[课件]第08章 核酸药物与基因治疗PPT

（二）真核表达系统：传代细胞；酵母；生物反应器等。
1. 传代细胞：如CHO、BHK、Vero、MDCK等；
2. 酵母：毕赤（甲醇）酵母。 3. 生物反应器：如乳腺、血液、尿液、鸡蛋、昆虫等。 世界上第一个动物（山羊）乳腺生物反应器产品—重组人 抗凝血酶Ⅲ（商品名ATryn ）于2006年获准上市。由全球最著 名的动物乳腺生物反应器研发企业——美国Genzyme转基因公 司研制成功。
国外公司已开发的部分转基因动物产品
Development status of a selected list of proteins produced by transgenic animals 蛋白/肽
ABX-IL8 mAb ABX-EGF mAb a-1-抗胰蛋白酶 a-1蛋白酶抑制剂 β- IFN 胶原 II 因子 VII 因子 XI 纤维蛋白原 胰高血素样肽-1 人 GH HAS MSP-1 (疟疾苗) 蛋白 C 降钙素 (salmon) tPA
Abgenix,Medarex
Alexion,Biotransplant, Pharming, PPLTherapeutics Pharming, PPLTherapeutics PPL Therapeutics PPL Therapeutics
NATURE Biotechnology, October,2000 IGF-1 ,纤维蛋白原 绵羊
二、基因工程的基本步骤
目的基因获得 表达载体构建与鉴定 基因的导入 整合与表达的鉴定
核酸药物
表达产物的提取、纯化与鉴定
基因工程药物
第二节 基因工程中的方法学
一、基因工程的基本技术
（一）核酸的提取纯化
1. RNA提取纯化技术；
2. DNA提取纯化技术；
3. plasmid提取纯化技术。
（二）核酸电泳技术
表1. 部分已表达的蛋白质 重组蛋白
LA,α -LA, 单抗, 溶菌酶, Genetic
动物
牛
生产公司
Advanced Cell Technology,
GH, INS, HSA
Pharming ATⅢ,tPA,单抗,GH,α 1-抗胰蛋白酶
牛
山羊
Savings and Clone, Infigen,
1. 琼脂糖凝胶电泳 2. SDS-PAGE
（三）感受态细胞的制备与转化
真核细胞总RNA的电泳结果：
核酸电泳技术
1. 琼脂糖凝胶电泳
1 2 3 Βιβλιοθήκη Baidu 5
2. SDS-PAGE
2000 1000 750 500
200 100
1 DL2000 marker 2 BamHI和EcoRI双切 3 BamHI单切 4 HindⅢ单切 5 重组质粒pVAX1/ABPS1
基因文库（基因组文库和cDNA文库），化学合
成，PCR 等方法。还有DD-PCR以及基因芯片等技
术。 （一）基因组文库 目的：种质资源的保护；基因组测序；基因组 基因或调控序列的克隆等。
（二）cDNA文库的构建
五、表达载体（重组质粒）的构建与鉴定
1. DNA（载体和目的片段）的酶切与回收。
2. 目的片段与载体的连接。二者的摩尔比应满足以下
Genzyme Transgenics,Nexia Biotechnologies,PPL therapeutics
纤维蛋白原表面蛋白B,原胶原重组抗体 小鼠
凝血因子Ⅷ，蛋白C, 血红蛋白 PPLTherapeutics CT,IGF-1,IL-2,EPO,GH,细胞外SOD, a2-葡糖苷酶,糖原样肽 α 1-抗胰蛋白酶, 凝血因子Ⅷ,Ⅸ, 兔 兔 绵羊 猪
（三）受精卵
1.显微注射； 2.电穿孔技术； 3.精子载体； 4.ESC； 5.Virus Vector（ RT-V or Lentivirus-V）。
七、常用表达系统
（一）原核表达系统：包涵体；分泌型。
已成功的基因工程产品绝大部分是利用原核系统生产的， 如IFN、IL、TNF、G-CSF、GM-CSF等。
三、基因工程中的工具
（一）载体
1.质粒(plasmid) 2.粘粒(cosmid) 3.λ 噬菌体(λ phage)
（二）工具酶
1.限制性内切酶 2.外切酶 3.连接酶 4.聚合酶: klenow I 5.核酸酶
（三）宿主菌 DH5, JM101, JM109; DE3等
四、获得目的基因的方法
第08章 核酸药物与 基因治疗
第一节 基因工程原理简介
一、基因工程的定义
本义：根据人们的意愿，利用工程设计的方法，在体外将
克隆获得的目的基因与适当的载体进行切割和连接，构建成正 确的重组表达载体，再应用物理的、化学的或生物学的方法将 该表达载体导入到细菌、动植物细胞或受精卵中，使目的基因 在宿主体内以瞬时方式或稳定方式进行表达，借此研究目的基 因的结构与功能，或赋予宿主以新的遗传性状，或获得该基因 的表达产物。这一过程就是基因工程。 广义：转基因动物；克隆；基因打靶；基因组计划等均属 于基因工程的范畴。
二、一些重要技术原理介绍
重点：DNA双脱氧测序技术，核酸探针技术，
PCR技术等。（参见第5章）
（一）DNA双脱氧测序
（二）核酸杂交技术 （三）PCR技术
（四）目的基因的改造技术
1. 引物介导的基因定点突变技术
2. 盒式突变(cassette mutagenesis) 3. Genes Shuffling
比例：粘端：3~5:1；钝端：6~8:1 3. 转化与重组质粒的筛选、鉴定。 1）初步鉴定：抗性；α-互补；快速鉴定；原位杂交； PCR。 2）酶切鉴定：大小和方向。 3）测序鉴定：双脱氧测序法。
六、基因导入技术
（一）细菌
1.氯化钙； 2.电穿孔技术。
（二）细胞
1.脂质体； 3.电穿孔； 5.Virus Vector。 2.磷酸钙； 4.显微注射；
公司
Abgenix Abgenix PPL Therapeutics Genzyme Transgenics Genzyme Transgenics Pharming PPL Therapeutics PPL Therapeutics PPL Therapeutics PPL Therapeutics Genzyme Transgenics Genzyme Transgenics Genzyme Transgenics PPL Therapeutics PLL Therapeutics Genzyme Transgenics