20章基因工程

一种典型的pUC系列的质粒载体， 包括以下四个部分：
1、来自pBR322质粒的复制起点（ori）； 2、氨苄青霉素抗性基因（ampr ）,但它的 DNA核苷酸序列已经发生了变化，不在含有原 来的核酸内切限制酶的但识别位点。 3、大肠杆菌β-半乳糖基因（lacZ）的启动子 及编码α-肽链的DNA序列，此结构称之为lacZ’ 基因； 4、位于lacZ’基因中的靠近5’-端的一段多克隆 位点（MCS）区段。但它并不破坏该基因的功 能。
三、基因重排
将一个基因从远离启动子的地方移到距它很近的位
点从而启动转录，这种方式被称为基因重排。
通过基因重排调节基因活性的典型例子是免疫球蛋
白结构基因和T－细胞受体基因的表达。
在所有物种中，胚系Ig基因的构成基本上相 同。Ig重链和轻链(λ和κ链)基因座都由多个 编码V区(可变区）和C区（恒定区）蛋白质 的基因组成，并被非编码的DNA（连接区， J区）所分隔。 V、C、J区在胚胎期细胞中相距较远，细胞 发育分化时，免疫球蛋白重链基因DNA重排， 大量间隔序列被切除，使位于J-Cμ之间的增 强子序列得以发挥作用，增强基因转录。
头部基因 尾部基因 功能不明区
AW B C D E F Z U V G H M LK I J
COS
b2
溶源化
重组
早期控制
阻遏
DNA合成 溶菌 COS
S R
att int xis gam red cIII N cI cro cII O P Q
生长非必须区段
cI基因：溶源过程控制基因。
体外包装
λ噬菌体DNA体外重组后，一般必须经过 体外包装，然后以噬菌体感染的方式将重组 DNA导入E.coli细胞内。这是因为以感染方式 导入细胞的频率可达106~108/μgDNA， λ噬菌体的包装限制为野生噬菌体DNA（约 48.5 kb）的75%~105%。
pUC质粒载体的优点
第一， 具有较小的分子量和更高的拷贝数; 仅保留了pBR322的氨苄青霉素抗性基因和复制起 点；在操作过程中复制起点内部发生了自发突变造成 了基因rop的缺失，它是控制质粒的特殊因子，从而 使拷贝数增加，平均每个细胞500~700个拷贝。 第二，适用于组织化学检测重组体； 具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ’基因，所编码 的α-肽链可参与α- 互补作用，用X-gal显色对重组子 进行鉴定，而pBR322质粒的重组子要进行两步的选 择。 第三，具有多克隆位点MCS区段． 方便具有不同粘性末端的外源片断的插入。
载体分类（按功能分）
克隆载体：用于外源DNA的克隆和扩增。
表达载体：用于外源基因的表达（转录翻 译生成蛋白质）
一、克隆载体
质粒载体
噬菌体载体 病毒载体
（一） 质粒（plasmid）载体
质粒是一种独立于染色体外的小分子环状
DNA，一般大小约106~108D，可自身复制和表 达，有的质粒还带有可做为选择性标记的抗药 性基因，所以质粒经过适当改选后便可成为良 好的载体。 作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适 当改造而成的，目前已有多种经改造的良好的 质粒载体。
四、（转位）转座
1 转座子的定义 能将自身插入基因组新位置的DNA
序列。
（1）含短的末 端反向重复 序列; （2）含编码转 座酶的基因; （3）靶位点存 在 5-9 bp 的 短正向重复 序列。
第二节
基因克隆的工具酶
限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）
识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围 切割双链DNA的一类内切酶，与相伴的甲基化酶共 同构成细菌防御机制——限制修饰体系（限制外源 DNA，保护自身DNA）
限制性核酸内切酶命名： 属名、种名、株名
Hin d Ⅲ
流感噬血杆菌种属 d 株 第三种内切酶
限制性核酸内切酶 识别位点常为4-6个碱基对、具有回文结 构的DNA片段 切割DNA后有粘端与平端 AATGAATTCGTACCG 之分或产生平末端 TTACTTAAGCATGGC 垂直切割 错位切割 5’---NCAG CTGN---3’ 5’---NGAATTCN---3’ 3’---NGTC GACN---5’ 3’---NCTTAAGN---5’
（左右臂连接）
（三段自身连接）
（插入片段）
根据噬菌斑的透明度或颜色来进行重组子的筛选
（黏性质粒）柯斯质粒载体
柯斯质粒载体
cosmid载体：也称粘粒、柯斯载体。 这是一类用于克隆大片段DNA的载体，它 是由λ噬菌体的cos（cohesive site）末端及 质粒（plasmid）重组而成的载体。
cosmid载体带有质粒的复制起点、克隆位 点、选择性标记以及λ噬菌体用于包装的 cos末端等，因此该载体在体外重组后，可 利用噬菌体体外包装的特性进行体外包装， 利用噬菌体感染的方式将重组DNA导入受 体细胞。但它不会产生子代噬菌体，而是 以质粒DNA的形式存在于细胞内。
设计构建的柯斯质粒一般长4～6kb。 其上的cos位点的一个重要作用是识别噬 菌体的外壳蛋白。凡具有cos位点的任何 DNA分子只要在长度相当于噬菌体基因 组，就可以同外壳蛋白结合而被包装成类 似噬菌体λ的颗粒。因此，插入柯斯质粒 的外源DNA可大于40kb。重组的柯斯质 粒可象噬菌体λ一样感染大肠杆菌，并在 细菌细胞中复制。
DNA聚合酶 I
反转录酶 多聚核苷酸激酶 末端转移酶 碱性磷酸酶
第三节 基因克隆的载体
载体（vector）是由在细胞中 能够自主复制的ＤＮＡ分子构成的 一种遗传成分，通过实验手段可使 其它ＤＮＡ片段(外源基因)连接在它 的上面，进行扩增或表达。
理想载体应具备的几个条件
能在宿主细胞内携带目的基因复制扩增 ， 具有较高拷贝数。 有多个限制性内切酶单一位点 ，便于外源 基因的插入。 有易检测的遗传筛选标记，如抗生素抗性 基因，用于阳性克隆的筛选。 分子量小，允许插入外源基因的容量较大。
选择记号。
pBR322 DNA分子中总共有24种核酸内切酶只具有 单一的酶切识别位点。其中7种内切酶的识别位点 在四环素抗性基因内部，2种识别位点在于这个基 因的启动区内，所以9个限制酶切位点插入外源片 断可以导致tetr 基因的失活；另外有3种限制酶在 氨苄青霉素抗性基因有单一的识别位点，
pUC质粒载体 人们应用多克隆位点技术， 在pBR322的基础上，组入了一 个在其பைடு நூலகம்’-端带有一段多克隆位点 的lacZ’基因，而发展的具有双功 能检测特性的新型质粒载体系列。
•Lac Z基因插入失活：如charon16A载体，在非必须区段 引入lac Z基因，在lac Z基因上有EcoR I位点，插入失活后 利用X-gal法筛选（兰白筛选）。
λ 替换型载体（取代型载体）
如 EMBL系列
外源DNA取代噬菌体染色体中对于噬菌体的 感染和复制非必需的片段 (约20 kb) 这些载体是用Lac 5（乳糖操纵子的大部分 系列，包括完整的Lac Z）替换入噬菌体的 中间区段，同时将Lac 5作为选择标记，使 用时用EcoRⅠ水解，去掉中间的片段，再 与欲克隆片段在体外进行重组、包装。而 后，感染E.coli使之在E.coli内繁殖，并 裂解E.coli，形成空斑。
Lac promoter Ampr
MCS (Multiple cloning sites, 多克隆位点）
pUC18 (3 kb)
ori
lacZ’
MCS (Multiple cloning sites,多克隆位点）：指人工合 成的含有多种限制性内切酶单一识别切割位点的DNA序列。
乳 糖 操 纵 子 结 构 与 调 控 模 式 图
DNA分子中核苷酸序列是随机排列的，一 个识别四个核苷酸序列的内切酶平均每隔 256bp（44）出现一次该酶的识别切割位点。 那么，识别6或8核苷酸序列的内切酶的切 割频率是多少？
基因工程其他常用的工具酶
酶的种类
Taq DNA聚合酶 DNA连接酶
功
PCR扩增
能
催化DNA中相邻的5'磷酸基和3'羟基末端之间 形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个 DNA分子或片段连接 ①合成双链cDNA的第二条键 ②缺口平移制作高比活探针 ③DNA序列分析 ④填补3'末端 以RNA为模板合成cDNA第一链 催化多聚核苷酸5'羟基末端磷酸化，或标记探针 在3'羟基末端进行同质多聚物加尾 切除末端磷酸基团
2. 替换型载体（取代型载体）
具有成对的克隆位点，在这 两个位点之间的λDNA 区段可以被外源插入的DNA片段所取代。
插入式载体：
•cI基因插入失活：如λ gt10等载体，在cI基因上有EcoR I 及Hind III的酶切位点。外源基因插入后将导致cI基因的失 活。cI基因失活后将导致噬菌体不能溶原化，产生清晰的 噬菌斑。相反，产生混浊的噬菌斑。
溶菌阶段
The phage cos ends
5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’ 3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’ 环状
剪切 (包装过程)
连接 (侵染细菌细胞后)
GGGCGGGCGACCTCG-3’ 线状 5’-CG + GC-5’ 3’-GCCCCGCCGCTGGA
λ噬菌体的基因组结构
ori
（4363bp）
以Ampr和 Tetr为选择 性标记， 克隆位点 在这两个 选择性标 记的单酶 切位点上。
pBR322的结构来源
pBR322质粒载体的特点： 1、具有较小的分子量；
它的分子量为4363bp。克隆载体的分子量大小 不要超过10kb。 2、具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的
质粒（plasmid）
是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA
分子。大小约为
数千碱基对。常
有1 ~ 3个抗药
性基因，以利于 筛选。