基因诊断与基因治疗

细胞原位杂交
有
组织切片原位杂交 三类杂交
DNA-DNA
RNA-DNA RNA-RNA 该法优点： 不需提取核酸，故可完整保持组织或细胞的形态， 因而更能准确地反映组织细胞的功能状态。
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（二）聚合酶链反应(PCR，polymerase chain reaction)技术
PCR是体外基因扩增技术。它利用体内DNA复制的 原理和DNA变性与复性的性质进行目的基因DNA的大量 扩增。
1.
PCR基本原理：
PCR技术在模板、dNTP、Mg2+等条件下，用耐热的 Taq酶代替DNA聚合酶，用合成的DNA引物代替RNA引物， 经过DNA变性、引物与模板结合（复性）和延伸3个步 骤的循环过程（2530个循环），目的DNA可扩增100万 倍以上。
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（1）DNA模板的变性
将待扩增DNA加热到950C左右，使双链DNA解开成
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（3）引物延伸
将体系温度升到 720C左右，Taq聚合酶催化 dNTP
按碱基互补原则连接在DNA引物3ˊ端，使引物延伸，
形成两条与模板互补的新链。
以上为一次PCR循环（变性、复性和延伸）
（新合成的链可作为下一轮循环的模板）
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按照上述步骤重复操作，PCR产物呈指数扩增。 模板DNA 扩增倍数T=2n (n: 循环次数)。
基因诊断与基因 治疗
主讲：XX XX
XX大学XX医院
本章讨论二大方面内容
基因诊断
基因治疗
第一节
一.
基 因 诊 断
基因诊断概念 ：
利用现代分子生物学和分子遗传学的技
术方法，直接检测基因结构及其表达水平是 否异常，从而对疾病作出诊断的方法。
二.
基因诊断特点：
针对性强，特异性高
检测灵敏度和精确性高
实用性强，诊断范围广
（3）斑点杂交或狭缝杂交法： 基本过程： 将变性的DNA或RNA直接点到固相支持滤膜上→ 用标记探针与之杂交→自显影或显色反应→检测杂 交信号→分析结果。 优点：
简便、快速、灵敏、样本用量少；
缺点：
特异性不高，有一定比例的假阳性。
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（4）菌落杂交（colony hybridization）
该法可从大量细菌中筛选含特异的DNA序列及基因工程重组体。
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PCR技术原理示意图
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2.
PCR各要素及其作用 PCR模板可以是DNA或RNA。
（1） 模板 以线性DNA模板为佳，量适中，一般为102105个拷贝；
为单链（即：使模板DNA或延伸后的双链DNA发生热变性 ），
并游离于反应体系中作为模板；
（2）模板与引物的结合（退火或复性）
将体系温度降至合适温度（ 550C 左右），使加入 的引物与模板 DNA 两端（ 3ˊ端）碱基序列互补结合。
（由于加入的引物量远多于模板量，所以引物与模板的结合比
例远大于模板自身的复性）；
1.核酸分子杂交的分类
液相杂交： 待测核酸样本与特异性探针同时溶于杂交液中进行杂交 反应； 固相杂交： 待测核酸样本先结合到固相支持物上，再与溶液中的特 异性探针进行杂交反应。
常用固相杂交支持物： 硝酸纤维素膜、尼龙膜等－－－
2.核酸分子杂交（固相杂交）操作程序
制备待测核酸样品 制备核酸探针 标记核酸探针 加入标记核酸探针
分离、变性、转移、固化DNA片段
预杂交
杂交 漂洗去除未参与杂交的标记探针
检测杂交信号
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3. 常用固相核酸杂交方法 Southern 印迹杂交法（Southern blotting ）
Northern 印迹杂交法（Northern blotting ）
斑点杂交或狭缝杂交法 （Spot/ Slot blot hybridization）
三.
基因诊断常用技术方法
核酸分子杂交技术 聚合酶链反应（PCR）技术 生物芯片 基因测序
（一）核酸分子杂交技术
核酸分子杂交 是指单链核酸分子（DNA或RNA）在特定条件下，与 另一条互补的特异核酸链形成稳定双链的过程。 主要依据： 碱基互补、变性和复性 DNA与DNA杂交： A=T、 G≡C ; DNA与RNA杂交: A=U、 G≡C ; 变性： 碱基互补 在一定温度下，使核酸双链解开为两条单链； 复性： 随温度逐渐恢复，变性的两条单链重新形成互补双链
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（5）夹心杂交法（sanwich hybridization）
RE
A A A
片断A 检测探针
RE
B B
片段B捕捉探针
B
固 相 支 持 物
本法优点： 特异性强，对样本纯度要求不高，定量较准确。
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（6）原位杂交（nucleic acid hybridization in situ ）
将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，进 而检测特异的DNA或RNA序列。
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菌落杂交（colony hybridization） 夹心杂交法（sanwich hybridization）
原位杂交（nucleic acid hybridization in situ ）
(1) Southern 印迹杂交法 （Southern blotting ）
限制性内切酶酶切
检测杂交信号
提取DNA Southern 法可用于检测特异的DNA序列片断、基 因定位、分子量测定等。 13
（2）Northern 印迹杂交法 （Northern blotting ）
（其基本过程类似于上述Southern法）
提取RNA样本→RNA变性→琼脂糖凝胶电泳分离→ 转移至膜→探针（标记DNA或RNA）与之杂交→显影或 显色→检测信号。 Northern法可用于检测组织细胞中总RNA或mRNA
hybridization • DNA:DNA 5’ A T G C C G A T 3’ T A C G G C
DNA:RNA 5’ A T G C G T A 3’ U A C G C A U 5’ A U G C U A C G 3’ U A C G A U G C
RNA:RNA
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利用核酸双链的碱基互补、变性和复性的原理，可以用已 知碱基序列的单链核酸片段作为探针，与待测样本中的单链核 酸互补配对，以判断有无互补的同源核酸序列的存在。 核酸探针 是指带有标记的某一特定DNA或RNA片断，能与待测样本中 单链核酸分子互补配对结合，进而检测同源序列。 探针标记物 有放射性核素或非放射性核素（生物素、地高辛、荧光素等） 两大类。