ELISA检测方法中最佳封闭液和样品稀释液的筛选研究_杜改梅
elisa样品稀释技巧
在ELISA实验中，样品的稀释是一个重要的步骤。
以下是一些样品稀释的技巧：
确定稀释倍数：根据实验要求和试剂盒说明书，确定合适的稀释倍数。
通常情况下，ELISA试剂盒都会提供参考浓度范围，可以根据这个范围确定稀释倍数。
准备稀释液：选择合适的稀释液，可以是生理盐水、PBS等。
确保稀释液的质量和纯净度，避免使用含有杂质或沉淀的稀释液。
混合样品：将待测样品与稀释液按照一定比例混合，可以采用手动或自动混匀器进行混合。
确保混合均匀，避免出现沉淀或分层现象。
检测样本：将稀释后的样本加入ELISA板中，按照试剂盒说明书的要求进行后续的孵育、洗涤和检测步骤。
注意遵守实验操作规程，避免操作过程中的误差。
数据分析：根据实验数据，进行统计分析，得出结论。
注意数据处理和分析的正确性，确保结果的可靠性。
需要注意的是，不同实验样本的稀释方法可能有所不同，具体的稀释技巧需要根据实验要求和样本性质来确定。
同时，要保证实验操作过程中的清洁卫生，避免污染和交叉污染。
ELISA操作规程
ELISA操作规程一、引言ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的免疫学实验技术，用于检测特定抗原或者抗体的存在和浓度。
本文将介绍ELISA的操作规程，包括试剂准备、样品处理、板上反应、洗涤、检测和数据分析等步骤。
二、试剂准备1. 缓冲液的配制：根据实验需求，选择适当的缓冲液配方。
常用的缓冲液有PBS、TBST等。
按照配方将所需试剂溶解于适当的体积的去离子水中，并进行调节和混合。
确保所有试剂的pH值和浓度符合实验要求。
2. 标准曲线的制备：准备一系列已知浓度的标准样品，按照实验设计的需求进行稀释。
标准样品的浓度应该覆盖实验样品的范围，并且至少包含一个空白对照。
3. 酶标板的涂覆：根据实验需要，选择合适的酶标板（如96孔板），将需要检测的抗原或者抗体溶解在适当的缓冲液中，按照要求的浓度将其加入到酶标板的孔中。
尽量避免气泡的产生，并确保涂覆均匀。
三、样品处理1. 样品采集：根据实验目的，选择合适的样品类型（如血清、尿液、细胞上清等），并进行采集。
确保样品的采集过程符合规范，避免污染和损坏。
2. 样品稀释：根据实验要求，将样品进行适当的稀释。
通常，样品的初始浓度较高，需要进行多次稀释以使其浓度在标准曲线范围内。
3. 预处理：根据实验需求，对样品进行预处理，如去除杂质、离心沉淀等。
确保样品的处理过程不会影响到所需的分析结果。
四、板上反应1. 标准样品的加入：将标准样品按照实验设计的要求加入到酶标板的孔中。
每一个标准样品应该有至少两个孔进行重复测量，以提高结果的可靠性。
2. 样品的加入：将稀释后的样品加入到酶标板的孔中。
同样，每一个样品应该有至少两个孔进行重复测量。
3. 阳性和阴性对照的加入：为验证实验的准确性，加入阳性和阴性对照。
阳性对照顾该包含所需的抗原或者抗体，而阴性对照则不含。
4. 孔板的封闭：将酶标板封闭，避免样品的蒸发和污染。
可以使用密封膜或者盖板进行封闭。
五、洗涤1. 洗涤缓冲液的配制：根据实验要求，配制适当的洗涤缓冲液。
ELISA实验中给检测样本加样的步骤详解
ELISA实验中给检测样本加样的步骤详解：
1.细胞上清：前处理必须是细胞离心去除，每孔直接加100μl即可。
如果浓度太高需稀释时，用标准品稀释液直接稀释。
2.脑脊液：前处理必须是细胞离心去除，每孔直接加100μl即可。
如果浓度太高需稀释时，用标准品稀释液直接稀释。
3.血清血浆：加入50 ul样本分析缓冲液后加50 ul标本,如稀释量大，请将样本与样本分析缓冲液等量加入，不足部分用标准品稀释液补充至100ul。
①血清标本应是自然凝固后，取上清，避免在冰箱中凝固血液；
②血浆标本，推荐用EDTA的方法收集若待测样本不能及时检测，标本收集后请分装，冻存于－20℃，避免反复冻融。
③血清标本不应添加任何防腐剂或抗凝剂；
④标本应清澈透明，检测前样本中如有悬浮物应通过离心去除。
⑤请勿使用溶血，高血脂或污染的标本检测，否则结果将不准确。
4.组织匀浆液的样本：要制备过程中需要在缓冲液中加入蛋白酶抑制剂，防止蛋白成份被内源性蛋白酶降解，造成检测结果的值偏低。
因组织匀浆液的样本蛋白种类多，含量丰富，实验参照血清血浆标本的处理方法进行，否则就会影响实验结果。
具体是加入50 ul样本分析缓冲液后加50 ul标本，需稀释时，请将样本与样本分析缓冲液等量加入，不足部分用标准品稀释液补充至100ul。
酶联免疫吸附测定中封闭液的作用与选择
酶联免疫吸附测定中封闭液的作用与选择摘要酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）的基础是抗原或抗体的固相化和抗原或抗体的酶标记。
测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）需先与固相载体表面的抗原或抗体起反应，结合在固相载体表面（包被）。
由于抗原或抗体包被时的浓度较低，故还需用大量不相关的蛋白充填固相载体表面空隙（封闭），使之避免在ELISA其后步骤中吸附干扰物质而影响测定。
本文概要介绍ELISA中各种常用封闭液的作用与选择。
ABSTRACT Enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）is based on the immobilization of antigen or antibody and the enzymatic labeling of antigen or antibody. At the time of determination，the specimen to be examined （antibody or antigen therein）needs to first react with the antigen or antibody on the surface of the solid support and then bind to the surface of the solid support （coating）. Due to the low concentrations of the coated antigen or antibody，a large amount of irrelevant proteins are also needed to fill the spacing on the solid support surface （closed），thus to avoid adsorption of interfering substances that may affect the determination in the subsequent steps of the ELISA. The role and selection of various commonly used blocking solutions in ELISA are outlined in this article.KEy WORDS enzyme-linked immunosorbent assay；blocking solution；coating substance自1971年Engvall和Perlmann發表了应用酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法定量测定免疫球蛋白G的论文后，1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术逐渐发展成为测定液体标本中微量物质的常用方法。
ELISA操作规程
ELISA操作规程标题：ELISA操作规程引言概述：ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的生物化学分析技术，广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物研发等领域。
本文将详细介绍ELISA的操作规程，包括实验前准备、试剂配制、板涂覆、标准曲线绘制、样品检测等五个部分。
一、实验前准备：1.1 清洗实验用具：使用去离子水和洗涤剂彻底清洗酶标仪、试剂瓶、试管、多孔板等实验用具，确保无任何污染物残留。
1.2 检查试剂有效期：查看试剂瓶上的标签，确保试剂的有效期未过期，避免实验结果的误差。
1.3 准备实验台：清洁实验台面，并准备好所需的实验用品，如移液器、离心机、显微镜等。
二、试剂配制：2.1 样品稀释液的配制：根据实验需要，选择适当的稀释液，如PBS（磷酸盐缓冲液）或BSA（牛血清白蛋白）溶液，并按照比例将其与样品混合。
2.2 酶标板涂层液的配制：将涂层抗体或抗原稀释至适当浓度，并将其均匀涂布在酶标板上，以便捕获待测物。
2.3 酶标记液的配制：将酶标记的抗体与酶底物反应，形成酶标记复合物，用于检测酶标板上的待测物。
三、板涂覆：3.1 预处理酶标板：将酶标板孔位用PBS或BSA溶液预处理，以避免非特异性吸附。
3.2 加入涂层液：将配制好的涂层液加入到酶标板孔位中，保持孔位内液体的均匀分布，避免气泡的产生。
3.3 孵育酶标板：将涂层的酶标板在适当的温度和时间下进行孵育，以促使待测物与涂层抗体或抗原发生特异性结合。
四、标准曲线绘制：4.1 准备标准品：选择适当的标准品，按照不同浓度进行稀释，以建立标准曲线。
4.2 加入标准品：将不同浓度的标准品加入到酶标板孔位中，每个浓度设置多个重复孔位，以获得可靠的结果。
4.3 检测与测定：使用酶标仪测定各个孔位的吸光度值，并根据标准品的吸光度值绘制标准曲线，以后续样品的检测提供参考。
五、样品检测：5.1 样品处理：将待测样品与稀释液混合，并按照操作规程将混合液加入到酶标板孔位中。
elisa操作方法
elisa操作方法Elisa操作方法一、概述Elisa是一种常用的酶联免疫吸附实验技术，被广泛应用于生物医学研究和临床诊断中。
本文将介绍Elisa的操作方法，包括试剂准备、样品处理、板涂覆、孵育、洗涤、检测等步骤。
二、试剂准备1. 根据实验设计，准备所需的试剂，包括酶标板、抗原或抗体、底物、洗涤缓冲液、稀释缓冲液等。
2. 检查试剂是否过期，确保其质量可靠。
三、样品处理1. 收集样品，并根据实验需要进行适当的处理，如离心、稀释等。
2. 保持样品的稳定性，避免冻融和长时间暴露在室温下。
四、板涂覆1. 将酶标板中的孔加入适量的抗原或抗体，尽量均匀涂覆。
2. 使用封闭剂封闭孔，避免非特异性结合。
五、孵育1. 将板密封，置于恒温箱中进行孵育，确保温度和湿度的稳定。
2. 孵育时间根据实验需求进行设定，一般为1-2小时。
六、洗涤1. 将洗涤缓冲液加入酶标板孔中，轻轻摇晃或使用洗涤器进行洗涤，去除非特异性结合物质。
2. 反复洗涤3-5次，每次洗涤时间约1-2分钟。
七、检测1. 加入标记有酶的抗体或底物，与特异性结合物发生反应。
2. 反应结束后，加入停止液终止反应，阻止进一步的底物转化。
3. 使用酶标仪测量吸光度，获取实验结果。
八、数据分析1. 根据实验目的和样品特点，选择适当的统计方法和数据处理软件进行数据分析。
2. 统计分析实验结果，得出结论，并将结果进行图表展示。
九、结果解读1. 根据实验目的和已有知识，对实验结果进行解读和讨论。
2. 分析可能存在的误差和限制，并提出改进意见。
十、实验注意事项1. 严格遵守实验室操作规范，保证实验的准确性和可靠性。
2. 避免交叉污染，使用干净的实验器具和试剂。
3. 注意试剂的保存条件和有效期。
4. 控制实验条件的一致性，确保实验结果的可比性。
十一、结论Elisa操作方法是一种重要的生物分析技术，通过合理的实验设计和操作流程，可以获得准确可靠的实验结果。
熟练掌握Elisa的操作方法，对于生物医学研究和临床诊断具有重要意义。
ELISA操作方案
ELISA操作方案ELISA（酶联免疫吸附试验），是一种用来检测抗原或抗体在生物样本中的定量或半定量分析方法。
它是一种快速、准确、经济的实验技术，广泛应用于医学诊断、病毒学和免疫学研究中。
以下是进行ELISA实验的操作方案。
材料准备：1.酶标板：96孔的微孔板。
2.抗原和抗体：包括待检测抗原和抗体，以及阳性和阴性对照抗体。
3.缓冲液：ELISA实验需要的缓冲液，如PBS、TBS等。
4.酶标记抗体：如辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗体。
5.补体或底物溶液：根据实验需要准备。
操作步骤：1.酶标板涂覆：将待检测抗原溶液加入酶标板的孔中，一般每孔加入100-200μl，密封板子，放置在4℃的冰箱中过夜或较长时间，以便抗原充分吸附在酶标板表面。
2.孔洗涤：将涂覆了抗原的酶标板倒置，用洗涤缓冲液轻轻洗涤每个孔，洗涤3-4次，以去除未结合的抗原。
3.孔封闭：将酶标板孔加入蛋白封闭剂，封闭非特异性位点，减少非特异性结合。
4.给孔的抗原加入特异性抗体：将稀释好的抗体加入孔中，孔中的抗原和抗体进行特异性结合。
孔中每次加入100-200μl，孔盖密封，室温孵育1-2小时。
5.孔洗涤：与步骤2一致，洗涤3-4次。
6.添加酶标记抗体：将标记有辣根过氧化物酶（HRP）的抗体加入每个孔中，与特异性抗体结合，形成抗原-抗体-HRP复合物。
孔中每次加入100-200μl，孔盖密封，室温孵育1-2小时。
7.孔洗涤：与步骤2一致，洗涤3-4次。
8.酶底物添加：将POS底物溶液加入每个孔中，与酶标记抗体结合的HRP催化产生显色反应，形成可见的颜色。
9.停止反应：将酶底物反应停止剂加入每个孔中，停止HRP的催化反应，防止进一步的颜色生成。
10.检测与数据分析：使用酶标仪测量每个孔中的吸光度或荧光强度，并根据标准曲线将数据进行定量或半定量分析。
注意事项：1.实验前准备材料、试剂和设备，确保其干净、无污染。
2.保持操作环境的清洁，避免异物和污染的干扰。
ELISA试剂及溶液配制及实验步骤
ELISA试剂及溶液配制及实验步骤一、ELISA试剂及溶液的配制：1. 淋洗缓冲液（Washing buffer）的配制：将20倍浓度的淋洗缓冲液稀释至适当浓度，一般浓度为1×淋洗缓冲液。
淋洗缓冲液的配制方法是将1份浓缩淋洗缓冲液加入19份去离子水中。
2. 反应底物（Substrate）的配制：根据试剂商提供的说明书配制相应的底物。
不同的ELISA实验可能要求使用不同的底物，常见的有TMB （3,3',5,5'-四甲基苯基丙二胺）、ABTS（2,2'-联氨基双叔丁酸）等。
3. 试剂盘（Plate）的包装打开：将试剂盘从密封袋中取出，避免试剂盘受到灰尘或其他污染物。
4. 标准品（Standard）的配制：先将标准品重新悬浮均匀，然后按照试剂商提供的说明书中所述的浓度进行适当倍数的稀释，以得到一系列浓度的标准曲线。
5. 吸收剂（Coating buffer）的配制：根据试剂商提供的说明书配制相应的吸收剂。
吸收剂的配制方法是将1份浓缩吸收剂加入9份去离子水中。
二、ELISA实验步骤：1.试剂准备：将ELISA试剂和溶液按照上述步骤进行配制，确保试剂的浓度、摄取方式和平衡温度等参数符合实验要求。
2.板预处理：用淋洗缓冲液洗涤孔板，每孔洗涤3次，倒掉洗涤液后用吸水纸吸干。
3.标准曲线制备：在孔板的一列孔中加入不同浓度的标准品，通常是0、1、2、5、10等倍数的浓度，每个标准品重复做3次。
将每个标准品孔封闭，孵育一段时间。
4.样品处理：将待测样品依次加入其它的孔中，每个样品重复做3次。
同时将一些空白对照（不加样品）进行处理。
将每个样品孔封闭，孵育一段时间。
5.淋洗步骤：用淋洗缓冲液洗涤孔板，每孔洗涤3次，倒掉洗涤液后用吸水纸吸干。
6.探针孵育：将酶标抗体溶液加入每个孔并封闭，孵育一段时间。
7.淋洗步骤：用淋洗缓冲液洗涤孔板，每孔洗涤3次，倒掉洗涤液后用吸水纸吸干。
8.底物加入：将已配制好的底物加入每个孔中，孵育一段时间，使酶标物与底物发生反应。
两种样品稀释液对口蹄疫O型抗体ELSIA检测结果的影响研究
愛用严 _ 2019年（第4。
卷畑期 ■囂色序紐嶷㉚两种样品稀释液对口蹄疫0型抗体ELSIA桧测结果的影响研克耿玉静，吕园园，杨 志，李秀梅,任雪建，吴 彬（洛阳现代生物技术研究院有限公司，河南洛阳471000）摘要：以样品稀释液1和样晶稀释液2分别对55份血清进行稀释，按照竞争ELSIA 方法进行检验，比较两 种稀释液对检测结果的影响。
结果用样晶稀释液2稀释的血清检测结果明显较稳定，偏差缩小，有利于提高试 剂盒检测结果的准确性。
关键词：样晶稀释液；竞争ELISA ;准确性中图分类号:S852F2 文献标识码:B 口蹄疫是由口蹄疫病毒感染引起的以偶蹄动物为主 的急性、热性、高度传染性疫病，能够感染多种偶蹄家畜，使动物生产性能下降，给动物生产造成巨大的经济损失，被国际兽医局（OIE ）列为一类传染病。
抗体检测在口蹄疫的诊断及免疫监测中具有重要作用，开发一种稳定、高 效的检测方法很有必要。
1材料1.1样品稀释液样品稀释液 1:称取 Na 2HPO 4 2.9 g. KH 2PO 4 0.2 g 、 NaCl 8 g 、KCl 0.2 g,加入800 ml 双蒸水搅拌溶解,再称取BSA 10 g 加入，量取PROCLIN-300 500 口、吐温-20 lml加入，而后加双蒸水定容至1 000 ml,过滤除菌，无菌定量 分装,2~8七保存。
样品稀释液2：Na 2HPO 4 2.9g.KH 2PO 4 0.2 g 、NaCl 8 g 、 KC1 0.2 g,加入800 ml 双蒸水搅拌溶解，再称取EDTA-2Na 5 g 、酪蛋白10 g ：聚氧乙烯月桂瞇0.2 g 加入，量取1 ml PROCLIN-300,2 ml 曲拉通X-100加入,搅拌均匀，而后加双蒸水定容至1 000 ml,过滤除菌，无菌定量分文章编号:1004-5090（2019）04-0010-02装,2~8七保存。
1.2检测样晶从规模化猪场、牛场、羊场采集的免疫和非免疫血清， 经韩国金诺口蹄疫O 型抗体检测试剂盒检测，口蹄疫0型 病毒阳性血清14份、阴性血清10份。
ELISA封闭液(1%BSA)
ELISA 封闭液(1%BSA)简介：平衡盐溶液(Balanced Salt Solution ，BSS)与细胞生长状态下的pH 值、渗透压等环境状态一致，具有维持渗透压、控制酸碱平衡、供给细胞生存代谢所必需的能量和无机盐成分等作用，可满足体外实验中细胞生存并维持一定的代谢的基本需要。
Leagene ELISA 封闭液(1%BSA)主要由磷酸氢二盐、磷酸二氢盐、BSA 、防腐剂等组成，主要用于ELISA 实验中对96孔板或其他固相载体进行封闭处理。
本试剂仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。
组成：自备材料：1、 96孔板其他固相载体2、 水浴锅操作步骤(仅供参考)：1、 按要求包被96孔板。
2、 用ELISA 洗涤液(1×,pH7.4)洗涤数次。
3、 对96孔板或其他固相载体进行封闭处理，一般 2-3h 。
4、 封闭完成后，将包被好的96孔板拍干、密封，4℃保存备用或加入包被缓冲液4℃保存备用。
5、 加入配制好的显色底物100μl ，水浴20min 。
6、 加入ELISA 终止液25μl 终止ELISA 反应。
注意事项：1、 注意密闭保存，避免挥发。
一旦开封，保质期就会大大缩短。
2、 封闭是否必要取决于ELISA 的模式及具体实验条件。
3、 并非所有的ELISA 固相均需封闭，封闭不当反而会使阴性本地增高。
4、 本试剂属于营养物质，注意无菌操作，尽量避免污染。
5、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
编号 名称 IT0028 Storage ELISA 封闭液(1%BSA) 100ml 4℃ 使用说明书 1份有效期：6个月有效。
亦可短期内室温存储。
相关：编号名称DC0032 Masson三色染色液DH0006 苏木素伊红(HE)染色液NR0003 Lezol(总RNA提取试剂)PW0082 丽春红S染色液(1×Ponceau S)TC0699 葡植物总糖和还原糖检测试剂盒(硝基水杨酸法)。
酶联生物elisa流程
酶联生物elisa流程如下：
1.用包被液将抗体稀释至蛋白质含量为0.5-20 μg/ml，按100ul/孔
加入酶标板，4℃包被过夜。
2.次日弃去孔内液体，在纸巾上轻轻扣打以吸去残留液体，加入
洗涤液（约280-300ul/孔），漂洗2-3次，每次3-5min。
3.按200-250ul/孔加入封闭液，室温2-3小时或37℃1-2小时，也
可4℃封闭过夜，然后弃去孔内封闭液。
4.用洗涤液或样品稀释液将待检样品（含未知抗原）稀释至所需
浓度。
5.按100ul/孔加入标准品和待测样品，37℃孵育1小时。
6.洗去多余未键结标准品和待测样品，加入带有酵素之二次抗体，
与抗原键结。
7.洗去多余未键结二次抗体，加入酵素底物使酵素呈色，以肉眼
或仪器读取呈色结果。
WBELISAIHCFC实验指南：如何选择合适的对照剂和封闭剂？
FabuLight™ Fab片段抗体
Western Blotting实验
可能遇到的问题
解决办法
适用试剂
出现非特异性条带
在用一抗孵育前，使用适当的阻断试剂阻断膜
标准血清（5%v/v）（血清应与标记的抗体种属来源一致），或BSA（5%w/v）（不含IgG蛋白和蛋白酶）
如果使用来自山羊、马或绵羊的一级抗体，则避免使用牛奶或牛血清白蛋白。牛的IgG可能与抗体相互作用，这是由于近缘种的同源表位。
标准血清（5%v/v）（血清应与标记的抗体种属来源一致）
IP后WB实验时，目标蛋白分子量位于25kDa或25kDa附近时，想要消除来自IP实验的抗体干扰
为了避免检测到50 kDa的抗体重链，使用抗轻链特异性的二抗。
30年的专注30年的发展jir公司除了提供各种酶标如鼠兔酶标二抗及荧光二抗alexafluor系列cy3cy5pe等荧光标记种类丰富涉及物种齐全标记多样应用wbifihcfc广泛性价比高
WBELISAIHCFC实验指南：如何选择合适的对照剂和封闭剂？
你是否遇到过以下几种难题，IHC实验结果不准确，背景高；多标记免疫组化实验中一抗种属来源相同时，不知该如何进行实验；IP/Co-IP后的WB实验出现非特异性条带；流式实验中没有合适的直标一抗......你是否知道通过选择正确的对照剂和封闭剂，可以帮助你解决这些实验中遇到的难题，且更容易获得准确的实验结果。本文将给大家带来流式细胞实验、WB、ELISA、IHC几大实验中常见的问题，及解决办法。
无信号
使用阳性对照证明带标记二抗的活性，并在孵育了一抗同型对照后直接用二抗来检测
ChromPure™纯化蛋白
关于使用牛血清白蛋白(BSA)和牛奶作为封闭剂的Tips：
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
ELISA检测方法中最佳封闭液和样品稀释液的筛选研究杜改梅1,2，刘茂军1，陈熠夕1，韦艳娜1，甘源1，吴叙苏，邵国青17（1. 江苏省农业科学院兽医研究所，农业部兽用生物制品工程技术重点实验室，国家兽用生物制品工程技术研究中心，南京，210014；2. 金陵科技学院，动物科学与技术学院，南京，210038）酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay ELISA）是Engvall和Perlman（1971）首次报道建立的一种生物活性物质微量测定技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断，也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定。
该方法不仅适用于临床标本的检查，而且也适合于血清流行病学调查，以其灵敏度高（可达ng，甚至pg 水平）、特异性好等优点，在生命科学领域得到广泛应用[1,2]。
近年来，国内外有关建立ELISA检测方法的研究报道较多，但商品化试剂盒却较少，特别是国内。
其主要原因是该检测方法达不到理想的敏感性和特异性。
ELISA检测方法操作步骤虽简单，但影响因素较多，封闭是其中最重要的影响因素之一。
封闭不当会直接影响ELISA检测方法的敏感度和特异性，产生假阳性结果，导致疾病误诊，造成不良后果；此外，良好的封闭液还可以发挥稳定剂和保护剂作用，提高酶标板的保存期；反而，不佳封闭液还会干扰各种试剂的反应。
因此，在检测过程中，为了避免过高的阴性本底影响检测结果的判断，样本必须要先行稀释，样品稀释液也是影响ELI SA检测的一个重要因素。
稀释液选择不佳反而会提高阴性本底，增强非特异性反应。
因此，选择最佳封闭液和样品稀释液是提高ELISA检测方法敏感性和特异性的关键，对建立良好的ELISA检测方法具有重要的作用。
本试验对多种封闭剂和样品稀释液进行了组合优化试验，筛选出最佳封闭液和样品稀释液组合，提高ELISA检测方法的敏感性与特异性，在今后猪疫病防控和疫苗监测中发挥重大作用。
1 材料与方法1.1 血清样品准备从不同养猪场采集猪血，离心分离血清，用IDEXX试剂盒检测所分离的不同份血清，记录并标记检测结果（阴性或阳性），4℃保存。
1.2 封闭液1%酪蛋白（Casein）、2% Casein、3% Casein，1%明胶（Gelatin），1% BSA、2% BSA、3% BS A，10%山羊血清（GS），10%马血清（HS），10%兔血清（RS）、8% RS、7% RS和6% RS。
1.3 样品稀释液PBST，1% Casein，1% Gelatin，1% BSA，5% GS，5% HS，8% RS，7% RS，6% RS，4% R S，2% RS和1% RS。
1.4 方法1.4.1 最佳封闭液和样品稀释液的筛选本试验直接用封闭液封闭无抗原包被酶标板，每孔加入200μL封闭液，37℃孵育2h，用洗涤液洗涤3次，拍干；将阳性临床样品用样品稀释液按1:40稀释后分别加入酶标板孔中，每孔100μL，3 7℃温育30min，同上方法洗涤5次，拍干；将稀释好的羊抗猪IgG加入酶标板孔中，每孔100μL，3 7℃孵育30min，洗涤5次，拍干；然后每孔加入100μL底物显色液，避光显色15min，最后每孔加入50μL终止液终止反应，酶标仪上读取OD450-OD630值。
用不同的封闭液和样品稀释液组合进行如上测定，选择OD450-OD630值最小的封闭液和样品稀释液为最佳组合。
[基金项目] 江苏省农业科技自主创新资金项目（No. CX(13)3076），江苏省博士后基金项目（No. 6511201，1202055C）。
[作者简介] 杜改梅（1976-），女，博士，副教授。
主要从事猪病防控研究。
Email：gaimeidu@。
[通讯作者] 邵国青（1964-），男，江苏省人，研究员。
博士。
主要从事猪病防控。
Email：84391973@。
127812791.4.2 最佳封闭液和样品稀释液组合的验证为进一步验证1.4.1中确定的最佳封闭液和样品稀释液组合对抗原包被ELISA 检测结果的影响，我们又进行了如下试验。
以8μg/mL 猪肺炎支原体全菌蛋白包被酶标板，每孔100μL ，37℃孵育1h ，洗涤液洗涤3次后，拍干，用封闭液封闭每个酶标板孔，每孔200μL ，37℃孵育2h ，同上洗涤，拍干；将已知背景的阴阳性血清用样品稀释液按1:40稀释后分别加入酶标板孔中，每孔100μL ，37℃温育30min ，同上方法洗涤5次，拍干；将稀释好羊抗猪IgG 加入酶标板孔中，每孔100μL ，37℃孵育30m in ，洗涤5次，拍干；然后每孔加入100μL 底物显色液，避光显色15min ，最后每孔加入50μL 终止液终止反应，酶标仪上读取OD 450-OD 630值并判定结果。
2 结果2.1 不同浓度BSA 作封闭液和样品稀释液对ELISA 检测结果的影响按1.4.1步骤分别选用1% BSA 、2% BSA 和3% BSA 同时作为封闭液和样品稀释液进行ELISA 试验。
结果显示，2% BSA 为封闭液和样品稀释液时，血清OD450-630值均介于0.1与0.2之间，而1% BSA 和3% BSA 的血清OD450-OD630值均大于0.2（图1）。
2.2 不同浓度Casein 作封闭液和样品稀释液对ELISA 检测结果的影响同上方法用不同浓度的Casein 直接封闭酶标板，选用相应浓度的封闭液为样品稀释液，进行EL ISA 试验。
结果表明，1% Casein 和2% Casein 作封闭液和样品稀释液效果相近，且血清OD450-OD 630值均小于0.15（图2）。
图1 不同浓度BSA 作封闭液和样品稀释液对ELISA 检测结果的影响图2 不同浓度Casein 作封闭液和样品稀释液对ELISA 检测结果的影响2.3 不同浓度RS 作封闭液对ELISA 检测结果的影响1280按1.4.1步骤分别用6% RS 、7% RS 、8% RS 和10% RS 作封闭液，封闭液同时作样品稀释液，进行ELISA 检测试验。
结果显示，8% RS 和10% RS 作为封闭液和样品稀释液，血清OD 450-OD 630值均小于0.06（图3）。
图3 不同浓度RS 作封闭液对ELISA 检测结果的影响 2.4 不同浓度RS 作样品稀释液对ELISA 检测结果的影响按1.4.1步骤用8% RS 和10% RS 作为封闭液，分别选用8%、4%、2%和1% RS 为样品稀释液，进行ELISA 检测试验。
从图5可知，10% RS （图4左）或8%RS （图4右）作封闭液时，血清OD 450-OD 630值均随着样品稀释液浓度的降低而升高，其中8% RS 作样品稀释液效果最佳，血清OD 450-OD 630值均小于0.06。
图4 不同浓度RS 作样品稀释液对ELISA 检测结果的影响 2.5 不同封闭液和样品稀释液对ELISA 检测结果的影响在上述优化的基础上，将不同类的封闭液和样品稀释液按1.4.1步骤进行ELISA 临床样品检测试验。
由图5可知，用PBST 溶液为样品稀释液时，8% RS 、1% Casein 和2% BSA 三种封闭液的封闭效果相近，但OD 450-OD 630值均较高（图5左）；而选用相应浓度的封闭液作样品稀释液时，与PBST 样品稀释液检测结果相比，OD 450-OD 630值均降低，且8% RS 、1% Casein 、2% BSA 和10% GS 四种封闭液的封闭效果相近，血清OD 450-OD 630值均介于0.1与0.2之间（图5右），其中8%RS 作封闭液和样品稀释液效果最佳。
2.6 8% RS 封闭液和样品稀释液对ELISA 检测结果的影响按1.4.2步骤进行ELISA 试验检测。
从图6（略）可见，这两组封闭液和样品稀释液组合均可使阴性血清OD450-630值小于0.1，封闭效果很好。
IDEXX 检测结果与自制ELISA 检测结果比值介于1.0-1.1之间，检测结果的符合率较高。
1281图5 不同封闭液和样品稀释液对ELISA 检测结果的影响 3 讨论随着我国畜牧养殖业的不断发展，牲畜交易的广泛性，跨省市交易时有发生，而不同地区疾病免疫的不确定性导致了疫病的不时暴发。
目前，我国疫病的控制手段主要是疫苗免疫，但许多疾病疫苗免疫后病原仍然可以持续感染，难以控制[3,4]。
因此，我们要本着“疾病以防为主，既病防变”的原则。
疾病的早期发现，早期治疗可减缓疾病的发展，避免继发感染，降低经济损失。
疾病诊断方面，主要有病原的分离培养、血清学诊断和分子生物学诊断[5-7]。
病原的分离培养需要时间一般较长，并且容易受到相近病原的污染，分子生物学诊断虽然敏感度较高，但需要先进的仪器设备，均难以应用于临床生产中[8-10]。
血清学诊断中ELISA 方法是应用到科研生产中最为广泛，最为灵敏的技术手段，在动物疾病的诊断中起到了很大的作用[11-16]。
而目前，许多疾病缺少商品化的抗体检测试剂盒。
因此，建立一种快捷可行的抗体体外检测方法是十分必要的。
目前，国内的疫病诊断试剂盒多为国外进口的ELISA 试剂盒，其价格极其昂贵，难以满足国内市场的需求。
国内虽开展了大量ELISA 检测方法的研究[17,18]，但可靠稳定的商品化试剂盒甚少，究其原因主要是敏感性和特异性达不到理想的效果。
ELISA 检测方法的影响因素较多，高纯度抗原是间接ELISA 成功的先决条件，虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果，但应尽可能予以纯化，以提高试验的特异性。
此外，封闭液是一个重要的影响因素。
封闭是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程，即让不相关的蛋白质充填这些未包被间隙，从而减少ELISA 后续步骤中干扰物质的再吸附。
常用封闭液的种类较多，但不同封闭液和不同浓度封闭液的封闭效果均不同。
本试验分别用同类不同浓度封闭液和不同种类封闭液进行封闭，结果发现，2% BSA 较1% BSA 和3% BS A 封闭效果好，2% Casein 和1% Casein 较3% Casein 封闭效果好，这表明封闭效果不会随着封闭液浓度的升高而一定增强。
与BSA 和Casein 相比，RS 具有更好的封闭效果，且8% RS 和10% RS 封闭效果相近，均强于6% RS 和7% RS 。
为了进一步证明8%RS 避免封闭过量，影响检测特异性，本试验对8% RS 和10% RS 封闭液进行了筛选研究，结果表明这两个浓度封闭液均具有较好的封闭效果。
为了避免过高的阴性本底影响检测结果的判断，样本必须要先行稀释，不同样品稀释液对ELISA 检测结果有较大的影响。