基因诊断和基因治疗.ppt

2、常用的PCR方法：
常规PCR、巢式PCR、多重PCR、多种PCR、 不对称PCR、反转录PCR、定量反转录PCR、mRNA 差异显示PCR、原位PCR、实时PCR等等。
3、在PCR技术基础上的常用基因诊断方法
PCR-SSCP法* PCR-ASO法 PCR-RFLP法 PCR-限制酶谱法 PCR-STR （ 短 串 联 重 复 序 列 ， short tandem
镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析
MstⅡ酶切位点(CCTNAGG)
5´
3´
1.15kb
A→T
×
正常基因
5´
3´
1.35kb
突变基因
镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析
﹣
1.35kb 1.15kb
0.2kb
+
正常人 突变携带着 患者
2、DNA-RFLP分析法
中性突变是指在人基因组中， 平均每200对碱基可发生一对变异的现 象。
一、基因诊断的概念和特点
（一）、定义 利用现代分子生物学和分子遗传学的技术
和方法，直接检测基因结构及其表达水平是否 正常，从而对疾病作出诊断的方法。
（二）、分类 DNA诊断—以DNA为检测对象的诊断方法。 RNA诊断—以mRNA为检测对象的诊断方法。
（三）、特点
针对性强 特异性高 灵敏度高 适用性强，诊断范围广
DNA多态性是指中性突变导致 个体间核苷酸序列的差异。
限制性片段长度多态性是指 DNA多态性若发生在限制性内切酶识别 位点上，酶切水解该DNA片段就会产生 长度不同的片段。
RFLP分析法
3、ASO杂交法
根据已知基因突变位点的核苷酸序列， 人工合成相应于正常和突变基因碱基序列的两 种寡核苷酸探针，用它们分别与受检者DNA进 行分子杂交来检测是否存在等位基因突变。
2、DNA限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)分 析法
3、等位基因特异寡核苷酸 (allele specific oligonucleotide, ASO)探针杂交法
1、限制性内切酶酶谱分析法
是利用限制性内切酶和特异性DNA探针来 检测是否存在基因变异的一种方法。
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二、 基因诊断常用技术方法
（一）、核酸分子杂交技术 （二）、聚合酶链反应 （三）、基因测序 （四）、基因芯片 （五）、DNA指纹
（一）、核酸分子杂交 (molecular hybridization)技 术
核酸分子杂交可用以检测 样本中是否存在与探针序列互 补的同源核酸序列。
核酸探针 是一类具有放射 性标记或化学标记的并与目的 目的DNA或RNA分子序列互补 的寡核苷酸片段。
repeat）
单链构象多态性 (single strand conformation polymorphism, SSCP)
SSCP是指相同长度的单链DNA因其碱 基序列不同，甚至单个碱基不同，都可能 形成不同的空间构象，从而在中性聚丙烯 酰胺凝胶电泳时泳动速率不同的现象。
PCR-SSCP分析
是指PCR产物变性后，经聚丙烯酰胺凝 胶电泳，正常基因和变异基因的迁移位置不同， 借此可分析确定致病基因的存在。
探针是能够同某种待研究的核 酸序列或蛋白多肽链特异结合的任 何分子，经标记之后可用来检测目 的DNA/RNA 或蛋白质分子。
实验流程：提取DNA→(限制酶 切)→凝胶电泳→膜转移→杂交→放 射自显影→分析
建立在核酸杂交技术基础上的常用基因诊断方法
1、限制性内切酶(restriction endonuclease) 酶谱分析法
（四）、基因芯片（gene chip)
基因芯片，又称DNA芯片、DNA阵 列 、 寡 核 苷 酸 微 芯 片 （ DNA chip 、 DNA arrays 、 oligonucleotide microchip）—是指将许多特定的寡核苷酸片段 或基因片段作为探针，有规律地排列固定 于支持物上，然后与待测的标记样品的基 因按碱基配对原理进行杂交，再通过激光 聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，并 配以计算机系统对每一探针上的荧光信号 作出比较和检测，从而迅速得出定性和定 量的结果。
﹣
+
正常人
纯合突变 杂合突变
Leber 遗传性神经病患者 PCR/SSCP分析 （线粒体DNA第11778位G→A所致）
（三）、基因测序(gene sequencing)
即测定某一基因的碱基序列。
实验流程：提取DNA→分离出有关基因 →测序→分析诊断
基因测序的方法： 化学裂解法 DNA链末端合成终止法 DNA自动测序
ASO杂交法
﹣
+
探针：M N N
M
N
MN
M
正常基因 纯合突变 杂合突变 基因缺陷
（新的突变类型？）
（二）、聚合酶链反应 (polymerase chain reaction, PCR)
是利用特异的引物，特异地扩增目 的DNA的方法。
实验流程：提取DNA→PCR→凝胶电泳→显 色→分析
1、基本工作原理
第二十一章
基因诊断与基因治疗
Genetic Diagnosis and Gene Therapy
基 因 诊
基因(gene)
基因是为生物活性产物编码 的DNA功能片断，这些产物主要是蛋 白质或各种RNA。
基因变异致病类型
内源基因的变异 基因结构突变 基因表达异常
外源基因的入侵
第一节
基因诊断
Gene Diagnosis
Template DNA 5
5 5
Cycle 1
Primer 1 5 Primer 2
5 5
5 5
Cycle 2
5 5
5
5
5
5
5 5
5 5
5 5
Cycle 3
5
5
5
5
5
5
5
5
5 5
5 5
25～30 次循环后，模板DNA的含量 可以扩大100万倍以上。
基因芯片的应用
1、在诊断中的应用 核酸序列分析、基因表达分析、
寻找新基因、突变基因和基因多态性检 测等 2、在药学研究中的应用
药物筛选、药物作用机制研究、 耐药菌株、药敏检测、毒理学研究、环 境化学毒物的筛选、基因扫描等
（五）、DNA指纹(DNA fingerprint)
在人基因组DNA中有高度可变的“小卫星” 区域，采用“小卫星”基因探针，在同一限 制酶切产物的DNA杂交图谱上，同一个体不 同组织来源的DNA的谱带完全一致，而不同 个体之间（同卵双生除外）谱带都不相同， 如同人的指纹具有高度个体特异性一样，因 此这种杂交图谱被称为DNA指纹或遗传指纹 （genetic fingerprint）。