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设计一对甲基化特异性引物（引物中G结合模板中 C);和非甲基化特异性引物（引物中A结合模板中U), 通过PCR扩增就可检测出甲基化等位基因化学修饰 的DNA序列和非甲基化等位基因序列．
用于一些疾病和肿瘤的基因诊断．
.
13
(6)采用PCR技术对靶核酸进行定量分析
定量PCR(quantiative PCR, Q-PCR): 就是对 靶核酸分子进行定量分析的技术.根据PCR扩 增指数增长期原理，理论上扩增产物累积分 子数N=No(1+E)n,其中E是指每次循环中参与复 制的模板数与总模板数的比率.通过N值可求 出No. 但PCR扩增时平台期(15-25)的出现会 影响测量的准确度.定量PCR的策略和方法较 多.
e.
f.
是细胞学技术与核酸杂交技术结合的一种核
酸分析检测技术．可分为DNA原位杂交和RNA原位
杂交,用于检测染色体中特定的基因位置，用于
染色体疾病的诊断．
g.
分类: ① 玻片原位杂交:如中期的染色体和
组
h.
织切片.
i.
② 膜上原位杂交:将菌落或噬菌斑影印
在尼
j.
龙膜(如ຫໍສະໝຸດ Baidu酸纤维膜)
k.
.
6
原位杂交的镜像图
.
14
a. 通过测定PCR产物量 方法: 对已知量的靶DNA进行系列稀释,比较 待测样品和已知系列稀释样品的PCR产量,还 可对未知量的靶DNA进行绝对定量.
b. 采用极限稀释法对靶核酸进行定量分析: 方法:将待测DNA标本进行倍数稀释,直至扩
样 品 一
样 品 二
1987年,H.Donis-Keller等人以RFLP为遗传标记绘 制了第一张人类遗传图谱
.
11
(4)PCR+变性梯度凝胶电泳分析技术
双链DNA在一定浓度变性剂(尿素,甲酰胺)作 用下,会变性而解链,导致DNA分子电泳迁移率 变化.当在不同梯度浓度变性胶中电泳时, DNA泳动到变性剂浓度能使DNA发生变性，DNA 开始解链，从而不同的DNA片段会形成不同的 迁移率条带．
存在这种突变；
②只与突变探针杂交--突变基因为纯合子； ③与正常探针和突变探针都可杂交--突变基因为杂合子；
④与正常探针和突变探针都不能杂交--突变基因不属于已发
现的类型
.
8
（２）单链构象多态性（single strand conformation ploymorphism,SSCP)分析
是一种基于单链DNA构象差别来检测点突变的方 法．DNA变性形成单链，在中性条件下长度相同的单 链指DNA,如果碱基组成和(或)排列顺序不同,形成的 构象就不同,这样就形成了单链构象多态性.这些分子 在非变性PAGE中电泳中表现出不同的迁移率.
第16章 基因诊断
王慧莲
.
1
概述
• 几乎所有的疾病均在一定程度上与基因有某种联 系，基因的改变，或是疾病发生的原因，或是疾 病发生的结果，或是疾病发生时的伴随现象，而 这些现象的出现是有规律的。因此，可以通过检 测基因的改变来反映疾病的发生和发展，疗效和 预后
• 基因诊断：是以DNA或RNA为诊断材料，通过检查 基因的存在、缺陷或表达异常，对人体状态和疾 病作出诊断的方法和过程。
.
4
(一)核酸分子杂交技术
(1)方法:
以已知顺序核酸片段作为探针,经放射性或非放射性物质 标记后,再与未知的目的核酸片段进行杂交反应,分离已杂交 和未杂交的标记核酸链,通过标记信号的检测就可以对未知 的目的核酸链进行定性、定量分析.
(2)几种不同形式的核酸分子杂交
a. Southern印迹(southern blot)杂交: 用于DNA的检测，可 用于基因的限制性内切酶谱分析，基因突变分析等．
.
7
(二)PCR技术在基因诊断中的应用
（１）等位基因特异性寡聚核苷酸（allele specific oligonnucleotide,ASO)探针斑点杂交： PCR-ASO
该方法是诊断已知点的突变：需分别合成野生型和突变型探 针．在基因诊断时，只需用PCR扩增受检者目的DNA片段，再 分别与上述探针杂交．杂交的结果有如下几种情况： ① PCR扩增产物与正常探针杂交，不与突变探针杂交--不
• 基因突变导致的基因碱基组成或(和)顺序 发生改变,会在基因结构中产生新的限制性 内切酶位点或使原有的位点消失. 用限制 酶对不同个体基因组进行消化时，其电泳 条带的数目和大小就会产生改变，根据这 些改变可以判断出突变是否存在.
.
10
限制性片段长度多态性
RFLPs ( restriction fragment length polymorphisms)
.
2
基因诊断经历了三个基本发展阶 段
• 第一阶段：２０世纪８０年代，以DNA 分子杂交为基础，通过限制性片段长 度多态性性（RFLP)分析进行．
• 第二阶段：应用PCR技术． • 第三阶段：应用基因芯片技术．
.
3
第一节 基因诊断的基础技术
一 .基因诊断中常用的几种技术 （一） 核酸杂交 （二） PCR （三） DNA序列测定 （四） DNA芯片技术
b. Northern印迹(Northern blot)杂交: 用于RNA的检测，能 对组织细胞中的总RNA 或mRNA进行定性和定量分析．
c. 斑点杂交（dot blot): 既可以检测DNA也可以检测RNA,用 于特定基因及其表达的定性和定量分析．方法简单、灵敏； 但特异性低．
.
5
d. 原位杂交（in situ hybridization):
SSCP特别适于分析小于400bp 的 PCR产物。据认为SSCP 可以区分1bp的差异
PCR-SSCP分析不能确定基因变异的内容，因此电泳后结 果有差异后还需进行测序分析，确定变异性质
.
9
(3)限制性片段长度多态性（ restriction fragment length polymorphisms,RFLP）分析
优点：可靠，检出单碱基突变率可达９５％．
缺点：富含高熔点GC区时，则难以检测出突
变．
.
12
（５）用甲基化特异性PCR（methylationspecific PCR)进行分析
在PCR扩增前，先用化学试剂（NaHSO3)处理模板 DNA,将所有未甲基化的胞嘧啶（C)转变成尿嘧啶(U)， 在PCR扩增时，U与引物中A配对；而CpG岛上甲基化 的C不受影响，在扩增时仍与G配对,基于这种差异可 以进行甲基化特异性PCR．
用于一些疾病和肿瘤的基因诊断．
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(6)采用PCR技术对靶核酸进行定量分析
定量PCR(quantiative PCR, Q-PCR): 就是对 靶核酸分子进行定量分析的技术.根据PCR扩 增指数增长期原理，理论上扩增产物累积分 子数N=No(1+E)n,其中E是指每次循环中参与复 制的模板数与总模板数的比率.通过N值可求 出No. 但PCR扩增时平台期(15-25)的出现会 影响测量的准确度.定量PCR的策略和方法较 多.
e.
f.
是细胞学技术与核酸杂交技术结合的一种核
酸分析检测技术．可分为DNA原位杂交和RNA原位
杂交,用于检测染色体中特定的基因位置，用于
染色体疾病的诊断．
g.
分类: ① 玻片原位杂交:如中期的染色体和
组
h.
织切片.
i.
② 膜上原位杂交:将菌落或噬菌斑影印
在尼
j.
龙膜(如ຫໍສະໝຸດ Baidu酸纤维膜)
k.
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原位杂交的镜像图
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a. 通过测定PCR产物量 方法: 对已知量的靶DNA进行系列稀释,比较 待测样品和已知系列稀释样品的PCR产量,还 可对未知量的靶DNA进行绝对定量.
b. 采用极限稀释法对靶核酸进行定量分析: 方法:将待测DNA标本进行倍数稀释,直至扩
样 品 一
样 品 二
1987年,H.Donis-Keller等人以RFLP为遗传标记绘 制了第一张人类遗传图谱
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(4)PCR+变性梯度凝胶电泳分析技术
双链DNA在一定浓度变性剂(尿素,甲酰胺)作 用下,会变性而解链,导致DNA分子电泳迁移率 变化.当在不同梯度浓度变性胶中电泳时, DNA泳动到变性剂浓度能使DNA发生变性，DNA 开始解链，从而不同的DNA片段会形成不同的 迁移率条带．
存在这种突变；
②只与突变探针杂交--突变基因为纯合子； ③与正常探针和突变探针都可杂交--突变基因为杂合子；
④与正常探针和突变探针都不能杂交--突变基因不属于已发
现的类型
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（２）单链构象多态性（single strand conformation ploymorphism,SSCP)分析
是一种基于单链DNA构象差别来检测点突变的方 法．DNA变性形成单链，在中性条件下长度相同的单 链指DNA,如果碱基组成和(或)排列顺序不同,形成的 构象就不同,这样就形成了单链构象多态性.这些分子 在非变性PAGE中电泳中表现出不同的迁移率.
第16章 基因诊断
王慧莲
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概述
• 几乎所有的疾病均在一定程度上与基因有某种联 系，基因的改变，或是疾病发生的原因，或是疾 病发生的结果，或是疾病发生时的伴随现象，而 这些现象的出现是有规律的。因此，可以通过检 测基因的改变来反映疾病的发生和发展，疗效和 预后
• 基因诊断：是以DNA或RNA为诊断材料，通过检查 基因的存在、缺陷或表达异常，对人体状态和疾 病作出诊断的方法和过程。
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(一)核酸分子杂交技术
(1)方法:
以已知顺序核酸片段作为探针,经放射性或非放射性物质 标记后,再与未知的目的核酸片段进行杂交反应,分离已杂交 和未杂交的标记核酸链,通过标记信号的检测就可以对未知 的目的核酸链进行定性、定量分析.
(2)几种不同形式的核酸分子杂交
a. Southern印迹(southern blot)杂交: 用于DNA的检测，可 用于基因的限制性内切酶谱分析，基因突变分析等．
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(二)PCR技术在基因诊断中的应用
（１）等位基因特异性寡聚核苷酸（allele specific oligonnucleotide,ASO)探针斑点杂交： PCR-ASO
该方法是诊断已知点的突变：需分别合成野生型和突变型探 针．在基因诊断时，只需用PCR扩增受检者目的DNA片段，再 分别与上述探针杂交．杂交的结果有如下几种情况： ① PCR扩增产物与正常探针杂交，不与突变探针杂交--不
• 基因突变导致的基因碱基组成或(和)顺序 发生改变,会在基因结构中产生新的限制性 内切酶位点或使原有的位点消失. 用限制 酶对不同个体基因组进行消化时，其电泳 条带的数目和大小就会产生改变，根据这 些改变可以判断出突变是否存在.
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限制性片段长度多态性
RFLPs ( restriction fragment length polymorphisms)
.
2
基因诊断经历了三个基本发展阶 段
• 第一阶段：２０世纪８０年代，以DNA 分子杂交为基础，通过限制性片段长 度多态性性（RFLP)分析进行．
• 第二阶段：应用PCR技术． • 第三阶段：应用基因芯片技术．
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第一节 基因诊断的基础技术
一 .基因诊断中常用的几种技术 （一） 核酸杂交 （二） PCR （三） DNA序列测定 （四） DNA芯片技术
b. Northern印迹(Northern blot)杂交: 用于RNA的检测，能 对组织细胞中的总RNA 或mRNA进行定性和定量分析．
c. 斑点杂交（dot blot): 既可以检测DNA也可以检测RNA,用 于特定基因及其表达的定性和定量分析．方法简单、灵敏； 但特异性低．
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d. 原位杂交（in situ hybridization):
SSCP特别适于分析小于400bp 的 PCR产物。据认为SSCP 可以区分1bp的差异
PCR-SSCP分析不能确定基因变异的内容，因此电泳后结 果有差异后还需进行测序分析，确定变异性质
.
9
(3)限制性片段长度多态性（ restriction fragment length polymorphisms,RFLP）分析
优点：可靠，检出单碱基突变率可达９５％．
缺点：富含高熔点GC区时，则难以检测出突
变．
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12
（５）用甲基化特异性PCR（methylationspecific PCR)进行分析
在PCR扩增前，先用化学试剂（NaHSO3)处理模板 DNA,将所有未甲基化的胞嘧啶（C)转变成尿嘧啶(U)， 在PCR扩增时，U与引物中A配对；而CpG岛上甲基化 的C不受影响，在扩增时仍与G配对,基于这种差异可 以进行甲基化特异性PCR．