第19章基因诊断PPT资料57页
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分子生物学之基因诊断与基因治疗讲课文档
第二节
基因治疗
Gene Therapy
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第十二页，共25页。
基因治疗的定义
是以改变人遗传物质为基础的生物医学治疗， 即通过一定方式将人正常基因或有治疗作用的DNA
片段导入人体靶细胞以矫正或置换致病基因的治疗方法。 它针对的是疾病的根源，即异常的基因本身。
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（五）DNA指纹鉴定是法医学个体识别的核 心技术
人与人之间的某些DNA序列特征具有高度的个体特异性和终生稳定 性，正如人的指纹一般，故称为DNA指纹（DNA fingerprinting）。
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STR等位基因在家庭 中遗传示意图
第十一页，共25页。
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（二）基因点突变的诊断
1．等位基因特异性寡核苷酸分子杂交
检测点突变的有效 技术是等位基因特 异性寡核源自酸 （ allele specific
oligonucleotide ，
ASO）分子杂交。
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2．反向点杂交
反向点杂交（reverse dot blot，RDB）是改进的 ASO技术。 一次检测可以同时筛查多种突变，大大提高了基因诊断效率 。
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一、基因诊断的主要对象和样品来源
对象：
主要是DNA分子，涉及到功能分析时，还可定量检
测RNA（主要是mRNA）和蛋白质等分子。
样品来源：
临床上可用于基因诊断的样品有血液、组织块、 羊水和绒毛、精液、毛发、唾液和尿液等。
分子生物学 基因诊断ppt
基因芯片的工作原理与经典的核酸分子杂交
方法（southern 、northern）是一致的，都是应用已知 核酸序列作为探针与互补的靶核苷酸序列杂交，通过随 后的信号检测进行定性与定量分析，基因芯片在一微小 的基片（硅片、玻片、塑料片等）表面集成了大量的分 子识别探针，能够在同一时间内平行分析大量的基因，
PCR的基本反应步骤
溶液反应温度 升至中温72℃ ，在 Taq酶作 用 下 ， 以 dNTP 为原料 ，引物为复制 起点，模板 DNA的一条单 链在解链和退 火之后延伸为 一 条 双 链
变性 95 ℃ 变性，双链解链
延伸 72˚C
退火
Tm-5˚C
降低溶液温 度，使合成 引物在低温 （35－70℃, 一般低于模 板Tm值的 5℃左右）， 与模板DNA 互补退火形 成部分双链
二、基因诊断的特点
特异性高： 以分子杂交技术为基本原理
针对性强： 以探测疾病基因为目标，属于“病因诊断” 。
灵敏度高： 基因探针带有十分敏感的检测标记，可从人 类长达3×106kb的基因组中检测出某一基因的 单碱基改变。而且待测标本微量。 适应性强： 基因探针可为任何来源，任何种类，探针序 列可为已知亦可未知，检测目标可为内源基 因亦可外源基因，诊断范围广。 安全高效、适应范围广、早期诊断、取样方便等
获得DNA片段条状图谱,便是所谓的DNA指纹。
谢谢
基因诊断
学院：环资学院 作者：毛新伟 学号：2013116011006
传统对疾病的诊断主要是以疾病的 表型改变为依据，如患者的症状、 血尿各项指标的变化，或物理检查 的异常结果，然而表型的改变在许 多情况下不是特异的，而且是在疾 病发生的一定时间后才出现，因此 常不能及时作出明确的诊断
高级病理生理学：基因诊断
Blood samples - the most widely used source of DNA from adults.
Mouthwashes or buccal scrapes - being noninvasive, they are especially favored for population screening programs. Mouthwashes yield sufficient DNA for a few dozen tests, and by using whole genome amplification more extensive testing of a single sample may be possible.
数目变异的串联重复 (Variable number tandem repeats)
脆性x综合症就是由于三核苷酸（CCG）n重复序列的拷贝数增加所致
15:46
20
染色体易位 （Translocation）
15:46
21
剪切位点的突变
15:46 Abnornal bin primary RNA Transcript 22
基因突变对表型的影响大致上通过以下两种主要途径而实现：
（一）影响其产物组成或结构 （二）影响其表达的量
(一)基因突变改变表达产物组成和结构
碱基置换突变
同义突变 （cosense mutation）:基因突变只在非关键 的部位发生，如在密码子第3位由于简并性而发生 的并不会改变氨基酸，也不影响其产物的生物学活 性和性质
终止密码突变（termination codon mutation）：突变 在原来终止密码处产生非终止密码，变成编码氨基 酸密码，叫做则其表达产物多肽链会延长，也会失 去或大大减弱正常多肽链的功能。
医学遗传学：第19章 遗传病的预防
狭义
❖ ①本人或家庭成员中具有遗传性疾病或先天性畸形； ❖ ②原发性不育的夫妇或具有不明原因的习惯性流产、
早产、死产和死胎史的夫妇； ❖ ③近亲结婚的夫妇及后代； ❖ ④性发育异常或行为发育异常的个体； ❖ ⑤有致畸因素接触史，但要求生育的夫妇； ❖ ⑥35岁以上的高龄孕妇； ❖ ⑦不明原因的智力低下个体； ❖ ⑧染色体畸变患者的父母和同胞。
❖ 2、男，27岁，女，25岁，已婚一年，非近亲婚配， 计划妊娠，但女方的哥哥16年前因患Ducheme肌营 养不良症而夭亡，其姨表姐也曾生育过一个 Ducheme肌营养不良患儿，其余家系成员无该病。 男方家系中无此类疾病患者。询问：他们若生育， 子女有多大可能患该病？有无措施预防该类患儿 出生？
❖ 生育指导：
❖ 由于这对夫妇再次生育时的复发风险高于10%， 是一种高风险，因此他们再次妊娠，建议进行产 前诊断——可利用绒毛或羊水细胞进行胎儿染色 体核型分析。
❖ 核型分析若确诊为易位型先天愚型胎儿，建议人 工流产；若确诊为正常核型的胎儿，可继续妊娠 至足月生产；若确诊为平衡易位携带者可告之， 个体表型正常但将来生育会发生与母亲同样的情 况。
体格检查：患者皮肤白皙，头发淡黄色且干燥，面容呆滞， 肌张力低，尿液和汗液有特殊霉臭味。脑电图检查异常。
家系调查：患者家系中其他成员表型和智力均正常，父母 非近亲婚配。
❖ 该表兄妹询问，将来婚后可能生育同样疾病患儿吗？风险 有多大?
明确诊断
❖ 根据患者的体征，尤其是尿液有特殊腐臭味，首先 应考虑是否为苯丙酮尿症。
❖ 携带者检出的方法： ❖ 1、系谱分析法 ❖ 2、风险估计 ❖ 3、实验室检查 ❖ ①生化水平的检测：适于分子代谢病杂合子的检
出。采用酶活性测定或底物负荷试验来检测。 ❖ ②细胞水平检测：主要包括染色体核型分析和组
❖ ①本人或家庭成员中具有遗传性疾病或先天性畸形； ❖ ②原发性不育的夫妇或具有不明原因的习惯性流产、
早产、死产和死胎史的夫妇； ❖ ③近亲结婚的夫妇及后代； ❖ ④性发育异常或行为发育异常的个体； ❖ ⑤有致畸因素接触史，但要求生育的夫妇； ❖ ⑥35岁以上的高龄孕妇； ❖ ⑦不明原因的智力低下个体； ❖ ⑧染色体畸变患者的父母和同胞。
❖ 2、男，27岁，女，25岁，已婚一年，非近亲婚配， 计划妊娠，但女方的哥哥16年前因患Ducheme肌营 养不良症而夭亡，其姨表姐也曾生育过一个 Ducheme肌营养不良患儿，其余家系成员无该病。 男方家系中无此类疾病患者。询问：他们若生育， 子女有多大可能患该病？有无措施预防该类患儿 出生？
❖ 生育指导：
❖ 由于这对夫妇再次生育时的复发风险高于10%， 是一种高风险，因此他们再次妊娠，建议进行产 前诊断——可利用绒毛或羊水细胞进行胎儿染色 体核型分析。
❖ 核型分析若确诊为易位型先天愚型胎儿，建议人 工流产；若确诊为正常核型的胎儿，可继续妊娠 至足月生产；若确诊为平衡易位携带者可告之， 个体表型正常但将来生育会发生与母亲同样的情 况。
体格检查：患者皮肤白皙，头发淡黄色且干燥，面容呆滞， 肌张力低，尿液和汗液有特殊霉臭味。脑电图检查异常。
家系调查：患者家系中其他成员表型和智力均正常，父母 非近亲婚配。
❖ 该表兄妹询问，将来婚后可能生育同样疾病患儿吗？风险 有多大?
明确诊断
❖ 根据患者的体征，尤其是尿液有特殊腐臭味，首先 应考虑是否为苯丙酮尿症。
❖ 携带者检出的方法： ❖ 1、系谱分析法 ❖ 2、风险估计 ❖ 3、实验室检查 ❖ ①生化水平的检测：适于分子代谢病杂合子的检
出。采用酶活性测定或底物负荷试验来检测。 ❖ ②细胞水平检测：主要包括染色体核型分析和组
基因诊断
RFLP分析法 限制酶酶切图谱直接分析法 RFLP间接分析法
（1）限制酶酶切图谱直接分析法
① 限制酶酶切—Southern印迹杂交。 ② PCR—限制酶酶切
应用RFLP诊断镰刀状红细胞性贫血
正常人珠蛋白基因
正常人珠蛋白mRNA 6 CTC GAG Glu 6 CAC
正常人珠蛋白肽链
HbS的珠蛋白基因
HbS的珠蛋白mRNA
HbS的珠蛋白肽链
GUG Val
MstⅡ酶切位点 CCTNAGG A T替换
MstⅡ酶 CCTNTGG
HbA ---------CCT GAG GAG-------
MstⅡ 1.1kb
HbS
MstⅡMstⅡ 0.2kb
---------CCT GTG GAG-------
• 2、聚合酶链反应的发明 • 直到1985年，美国PE-Cetus公司的人类遗传研究室 Mullis等人才发明了具有划时代意义的聚合酶链反应 (Polymerase Chain Reaction, PCR), 使人们梦寐以求的体外 无限扩增核酸片段的愿望成为现实。其原理类似于DNA 的体内 复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供一种 合适条件。开始是使用大肠杆菌 DNA聚合酶Klenow片段 来扩增人基因组中的特异片段。由于该酶不耐热，因此， 每次 加热变性DNA后都要重新补加Klenow酶。在操作多 份标本时，这一过程耗时，费力， 且易出错。耐热DNA 聚合酶的应用使得PCR反应更易于自动化，继而PE-Cetus 公司推 出了第一台PCR热循环仪，使该技术的自动化成 为现实。Mullis等因此项技术于1993年 获得诺贝尔奖金。
第一节
基因诊断 的技术方法
一、基因诊断中常用的分子生物 学技术 （一）核酸分子杂交 （二）聚合酶链反应（PCR） （三）单链构象多态性检测 （四）限制酶酶谱分析 （五）DNA序列测定 （六）DNA芯片技术
基因检测报告解读 PPT
小儿原发性肾病综合征（激素敏感型）
肾癌（肾细胞癌）
肾癌（carcinoma ofkidney）又称肾细胞癌，起源于肾小管上皮细胞，可发
生于肾实质的任何部位，但以上、下级为多见， 少数侵及全肾；左、右肾发 病机会均等，双侧病变占1%~2%。
巨检：肿瘤外观为不规则圆形或椭圆形肿块，有一层纤维包摸；血供丰
桥本甲状腺炎
桥本甲状腺炎（Hashimoto thyroiditis），即慢性淋巴细胞性甲状腺炎（chronic
lymphocytic thy-roiditis），是一种自体免疫性疾病。
慢性淋巴细胞性甲状腺炎又称桥本病或桥本甲状腺炎，目前认为本并与自身面免疫
有关，也称自身免疫性甲状腺炎，本病多见于中年妇女，有发展为甲状腺功能减退的趋
原发性胆汁性肝硬化
Ⅰ型糖尿病
Ⅰ型糖尿病，又名胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)或青少年糖尿病，易出现
糖尿病酮症酸中毒(DKA)。 又叫青年发病型糖尿病，这是因为它常常在 35岁以前发病，占糖尿病的10%以下。
Ⅰ型糖尿病分为两种：自身免疫性Ⅰ型糖尿病和特发性Ⅰ型糖尿病。自
身免疫性Ⅰ型糖尿病，多数青少年起病较快，症状明显；未及时治疗， 当胰岛素严重缺乏或者病情进展迅速时可出现dka（糖尿病酮症酸中毒）。 有些患者早期临床症状不明显，经历较长的一段时间后症状才比较明显。 这类病人体型很少肥胖，但是血浆胰岛素含量低于正常水平，检查可发 现自身胰岛β细胞抗体为阳性。特发性Ⅰ型糖尿病通常起病紧急，胰岛β 细胞功能明显减退甚至衰竭，临床表现为dka，但病程中自身胰岛β细胞 的功能可能会好转以至一段时间不需要胰岛素治疗。检查自身胰岛β细胞 抗体为阴性。
的儿科肾脏疾病，是由于多种病因造成紧小球基底膜通透性增高， 大量蛋白从尿中丢失的临床综合征。主要特点是大量蛋白尿、低 白蛋白血症、严重水肿和高胆固醇血症。根据其临床表现分为单 纯性肾病、肾炎性肾病和先天性肾病三种类型。在5岁以下小儿， 肾病综合征的病理型别多为微小病变型，而年长儿的病理类型以 非微小病变型（包括系膜增生性肾炎、局灶节段性硬化等）居多。
基因诊断
测出基因的突变。
7、甲基化特异性PCR技术
DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分，在维持
正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发 生中起着重要作用，是目前新的研究热点之一。
如在一般正常的细胞中，基因调控区CPG岛处于非
甲基化状态，而当细胞发生癌变后，这些区域往往呈 现甲基化状态。因此DNA甲基化研究是一热点。
或基因突变
2、采用PCR产物的限制性片段长度多态性分析
（PCR－RFLP）
基因突变导致的基因碱基组成和顺序发生改变，会
在基因结构中产生新的限制性内切酶位点或使原有限制
性内切酶位点消失。因此，突变基因经相应的限制性内 切酶水解后，其电泳条带的数量和大小就会发生改变，
根据这些改变可以判断突变是否存在。即限制性片段长
2．基因诊断的特点：
（1）直接检测基因，属病因诊断，针对 性强； （2）特异性强、灵敏度高：由于基因诊 断采用核酸分子杂交、聚合酶链反应等 技术； （3）适用范围广：其应用的范围已从原 先局限的遗传性疾病扩大到感染性疾病、 肿瘤、心血管疾病等领域。
基因诊断的评价
• 特异性 • 灵敏度 • 重复性
DNA芯片技术原理
• 大规模集成的固相杂交 • 基本原理是核酸分子杂交，即依据 DNA双链碱基互补配对、变性和复性 的原理
以大量已知序列的寡核苷酸、
cDNA或基因片段作探针，检测 样品中哪些核酸序列与其互补， 然后通过定性、定量分析得出待 测样品的基因序列及表达的信息
第二节对不同疾病采用不同基因诊断的策略
人类疾病多种多样，致病原因不同，因此在基 因诊断上也有不同途径和策略。 1、对致病基因已经找到、发生机制清楚的疾病， 可以通过直接检测致病基因进行基因诊断。
基因诊断
三、基因诊断的常用技术
（五）单链构象多态性分析
1.单链构象多态性（SSCP）分析 是一种分析突变基因的方法。 2.临床意义 SCP多与PCR技术联用（PCR-SSCP）检测基因突变，提高了基因突变检 测的灵敏性，现已广泛用于遗传病及肿瘤基因的分析。
三、基因诊断的常用技术
（六） 限制性片段长度多态性分析
临床的一些疾病的致病基因尚不清楚，很难用基因突变的检测诊断，对 基因连锁分析
这些遗传疾病采用基因连锁分析
如mRNA拷贝定量检测及mRNA长度分析等。mRNA检测在基因表达 基因表达分析
水平上为基因功能是否正常提供了直接依据
病原体诊断 外来入侵病原微生物遗传物质的检测
二、基因诊断在诊断学中的地位
传统的疾病诊断方法：主要是以疾病的表观改变为依据，不能及时作出明确的诊断。 基因诊断：病因的诊断，既特异又灵敏。 （1）可以揭示尚未出现症状时与疾病相关的基因状态； （2）可以对表观异常不明显或不特异的携带者及某种疾病的易感者做出诊断和预测； （3）对确定有遗传疾病家族史的个体或产前的胎儿是否携带致病基因的检测具有指导意义。
基因诊断
一、基因诊断的含义
基因诊断是在基因水平上对疾病或人体的状态进行诊断。它是以遗传物质 （如DNA或RNA）为检查对象，利用分子生物学技术，通过检查遗传物质结构或 表达量变化与否来诊断疾病的方法。
一、基因诊断的含义
基因诊断的主要内容
内容
评价
基因突变检测
如点突变、基因片段的缺失或插入、基因重排等不同类型基因突变的检 测
三、基因诊断的常用技术
（一）核酸分子杂交技术
1.核酸分子杂交：两条互补单链核酸（DNA或RNA）在一定条件下按碱基互补原则退火 形成双链的过程。 2.分子杂交方法的共同点 （1）应用了核酸序列的复性原理。 （2）采用了标记探针：同位素或非同位素标记的短片段特异DNA或RNA。
基因诊断优秀课件
capture
dioxetane
Detect, read
AP FDA批准 Label for Detection
（4）PCR法
1）定性 S、C、P和X基因中的高度保守序列
2）定量 实时定量PCR技术（最灵敏的方法） TaqMan探针 TaqMan-MGB探针
能够检测少至10拷贝/mL的HBV DNA
基因诊断中常用的分子生物学方法比较
方法
优点与问题
解决方案
核酸分子杂交 结果可靠但操作繁琐
选择合适的探针
PCR
灵敏度、特异性高
设计合适的引物
SSCP
操作简便、检出率不高
选择合适的片段
RFLP
结果可靠但限制较多
选择合适的限制酶
DNA测序
可自动化，但不适宜广泛使用 与PCR配合使用
生物芯片
效率高，成本高，不适宜广泛 选择合适的芯片 使用
2. 完整检出策略和方法
感染性疾病分子诊断完整检出策略： 通过分子杂交结合PCR技术、特殊PCR技
术和芯片技术、核酸测序技术的运用，对大多 数感染性病原体作出明确判断，而且能够诊断 出带菌者和潜在性感染，并能对病原体进行分 类、分型（亚型）和耐药性鉴定。
二、感染病疾病分子诊断的常用方法
1. 信号放大技术检测方法
基因结构变化，如点突变引起基因失活、 染色体转位引起基因异常激活或灭活
癌基因表达水平从低到高；
基因诊断的特点
✓ 高特异性 ✓ 高灵敏性 ✓ 早期诊断性 ✓ 应用广泛性
二、基因诊断中常用的分子生物学技术
核酸分子杂交（Nucleic acid hybridization） 聚合酶链式反应(PCR) 单链构象多态性（SSCP） 限制性片段长度多态性（RFLP） DNA序列测定（DNA sequencing） 生物芯片（biochips） Western免疫印迹（Western blotting） 免疫组织化学诊断
基因与疾病知识概述模版(PPT52张)
癌基因的名称一般用3个斜体小写字母表示，如myc、 ras、src等。
• 抑癌基因：抑制细胞过度生长、增殖从 而遏制肿瘤形成的基因。
3.染色体错误配和不等交换（ Mispaired synapsis and unequal crossing-over）
二、癌基因、抑癌基因
• 癌基因：指具有致癌能力或致癌潜能的 基因的总称。它是细胞内总体遗传物质 的组成部分。
当其受到致癌因素作用被活化并发生异常时，则导致 细胞癌变。 病毒癌基因；细胞癌基因
多肽链
翻译 ┄半胱氨酸┄
翻译 ┄酪氨酸┄
翻译 ┄苯丙氨酸┄
如错义突变不影响蛋白质或酶的生物活性，不出现明显的表型改变 （效应），称为中性突变（Neutral mutation）。
疾的分子机制
■无义突变（nonsense mutation）
单个碱基置换导致终止密码子（UAG、UAA、UGA）提前出 现。
HbA与HbS比较
1949年波林发现镰刀型细胞贫血症（病人的红血细 胞为镰刀形）与血红蛋白结构异常相关，根据杂交原 理应用限制性酶切图谱分析，其病因是密码子GAG突变 为GTG。
疾病的分子机制
基因病分类
（Classification of genic disease）
1
2
3
单
多
获
基
基
得
因
因
性
病
疾病的分子机制
■终止密码突变
DNA分子中一个终止密码子发生突变形成延长的异常肽链。
疾病的分子机制
■抑制基因突变（Suppressor gene mutation） 在基因内部不同位置上的不同碱基发生了两次突变，其 中一次抑制了另一次突变的遗传效应。 【For example】 单纯 6 谷→缬，产生HbS病，造成死亡。
• 抑癌基因：抑制细胞过度生长、增殖从 而遏制肿瘤形成的基因。
3.染色体错误配和不等交换（ Mispaired synapsis and unequal crossing-over）
二、癌基因、抑癌基因
• 癌基因：指具有致癌能力或致癌潜能的 基因的总称。它是细胞内总体遗传物质 的组成部分。
当其受到致癌因素作用被活化并发生异常时，则导致 细胞癌变。 病毒癌基因；细胞癌基因
多肽链
翻译 ┄半胱氨酸┄
翻译 ┄酪氨酸┄
翻译 ┄苯丙氨酸┄
如错义突变不影响蛋白质或酶的生物活性，不出现明显的表型改变 （效应），称为中性突变（Neutral mutation）。
疾的分子机制
■无义突变（nonsense mutation）
单个碱基置换导致终止密码子（UAG、UAA、UGA）提前出 现。
HbA与HbS比较
1949年波林发现镰刀型细胞贫血症（病人的红血细 胞为镰刀形）与血红蛋白结构异常相关，根据杂交原 理应用限制性酶切图谱分析，其病因是密码子GAG突变 为GTG。
疾病的分子机制
基因病分类
（Classification of genic disease）
1
2
3
单
多
获
基
基
得
因
因
性
病
疾病的分子机制
■终止密码突变
DNA分子中一个终止密码子发生突变形成延长的异常肽链。
疾病的分子机制
■抑制基因突变（Suppressor gene mutation） 在基因内部不同位置上的不同碱基发生了两次突变，其 中一次抑制了另一次突变的遗传效应。 【For example】 单纯 6 谷→缬，产生HbS病，造成死亡。