基因诊断与基因治疗

hybridization • DNA:DNA 5’ A T G C C G A T 3’ T A C G G C
DNA:RNA 5’ A T G C G T A 3’ U A C G C A U 5’ A U G C U A C G 3’ U A C G A U G C
RNA:RNA
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利用核酸双链的碱基互补、变性和复性的原理，可以用已 知碱基序列的单链核酸片段作为探针，与待测样本中的单链核 酸互补配对，以判断有无互补的同源核酸序列的存在。 核酸探针 是指带有标记的某一特定DNA或RNA片断，能与待测样本中 单链核酸分子互补配对结合，进而检测同源序列。 探针标记物 有放射性核素或非放射性核素（生物素、地高辛、荧光素等） 两大类。
提取DNA Southern 法可用于检测特异的DNA序列片断、基 因定位、分子量测定等。 13
（2）Northern 印迹杂交法 （Northern blotting ）
（其基本过程类似于上述Southern法）
提取RNA样本→RNA变性→琼脂糖凝胶电泳分离→ 转移至膜→探针（标记DNA或RNA）与之杂交→显影或 显色→检测信号。 Northern法可用于检测组织细胞中总RNA或mRNA
1.
PCR基本原理：
PCR技术在模板、dNTP、Mg2+等条件下，用耐热的 Taq酶代替DNA聚合酶，用合成的DNA引物代替RNA引物， 经过DNA变性、引物与模板结合（复性）和延伸3个步 骤的循环过程（2530个循环），目的DNA可扩增100万 倍以上。
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（1）DNA模板的变性
将待扩增DNA加热到950C左右，使双链DNA解开成
为单链（即：使模板DNA或延伸后的双链DNA发生热变性 ），
并游离于反应体系中作为模板；
（2）模板与引物的结合（退火或复性）
将体系温度降至合适温度（ 550C 左右），使加入 的引物与模板 DNA 两端（ 3ˊ端）碱基序列互补结合。
（由于加入的引物量远多于模板量，所以引物与模板的结合比
例远大于模板自身的复性）；
1.核酸分子杂交的分类
液相杂交： 待测核酸样本与特异性探针同时溶于杂交液中进行杂交 反应； 固相杂交： 待测核酸样本先结合到固相支持物上，再与溶液中的特 异性探针进行杂交反应。
常用固相杂交支持物： 硝酸纤维素膜、尼龙膜等－－－
2.核酸分子杂交（固相杂交）操作程序
制备待测核酸样品 制备核酸探针 标记核酸探针 加入标记核酸探针
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菌落杂交（colony hybridization） 夹心杂交法（sanwich hybridization）
原位杂交（nucleic acid hybridization in situ ）
(1) Southern 印迹杂交法 （Southern blotting ）
限制性内切酶酶切
检测杂交信号
（3）斑点杂交或狭缝杂交法： 基本过程： 将变性的DNA或RNA直接点到固相支持滤膜上→ 用标记探针与之杂交→自显影或显色反应→检测杂 交信号→分析结果。 优点：
简便、快速、灵敏、样本用量少；
缺点：
特异性不高，有一定比例的假阳性。
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（4）菌落杂交（colony hybridization）
该法可从大量细菌中筛选含特异的DNA序列及基因工程重组体。
分离、变性、转移、固化DNA片段
预杂交
杂交 漂洗去除未参与杂交的标记探针
检测杂交信号
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3. 常用固相核酸杂交方法 Southern 印迹杂交法（Southern blotting ）
Northern 印迹杂交法（Northern blotting ）
斑点杂交或狭缝杂交法 （Spot/ Slot blot hybridization）
三.
基因诊断常用技术方法
核酸分子杂交技术 聚合酶链反应（PCR）技术 生物芯片 基因测序
（一）核酸分子杂交技术
核酸分子杂交 是指单链核酸分子（DNA或RNA）在特定条件下，与 另一条互补的特异核酸链形成稳定双链的过程。 主要依据： 碱基互补、变性和复性 DNA与DNA杂交： A=T、 G≡C ; DNA与RNA杂交: A=U、 G≡C ; 变性： 碱基互补 在一定温度下，使核酸双链解开为两条单链； 复性： 随温度逐渐恢复，变性的两条单链重新形成互补双链
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PCR技术原理示意图
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2.
PCR各要素及其作用 PCR模板可以是DNA或RNA。
（1） 模板 以线性DNA模板为佳，量适中，一般为102105个拷贝；
细胞原位杂交
有
组织切片原位杂交 三类杂交
DNA-DNA
RNA-DNA RNA-RNA 该法优点： 不需提取核酸，故可完整保持组织或细胞的形态， 因而更能准确地反映组织细胞的功能状态。
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（二）聚合酶链反应(PCR，polymerase chain reaction)技术
PCR是体外基因扩增技术。它利用体内DNA复制的 原理和DNA变性与复性的性质进行目的基因DNA的大量 扩增。
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（5）夹心杂交法（sanwich hybridization）
RE
A A A
片断A 检测探针
RE
B BLeabharlann 片段B捕捉探针B固 相 支 持 物
本法优点： 特异性强，对样本纯度要求不高，定量较准确。
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（6）原位杂交（nucleic acid hybridization in situ ）
将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，进 而检测特异的DNA或RNA序列。
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（3）引物延伸
将体系温度升到 720C左右，Taq聚合酶催化 dNTP
按碱基互补原则连接在DNA引物3ˊ端，使引物延伸，
形成两条与模板互补的新链。
以上为一次PCR循环（变性、复性和延伸）
（新合成的链可作为下一轮循环的模板）
按照上述步骤重复操作，PCR产物呈指数扩增。 模板DNA 扩增倍数T=2n (n: 循环次数)。
基因诊断与基因 治疗
主讲：XX XX
XX大学XX医院
本章讨论二大方面内容
基因诊断
基因治疗
第一节
一.
基 因 诊 断
基因诊断概念 ：
利用现代分子生物学和分子遗传学的技
术方法，直接检测基因结构及其表达水平是 否异常，从而对疾病作出诊断的方法。
二.
基因诊断特点：
针对性强，特异性高
检测灵敏度和精确性高
实用性强，诊断范围广