛场;pM D18 T载体、Taq DNA聚合酶、AMV反转录酶,胶回收试剂盒和质粒抽提试剂盒购自T aKaRa公司;总RNA提取试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司; E.coli DH5 菌株由本研究室保存。
试验所选用水牛23头,膘情中等、体况相似、生殖道机能正常。
牛IL 1ELISA检测试剂盒购自Adlitteram Diagnostic Labo rato ries,Inc.。
1.2 引物的设计与合成 根据NCBI GenBank中牛IL 1 基因[NM_174093]设计了引物。
上游引收稿日期:2009 04 17基金项目:广西自然科学基金(桂科自0728016)作者简介:李恭贺(1977 ),男,讲师,博士生,研究方向为临床免疫学和动物遗传育种,E mail:ligongh e@通讯作者:蒋和生物:5 AT GGCAACCGT ACCT GAA 3 ,下游引物: 5 TCTTTAGGGAGAGAGGGTTTC 3 ,由上海捷瑞生物工程有限公司合成,上下游引物跨度为804bp。
1.3 淋巴细胞的分离培养、诱导及总RNA的提取 无菌采集健康水牛外周血,肝素抗凝。
按常规方法分离淋巴细胞,用含10%胎牛血清的RPM I 1640培养液,加入终浓度为10g/m L Co nA,10000U/ m L双抗,37、5%CO2培养24h。
提取细胞总RN A于-80保存备用。
1.4 IL 1 基因RT PCR反应 RT反应体系:取RN A1g,1L Olig o(dT),混匀后于70水浴5 m in,905min,立即冷却,依次加入dNTPs(10 m mol/L)2L,5!Buffer RT缓冲液5L,RNA 酶抑制剂0.5L,反转录酶0.5L,充分混匀,42反应1h,953m in。
然后产物置-20保存PCR反应体系 10!T aq Buffer2.5L, dNTPs0.25L,上、下游引物(25pm ol/L)各0.5 L,cDNA2.5L,加双蒸水至25L。
反应程序为:945min,9445s,6045s,721m in,35个循环,72延伸10min。
2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
1.5 IL 1 基因克隆与鉴定 PCR产物电泳后进行胶回收,与载体pMD18 T连接,然后转化到E.coli DH5 感受态细胞,培养后挑取白斑摇菌,重组质粒进行双酶切(Sal∀和B am H∀)鉴定,菌液送至由北京诺赛基因组研究中心有限公司进行测序。
1.6 水牛发情周期血清IL 1含量的检测 所有试验牛于发情前和后期早上空腹静脉采血,间隔1d 采集1次,分离血清后保存于-80冰箱内备用。
根据牛IL 1ELISA检测试剂盒的说明书按步骤进行操作。
用SAS软件分析水牛发情后不同时间点之间的IL 1含量的差异。
2 结果2.1 RT PCR扩增片段 以培养24h的淋巴细胞(ConA刺激)为材料,进行RT PCR扩增,得到一特异的扩增片段,经琼脂糖凝胶电泳显示约为804 bp,与预期结果相符合(见图1)。
27C hinese Journal of Veterinary M edicin e 中国兽医杂志2010年(第46卷)第2期图1 水牛IL 1 的RT PCR 扩增M :DNA M arker;1~4:PCR 产物;5:样品空白对照2.2 重组质粒鉴定 对重组质粒进行双酶切,结果出现了2.6kb 的载体片段和804bp 目的片段,证实对该基因的成功克隆。
见图2。
2.3 测序结果及序列分析 使用DN AStar 软件对测序结果进行分析,所得编码水牛IL 1 的基因序列全长804bp,由267个氨基酸的构成的前体蛋白,测序结果见图3。
通过GenBank 中与广西水牛,黄牛,绵羊,猪,人,老鼠其他种属IL 1核苷酸序列进行同源性比较(图4),得出核苷酸序列比较,结果同图2 用Sal ∀和Bam H ∀双酶切的重组质粒电泳检测M :DNA 分子量标准;1~2:酶切结果源性分别为99.4%、98.6%、95.4%、37.0%、31.2%、36.2%。
2.4 水牛发情前后IL 1浓度的动态变化 水牛发情周期前后体内IL 1浓度平均含量的检测结果及动态变化曲线见图5。
本试验用B 超监测所选23头水牛,发现有10头水牛发情明显。
把0d 视为发情当天,每间隔1d 采集1次血液。
ELISA 测定结果显示,发情后第2、8天和第15天左右分别有一峰值,其他时间趋于平稳。
图3 水牛IL 1 基因的核苷酸序列图4 广西水牛和印度水牛、黄牛、绵羊、猪、老鼠和人的核苷酸序列比较3 讨论3.1 本试验用ConA 刺激水牛淋巴细胞后,用RT PCR 方法成功地扩增出了长度为804bp 的IL 1 cDNA,包括整个开放阅读框。
与报道的印度水牛IL 1 核苷酸具有99.4%的同源性,氨基酸为99.2%,其中有16处位点的核苷酸发生突变,其中6处突变为有义突变,分别是第84位T 变为C(天冬氨酸变为谷氨酸),166位T 变为C (苯丙氨酸变图5 在水牛发情周期内IL 1含量的水平动态变化趋势 (P <0.01)为亮氨酸),355位A 变为G (异亮氨酸变为颉氨酸),449位A 变G(天冬酰胺变为丝氨酸),698位G 变为T(色氨酸变为亮氨酸),754位G 变为A(甘氨酸变为丝氨酸)。
经序列分析,不同品种的水牛IL 1 基因是保守的,但也有一定的变异,这种差异很可能是种间的差异造成。
28中国兽医杂志2010年(第46卷)第2期 Chin es e Journal of Veterinary M edicine2,6 二甲苯胺噻嗪对大鼠不同脑区一氧化氮合酶活性及一氧化氮含量的影响牟 婵,尹柏双,李 静,张 帆,高 利(东北农业大学动物医学学院,黑龙江哈尔滨150030)中图分类号:S859.79+1 文献标识码:B 文章编号:0529 6005(2010)02 0029 022,6 二甲苯胺噻嗪(Ro mpun.Xylazine),商品名称为隆朋,属于化学保定药(也称制动药),是1962年德国拜耳公司合成的一系列苯胺噻嗪取代物中的一种,起初用于医学临床作为降压药,后发现其为肾上腺素 2受体激动剂[1],具有确切的中枢性镇静、微弱的镇痛和肌松作用,被推广到兽医临床作为麻醉药应用,广泛用于马、牛、羊、犬、猫、兔等多种动物的麻醉。
一氧化氮(NO)在中枢伤害感受性通路和维持清醒状态中发挥重要作用[2]。
麻醉药对NO/cGMP信号转导系统的影响环节可能与改变鸟苷酸环化酶(cGM P) 磷酸二酯酶(PDE)活性、直接作用一氧化氮合酶(N OS)活性,改变NO的半衰期,阻止N O释放等方面有关。
目前,关于2,6 二甲苯胺噻嗪麻醉机理尚不清楚,国内外相关报道较少,本试验通过观察2,6 二甲苯胺噻嗪单一麻醉下大鼠NOS活性、NO含量的变化,以探讨2,6 二甲苯收稿日期:2008 12 23基金项目:黑龙江博士后科研启动金资助(LBH Q07016)作者简介:牟婵(1982 ),女,硕士,研究方向为麻醉机理研究等, E mail:404225091@通讯作者:高利,E mail:gaoli43450@ 胺噻嗪全麻作用部位及全麻机理。
1 材料与方法1.1 试验动物 3月龄Wistar纯种大鼠48只,体重200#25g,雌雄各半,黑龙江省哈尔滨市医科大学第一附属医院实验动物中心提供,同种条件饲养2周。
1.2 试验药品和试剂 2,6 二甲苯胺噻嗪麻醉剂(东北农业大学动物医学学院外科教研室提供); NOS测定试剂盒,NO试剂盒(酶法),考马斯亮蓝蛋白质含量测定试剂盒(均由南京建成生物工程研究所提供,批号:20080625)。
1.3 动物分组及样品采取 48只大鼠随机均分为6组:对照组(注射生理盐水)、诱导组(注药后5 m in)、麻醉组(翻正反射消失)、恢复∀组(翻正反射恢复)、恢复∃组(翻正反射恢复1h)、恢复%组(翻正反射恢复3h)。
行为学变化分组标准:站立不稳,倒地,翻正反射即将消失为诱导组;将动物腹面朝上放置,给予轻微刺激,动物仍不能翻回者即翻正反射消失为麻醉组;对麻醉后翻正反射消失的动物,给予轻微的刺激,动物即能自主翻回者,即翻正反射恢复为恢复组。
3.2 沼泽型水牛发情周期一般由2个或3个卵泡发育波组成[7],从图5可以看出IL 1水平在水牛发情8~10d内有一个明显的峰值,在第2天与第15天左右分别又有一个峰值。
这3个峰值正处于卵泡波时期,即水牛在每一个排卵期,IL 1水平都有一个显著的增值,机体自动提高其免疫力,这就充分说明了IL 1与动物的生殖有着相当密切的联系。
目前有关水牛血清IL 1水平与卵巢发育的研究还较少。
本研究仅为初步探索,仍需进一步扩大研究动物数量和增加研究方法,以全面地阐明沼泽型水牛繁殖与相关细胞因子的作用机理,为我们今后在研究水牛的生殖生理方面提供可靠文献。
参考文献:[1] Br nns tr m M,W ang L,Norman R J.Ovulatory effect of interleu kin 1 on the perfu sed rat ovary[J].En docrinology, 1993,132:399 404.[2] van der Hoek K H,W oodhouse C M,Br nn str m M,et al.Effects of interleukin(IL) 6on luteiniz ing h ormone an d IL 1beta induced ovulation an d steroidogen esis in the rat ovary [J].Biology of Reproduction,1998,58:1266 1271.[3] Takehara Y,Dharmarajan A M,Faufman G,et al.Effect ofinterleu kin 1 _on ovulation in the in vitro perfus ed rab bit ova ry[J].Endocrin ology,1994,134:1788 1793.[4] M artoriati A,G rard N.Interleukin 1(IL 1)system gene expression in gran ulosa cells:k inetics during terminal preovu la tory follicle maturation in the mare[J].Reproductive Biology and E ndocrinology,2003,1:42 52.[5] Kis himoto T,Akira S,Taga T.Interleuk in 6and its,receptor:A paradigen for cytokines[J].Science,1992,258(5082): 593 597.[6] G rard N,Caillaud M,M artoriati A,et al.T he interleu kin 1sys tem and female repr odu ction[J].J ou rnal of Endocrin ology, 2004,180:203 212.[7] 韦英明,刘瑞鑫,周虚,等.沼泽型水牛发情周期卵泡发育波的发育动态观察[J].繁殖与生理,2006,42(19):21 23.29C hinese Journal of Veterinary M edicin e 中国兽医杂志2010年(第46卷)第2期。