第21章基因诊断与基因治疗第二十一章

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（一）、核酸分子杂交 (molecular hybridization)技术
核酸分子杂交可用以检测 样本中是否存在与探针序列互 补的同源核酸序列。
核酸探针 是一类具有放射 性标记或化学标记的并与目的 目的DNA或RNA分子序列互补 的寡核苷酸片段。
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探针是能够同某种待研究的核 酸序列或蛋白多肽链特异结合的任 何分子，经标记之后可用来检测目 的DNA/RNA 或蛋白质分子。
常规PCR、巢式PCR、多重 PCR、多种PCR、不对称PCR、反 转录PCR、定量反转录PCR、 mRNA差异显示PCR、原位PCR、 实时PCR等等。
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3、在PCR技术基础上的常用基因诊断方法
PCR-SSCP法* PCR-ASO法 PCR-RFLP法 PCR-限制酶谱法 PCR-STR（短串联重复序列，short
和方法，直接检测基因结构及其表达水平是否 正常，从而对疾病作出诊断的方法。
（二）、分类 DNA诊断—以DNA为检测对象的诊断方法。 RNA诊断—以mRNA为检测对象的诊断方法。
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Leabharlann Baidu
（三）、特点
针对性强 特异性高 灵敏度高 适用性强，诊断范围广
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二、 基因诊断常用技术方法
（一）、核酸分子杂交技术 （二）、聚合酶链反应 （三）、基因测序 （四）、基因芯片 （五）、DNA指纹
是指PCR产物变性后，经聚丙 烯酰胺凝胶电泳，正常基因和变异 基因的迁移位置不同，借此可分析 确定致病基因的存在。
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﹣
+
正常人
纯合突变 杂合突变
Leber 遗传性神经病患者 PCR/SSCP分析 （线粒体DNA第11778位G→A所致）
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（三）、基因测序(gene sequencing)
即测定某一基因的碱基序列。
实验流程：提取DNA→分离出有关基因 →测序→分析诊断 基因测序的方法： 化学裂解法 DNA链末端合成终止法 DNA自动测序
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（四）、基因芯片（gene chip)
基因芯片，又称DNA芯片、DNA阵 列、寡核苷酸微芯片（DNA chip、DNA arrays、oligonucleotide microchip）—是指将许多特定的寡核苷酸片段 或基因片段作为探针，有规律地排列固定 于支持物上，然后与待测的标记样品的基 因按碱基配对原理进行杂交，再通过激光 聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，并 配以计算机系统对每一探针上的荧光信号 作出比较和检测，从而迅速得出定性和定 量的结果。
tandem repeat）
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单链构象多态性 (single strand conformation polymorphism, SSCP)
SSCP是指相同长度的单链DNA因其碱 基序列不同，甚至单个碱基不同，都可能 形成不同的空间构象，从而在中性聚丙烯 酰胺凝胶电泳时泳动速率不同的现象。
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PCR-SSCP分析
实验流程：提取DNA→(限制酶 切)→凝胶电泳→膜转移→杂交→放 射自显影→分析
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建立在核酸杂交技术基础上的常用基因诊断方法
1、限制性内切酶(restriction endonuclease) 酶谱分析法
2、DNA限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)分 析法
3、等位基因特异寡核苷酸 (allele specific oligonucleotide, ASO)探针杂交法
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1、限制性内切酶酶谱分析法
是利用限制性内切酶和特异性 DNA探针来检测是否存在基因变异 的一种方法。
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镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析
MstⅡ酶切位点(CCTNAGG)
5´
第21章基因诊断与基因治疗第二十一章
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基因(gene)
基因是为生物活性产物编码的 DNA功能片断，这些产物主要是蛋 白质或各种RNA。
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基因变异致病类型
内源基因的变异 基因结构突变 基因表达异常
外源基因的入侵
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第一节
基因诊断
Gene Diagnosis
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一、基因诊断的概念和特点
（一）、定义 利用现代分子生物学和分子遗传学的技术
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ASO杂交法
﹣
+
探针：M N M N M N M N 正常基因 纯合突变 杂合突变 基因缺陷 （新的突变类型？）
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（二）、聚合酶链反应
(polymerase chain reaction, PCR)
是利用特异的引物，特异地扩 增目的DNA的方法。
实验流程：提取DNA→PCR→ 凝胶电泳→显色→分析
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1、基本工作原理
Template DNA 5
5 5
Cycle 1
Primer 1 5 Primer 2
5 5
5 5
Cycle 2
5 5
5
5
5
5
5 5
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5 5
5 5
Cycle 3
5
5
5
5
5
5
5
5
5 5
5 5
25～30 次循环后，模板DNA的含量 可以扩大100万倍以上。
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2、常用的PCR方法：
3´
1.15kb
A→T
×
正常基因
5´
3´
1.35kb
突变基因
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镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析
﹣
1.35kb 1.15kb
0.2kb
正常人
突变携带着 患者
+
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2、DNA-RFLP分析法
中性突变是指在人基因组中，平均 每200对碱基可发生一对变异的现象。
DNA多态性是指中性突变导致个 体间核苷酸序列的差异。
限制性片段长度多态性是指DNA多 态性若发生在限制性内切酶识别位点 上，酶切水解该DNA片段就会产生长度 不同的片段。
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RFLP分析法
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3、ASO杂交法
根据已知基因突变位点的核苷 酸序列，人工合成相应于正常和突 变基因碱基序列的两种寡核苷酸探 针，用它们分别与受检者DNA进行 分子杂交来检测是否存在等位基因 突变。
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基因芯片的应用
1、在诊断中的应用 核酸序列分析、基因表达分析、寻找
新基因、突变基因和基因多态性检测等 2、在药学研究中的应用
药物筛选、药物作用机制研究、耐药 菌株、药敏检测、毒理学研究、环境化 学毒物的筛选、基因扫描等
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（五）、DNA指纹(DNA fingerprint)
在人基因组DNA中有高度可变的“小卫星” 区域，采用“小卫星”基因探针，在同一限 制酶切产物的DNA杂交图谱上，同一个体不 同组织来源的DNA的谱带完全一致，而不同 个体之间（同卵双生除外）谱带都不相同， 如同人的指纹具有高度个体特异性一样，因 此这种杂交图谱被称为DNA指纹或遗传指纹 （genetic fingerprint）。