血清清蛋白、γ-球蛋白分离、提纯及鉴定-2012医学-第六实验室
血清清蛋白、γ_球蛋白的分离、提纯和鉴定
血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、提纯与鉴定一、实验目的1.掌握盐析法、凝胶层析法、离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法;2.掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法;3.了解柱层析技术。
二、实验原理血清蛋白主要由清蛋白和球蛋白组成,各行使其重要的功能。
本实验利用盐析方法将血清中的清蛋白和球蛋白分离,并用电泳技术观察蛋白质分离教果。
1.盐析蛋白质分子能稳定存在于水溶液中是因为有两个稳定因素:表面的电荷和水化膜。
当维持蛋白质的稳定因素破坏时,蛋白质分子可相互聚集沉淀而析出,蛋白质分子沉淀析出的方法很多,根据对蛋白质稳定因素破坏的不同有中性盐析法、有机溶溶剂法、重金属盐法以及生物碱试剂法等。
盐析法的原理是:中性盐如硫酸铵((NH4)2SO4)等对蛋白质作用破坏了蛋白质表面水化膜,并且中和了部分电荷,从而使蛋白质相互聚集而析出。
由于血清中各种蛋白质分子的颗粒大小、所带电荷的多少和亲水程度不同,故盐析所需的盐浓度也不同,因此调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀从而达到分离的目的。
血清球蛋白在半饱和状态下发生沉淀,而血清清蛋白在完全饱和状态下沉淀,利用此特性可把蛋白质分段沉淀下来,即在半饱和的中,血清蛋白不沉淀,而血球蛋白沉淀,离心后清蛋白主要在上清液中,沉淀蛋白加少量蒸馏水即可溶解,由此达到分离清蛋白和白蛋白的目的。
2.脱盐盐析得到的蛋白质含有高浓度中性盐,需要有脱盐过程去除蛋白质遗留的中性盐,常用方法有:透析法脱盐和凝胶层析法脱盐。
本实验采用凝胶层析法脱盐,在葡聚糖凝胶柱中,蛋白质与盐的分子量不同,当样品通过层析柱时,分子量较大的蛋白质因为不能通过网孔而进入凝胶颗粒,沿着凝胶颗粒间的间隙流动,所以流程较短,向前移动速度较快,最先流出层析柱;反之,盐的分子量较小,可通过网孔而进入凝胶颗粒,所以流程长,向前移动速度较慢,流出层析柱的时间较后。
分段收集蛋白质洗脱液,即可得到脱盐的蛋白质。
3.纯化(离子交换层析)离子交换是溶液中的离子和交换剂上的离子进行可逆的的交换过程。
血清γ-球蛋白分离、纯度鉴定与浓度检测
生物化学实验报告班级:学号:姓名:实验室:评分━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━日期:实验一:血清γ-球蛋白分离、纯度鉴定与浓度检测实验目的:1、熟悉盐析法分离蛋白质的原理和基本方法2、掌握凝胶层析法脱盐分离蛋白质的原理和基本方法3、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法进行纯度鉴定的原理和基本方法4、掌握分光光度计检测蛋白质含量的原理和基本方法实验原理:1.盐析法:盐析法是在蛋白质溶液中,加入无机盐至一定浓度或达饱和状态,可使蛋白质在水中溶解度降低,从而分离出来。
蛋白质溶液中加入中性盐后,由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质,致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃至消失。
此外,中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变,蛋白质表面的电荷大量被中和,更加导致蛋白质溶解度降低,蛋白质分子之间聚集而沉淀。
2.凝胶层析法脱盐:在葡聚糖凝胶柱中,蛋白质与盐的分子量不同,当样品通过层析柱时,分子量较大的蛋白质因为不能通过网孔而进入凝胶颗粒,沿着凝胶颗粒间的间隙流动,所以流程较短,向前移动速度较快,最先流出层析柱;反之,盐的分子量较小,可通过网孔而进入凝胶颗粒,所以流程长,向前移动速度较慢,流出层析柱的时间较后。
分段收集蛋白质洗脱液,即可得到脱盐的蛋白质。
3.醋酸纤维素薄膜电泳:血清中各种蛋白质的等电点不同,一般都低于pH7.4。
它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷,在电场中向正极移动。
由于血浆中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同,因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。
因此可以将它们分离为清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。
4.分光光度计是应用分光光度法(即比色法)测定物质含量的装置。
通常需要加入某种显色剂,以产生有色化合物,其颜色深浅与待测化学成分的含量成正比,据此对待测物浓度进行测定。
分光光度计的工作原理及分光光度法的计算根据Lambert-Beer定律导衍而得Abs(吸光度)=KCL K:摩尔吸收系数 C:吸光物质浓度 L-溶液厚度实验操作:1.硫酸铵分段盐析:血清2.0 ml,加入PBS2.0ml,一边摇一边缓慢加入饱和硫酸铵2.0 ml,混匀后室温下静置10分钟,3000rpm离心10分钟。
07 生物化学实验--血清γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定
血清γ- 球蛋白的分离、纯化与鉴定【目的】1 .掌握盐析 - 层析法提纯血清γ- 球蛋白的原理和技术。
2 .熟悉电泳比较法定性γ- 球蛋白的方法。
3 .了解扫描定量γ- 球蛋白的方法。
【原理】蛋白质的分离、纯化是研究蛋白质化学性质及生物学功能的重要手段。
根据不同蛋白质的分子量、溶解度以及在一定条件下带电荷性状的差异来分离、纯化各种蛋白质。
1 .γ- 球蛋白的分离、纯化( 1 )盐析:清蛋白与球蛋白的稳定性不同,故可用盐析法对血清蛋白质初步分离。
在半饱和硫酸铵溶液中,清蛋白不沉淀,球蛋白沉淀,离心所得的沉淀即是球蛋白混合物。
( 2 )脱盐:球蛋白混合物中的硫酸铵会妨碍进一步分离纯化,应除去。
脱盐的方法有多种,本试验采用凝胶过滤。
在凝胶过滤中,柱中的填充料是高度水化的惰性多聚物,最常用的有葡聚糖凝胶( Sephadex Gel )和琼脂糖凝胶 (Agarose Gel) 等颗粒。
葡聚糖凝胶是具有不同交联度的网状结构物,它的“ 网眼” 大小可以通过交联剂与葡聚糖的配比来达到。
不同型号的葡聚糖凝胶可用来分离和纯化不同分子大小的物质。
把葡聚糖凝胶装在层析柱中,不同分子大小的蛋白质混合液借助重力通过层析柱时,比“ 网眼” 大的蛋白质分子不能进入网格中,而被排阻在凝胶颗粒之外,随着洗脱剂在凝胶颗粒的外围而流出。
比‘ 网眼 ' 小的分子则进入凝胶颗粒内部。
这样,由于不同大小的分子所经路程距离不同而得到分离。
大分子物质先被洗脱出来,小分子物质后被洗脱出来。
所以含硫酸铵的蛋白值溶液通过层析柱时,先被洗脱出层析柱的是球蛋白,小分子硫酸铵由此法分离除去(参见第 2 篇第 2 章图 2-3 )。
( 3 )纯化:γ- 球蛋白与α 、β- 球蛋白(以及微量的清蛋白),等电点不同,所以采用离子交换层析,从球蛋白混合物中分离、提纯出γ- 球蛋白。
用于蛋白质分离的层析材料多是离子交换纤维素,它们的优点是对蛋白质的交换容量较一般的离子交换树脂大,而且品种较多,可以适用于各种分离目的。
血清γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定综合性实验的创新与实践
血清γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定综合性实验的创新与实践摘要】为改革生物化学实验,提高实验教学水平,对“血清γ-球蛋白的分离与提纯”实验进行改进和重新整合,建立了综合性实验“血清γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定”,实现实验内容和生化技术的综合与创新。
经过4年的医学本科生教学实践,实验方法稳定,结果重复可靠,适合实验教学,有利于提高大学生的综合实验技能。
【关键词】γ-球蛋白综合性实验创新血清γ-球蛋白又称免疫球蛋白(Ig),具有重要的医药应用价值。
许多医学院校把提取血清γ-球蛋白作为生化实验教学内容。
本室于2007年初,对原有生化实验“血清γ-球蛋白的分离与提纯”进行了改进和大胆的创新,选用猪血清,保留原有的硫酸铵盐析、葡聚糖凝胶除盐的操作步骤,增加了分光光度法测定蛋白含量、醋酸纤维素膜及SDS-PAGE法鉴定提取的血清γ-球蛋白纯度,建立并开设了16学时的综合性实验“血清γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定”。
通过血清γ-球蛋白的分离、纯化、鉴定、蛋白测定及进一步鉴定的五个子实验,涵盖了生化的离心、层析、分光光度和电泳法四大传统技术。
突破了旧的单纯验证理论或简单孤立的学习一种实验方法或一个知识点的教学模式,使学生受到一次综合性生化技能训练,提高了实验教学效率和效果。
1 材料与方法1.1 仪器材料1.1.1 仪器 KDC-40低速离心机、1.5cm×20cm玻璃层析柱、722-可见分光光度计、DYY-2C电泳仪及DYCZ-24D型垂直板电泳槽。
1.1.2 试剂材料新鲜猪血清、pH7.0饱和硫酸铵溶液、0.01mol/L pH7.0 PBS(磷酸盐缓冲生理盐水)、葡聚糖凝胶G—25(SephadexG-25)、奈氏(Nessler)试剂、20%(W/V)磺基水杨酸溶液、pH8.6离子强度0.06巴比妥缓冲液、氨基黑10B、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、BSA(牛血清白蛋白)等,除SephadexG-25外均为国产。
血清白球蛋白的分离、纯化及鉴定
洗脱液中蛋白质及盐分的检查
取96孔板一块,上四排加20%磺基水杨酸,下 96孔板一块,上四排加20 磺基水杨酸, 20% 孔板一块 三排加BaCl 三排加BaCl2液。 从下端管口取1滴洗脱液,滴于20 从下端管口取1滴洗脱液,滴于20%磺基水杨 20% 酸中,出现白色混浊或沉淀即有蛋白质析出, 酸中,出现白色混浊或沉淀即有蛋白质析出, 开始收集蛋白样品。 开始收集蛋白样品。 从下端管口取1滴洗脱液,滴于BaCl 从下端管口取1滴洗脱液,滴于BaCl2中,出现 白色混浊或沉淀即有盐分析出,不再收集。 白色混浊或沉淀即有盐分析出,不再收集。
操
一、盐析
作
-- 白蛋白、γ球蛋白的粗分离 白蛋白、 <1> 取0.5ml血清 0.5ml血清 0.5ml饱和 饱和(NH 溶液, <2> 取0.5ml饱和(NH4)2SO4溶液, 缓慢滴入,边加边摇。 缓慢滴入,边加边摇。 混匀后于室温中放置10分钟。 10分钟 <3> 混匀后于室温中放置10分钟。 8000r/min× <4> 8000r/min×10min 小心吸取上清液,作为纯化白蛋白用。 <5> 小心吸取上清液,作为纯化白蛋白用。 沉淀加0.5ml蒸馏水,使之溶解, 0.5ml蒸馏水 <6> 沉淀加0.5ml蒸馏水,使之溶解,作为纯化 γ球 蛋白用。 蛋白用。
实验原理
1. 初分级: 血清经饱和硫酸铵盐析后获得白蛋白 初分级: 血清经饱和硫酸铵 饱和硫酸铵盐析后获得白蛋白
粗分离样品和球蛋白粗分离样品。
Байду номын сангаас
2. 脱盐:用凝胶色谱法除去分离样品中的盐类。 脱盐: 凝胶色谱法除去分离样品中的盐类 3. 细分级: 用离子交换色谱法从白蛋白粗分离样 细分级: 离子交换色谱法从白蛋白粗分离样
血清清蛋白及γ-球蛋白的分离
血清清蛋白及γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定目的要求1.1.熟悉蛋白质分离纯化的总体思路。
2.2.掌握盐析、离心、层析、浓缩、电泳等技术在蛋白质分离纯化中的综合作用。
3.3.学会设计和制定分离纯化蛋白质的方法。
实验原理血清中蛋白质按电泳法一般可分为五类:清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白,其中γ-球蛋白含量约占16%,100ml血清中约含1.2g左右。
首先利用清蛋白和球蛋白在高浓度硫酸铵溶液溶解度的差异而进行沉淀分离,此为盐析法。
半饱和硫酸铵溶液可使球蛋白沉淀析出,清蛋白则仍溶解在溶液中,经离心分离,沉淀部分即为含有γ-球蛋白的粗制品。
用盐析法分离而得的蛋白质中含有大量的中性盐,会妨碍蛋白质进一步纯化,因此首先必须去除。
常用的方法有透析法、凝胶层析法等。
本实验采用凝胶层析法,其目的是利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。
当溶液通过SephadexG--25凝胶柱时,溶液中分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒的网孔,而分子直径小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔之中.因此在洗脱过程中,小分子的盐会被阻滞而后洗脱出来,从而可达到去盐的目的。
脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白,利用它们等电点的不同可进行分离。
清蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白的PI<6.0;γ-球蛋白的PI为7.2左右。
因此在PH6.3的缓冲溶液中,各类球蛋白所带电荷不同。
经DEAE(二乙基氨基乙基)纤维素阴离子交换层析柱进行层析时,带负电荷的α-球蛋白和β-球蛋白能与DEAE纤维素进行阴离子交换而被结合;带正电荷的γ-球蛋白则不能与DEAE纤维素进行交换结合而直接从层析柱流出。
因此随洗脱液流出的只有γ-球蛋白,从而使γ-球蛋白粗制品被纯化。
其反应式如下:用上述方法分离得到γ-球蛋白是否纯净,单一。
可将纯化前后的γ-球蛋白进行电泳比较而鉴定之。
提高醋酸铵溶液的浓度到0.06 mol/L,DEAE纤维素层析柱上的ß-球蛋白及部分a-球蛋白可被洗脱下来。
血清γ-球蛋白的分离纯化与鉴定
实训二血清γ-球蛋白的分离纯化与鉴定目的要求1.了解蛋白质分离提纯的总体思路。
2.掌握盐析法、分子筛层析法、离子交换层析等实验原理及操作技术。
实验原理血清中蛋白质按电泳法一般可分为五类:清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白,其中γ-球蛋白含量约占16%,100ml血清中约含1.2g左右。
首先利用清蛋白和球蛋白在高浓度中性盐溶液中(常用硫酸铵)溶解度的差异而进行沉淀分离,此为盐析法。
半饱和硫酸铵溶液可使球蛋白沉淀析出,清蛋白则仍溶解在溶液中,经离心分离,沉淀部分即为含有γ-球蛋白的粗制品。
用盐析法分离而得的蛋白质中含有大量的中性盐,会妨碍蛋白质进一步纯化,因此首先必须去除。
常用的方法有透析法、凝胶层析法等。
本实验采用凝胶层析法,其目的是利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。
当溶液通过SephadexG--25凝胶柱时,溶液中分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒的网孔,而分子直径小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔之中.因此在洗脱过程中,小分子的盐会被阻滞而后洗脱出来,从而可达到去盐的目的。
脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白,利用它们等电点的不同可进行分离。
α-球蛋白、β-球蛋白的PI<6.0;γ-球蛋白的PI为7.2左右。
因此在PH6.3的缓冲溶液中,各类球蛋白所带电荷不同。
经DEAE(二乙基氨基乙基)纤维素阴离子交换层析柱进行层析时,带负电荷的α-球蛋白和β-球蛋白能与DEAE纤维素进行阴离子交换而被结合;带正电荷的γ-球蛋白则不能与DEAE纤维素进行交换结合而直接从层析柱流出。
因此随洗脱液流出的只有γ-球蛋白,从而使γ-球蛋白粗制品被纯化。
其反应式如下:用上述方法分离得到γ-球蛋白是否纯净,单一?可将纯化前后的γ-球蛋白进行电泳比较而鉴定之。
试剂和器材1.试剂(1)饱和硫酸铵溶液:称固体硫酸铵(分析纯)850g,置于1000ml蒸馏水中,在70一80℃水温中搅拌溶解。
将酸度调节至pH7.2,室温中放置过夜,瓶底析出白色结晶,上清液即为饱和硫酸铵溶液。
血清γ-球蛋白的分离纯化实验报告
血清γ-球蛋白的分离纯化实验报告血清γ-球蛋白的分离纯化一、目的与要求1、掌握分离纯化蛋白质的基本原理和基本过程。
2、熟悉盐析、离心、层析、电泳等生化基本技术在蛋白质分离纯化中的综合应用。
3、学会设计和制定分离纯化蛋白质的实验方案,技术路线,质量监控和保证措施。
二、实验原理血清蛋白有300多种,可粗略的分为清、球蛋白两大类,γ球蛋白只是球蛋白中的一个亚类。
欲用常规方法获得,可先用半饱和硫酸铵从血清中盐析出球蛋白,接着用葡萄糖凝胶G-25脱去球蛋白中的盐分最后用DEAE纤维素阴离子交换柱便可直接从脱盐的球蛋白溶液中分离纯化出γ球蛋白,其反应机理如下:C2H5H纤维素-O-(CH2)2-N(C2H5)2纤维素-O-(CH2)2-N+……H2PO4H++H2PO4DEAE纤维素离子交换柱COOHC2H5α、β、γ球蛋白NH2COOH经过盐析和脱盐的球蛋白液纤维素-O-(CH2)2-N+…α和βGPH6.3NH2交换到柱上的α和β-球蛋白H2PO4COOHγ-球蛋白NH3+被DEAE柱分离纯化的γ-球蛋白被柱层析交换结合的α球蛋白和β球蛋白,可通过增加洗脱液的离子强度或降低洗脱的pH值(也可两者同时改变),使其分部洗脱下来而被纯化。
纯化前后的γ球蛋白可用电泳方法进行比较鉴定。
三、仪器和材料仪器:离心机,1.5×40cm层析柱,层析架或滴定台,核酸-蛋白检测仪,部分收集器,紫外分光光度计,色谱柱,电泳槽,电泳仪。
材料:马血清,SephadexG-25×200g,DEAE-32×200g。
四、实验步骤(一)分离纯化步骤1、取3mL,4℃预冷血清,加入3mL4℃预冷的饱和硫酸铵。
边滴边摇。
2、静置大于10min后,3500rpm离心15min,弃去上清液,将沉淀溶于少量的生理盐水。
从中取0.5mL用于测定蛋白质含量。
3、将剩余的样品上SephadexG-25柱,用0.02mol/LpH6.5的NH4AC缓冲液洗脱,每管收集3mL,用于绘制洗脱曲线,选择颜色最深(即浓度最高管)的取0.5mL留待电泳用。
东师实验1血清清蛋白与γ-球蛋白的分离与鉴定分解
综合研究性实验一:血清清蛋白与γ-球蛋白的分离与鉴定一.实验目的1.掌握盐析法分离提纯蛋白质的原理和方法;2.掌握透析法脱盐与蛋白质浓缩的方法;3.掌握凝胶过滤层析的技术方法;4.掌握利用醋酸纤维素薄膜电泳法分离与鉴定血清清蛋白的原理和方法。
二.血清清蛋白与γ-球蛋白的盐析、透析与浓缩[一]实验试剂和仪器1.试剂(1)血清(2)PBS(3)(NH4)2SO4溶液(4)双缩脲试剂(5)酪蛋白(6)蔗糖(7)蒸馏水(8)BaCl溶液2.用品与仪器(1)离心机(2)烧杯(3)移液管(4)透析袋[二]血清清蛋白与γ-球蛋白的盐析(一)蛋白质盐析的实验原理1.蛋白质分子是生物大分子,其大小恰好在胶体的范围,且分子中亲水基团多位于分子的表面,疏水基团多在分子结构内部。
因此,蛋白质分子在水中能以胶体颗粒存在,形成胶体溶液。
2.蛋白质在水中形成亲水胶体,亲水胶体颗粒有两个稳定因素:(1)胶粒上的电荷;(2)水化膜。
3.蛋白质在水溶液中呈现两性电离。
在环境的pH≠pI时,蛋白质可带正电荷或负电荷。
在某一pH条件,蛋白质带同种电荷,同电相斥,故可吸引水分子(水分子为极性分子),水分子排列围绕在蛋白质分子周围,形成水化膜,使蛋白质分子相互分割开来。
破坏这两个因素或其中某一个因素(破坏了蛋白质胶体的稳定性),易于蛋白质发生沉淀。
4.高浓度盐溶液,在水溶液中电离,其正、负离子吸引水分子,从而夺取水化膜,还可以中和部分电荷。
这样,就不同程度地去掉了上述的两个稳定因素,使蛋白质凝聚、沉淀,这就是蛋白质的盐析。
5.由于各种蛋白质的颗粒大小、带电荷多少及亲水程度的不同,对于同一种中性盐,蛋白质盐析所需最低浓度也不同。
例如:球蛋白不溶于半饱和的(NH4)2SO4溶液,γ-球蛋白不溶于1/3饱和度的(NH4)2SO4溶液,而清蛋白仅不溶于饱和的(NH4)2SO4溶液。
因而。
可以利用不同浓度的(NH4)2SO4溶液使血清或其他混合蛋白质中的这些不同的蛋白质分开。
血清蛋白、-球蛋白的分离纯化与鉴定
血清清蛋白、γ-球蛋白的分离纯化与鉴定之答禄夫天创作(一)血清清蛋白、γ-球蛋白的分离与纯化【目的要求】1.了解蛋白质分离提纯的总体思路。
2.掌握盐析法、分子筛层析、离子交换层析等实验原理及操纵技术。
【实验原理】血清中含有清蛋白和各种球蛋白(α-β-γ-球蛋白等),由于它们所带电荷分歧、相对分子质量分歧,在高浓度盐溶液中的溶解度分歧,因此可利用它们在中性盐溶液中溶解度的差别而进行沉淀分离,此法称为盐析法。
本实验应用分歧浓度硫酸铵分段盐析法可将血清中清蛋白、球蛋白初步分离。
在半饱和硫酸铵溶液中,血清清蛋白不沉淀,球蛋白沉淀,离心后清蛋白主要在上清液中,沉淀的球蛋白加少量水可使其重新溶解。
用盐析法分离而得的蛋白质含有大量的硫酸铵,会妨碍蛋白质的进一步纯化,因此必须去除,经常使用的有透析法、凝胶过滤法等。
本实验采取凝胶过滤法,该法是利用蛋白质与无机盐类之间相对分子质量的差别除去粗制品中盐类。
脱盐后的蛋白质溶液再经DEAE纤维素层析柱进一步纯化。
DEAE纤维素为阴离子交换剂,在pH 6.5的条件下带有正电荷,能吸附带负电荷的α-球蛋白和β-球蛋白(pl分别为4.9、5.06和5.12),而γ-球蛋白(pl7.3)在此条件下带正电荷,不被吸附故直接从层析柱流出,此时收集的流出液即为纯化的γ-球蛋白。
提高醋酸铵溶液的浓度到0.06 mol/L,DEAE纤维素层析柱上的ß-球蛋白及部分a-球蛋白可被洗脱下来。
将醋酸铵溶液的浓度提高至,则清蛋白被洗脱下来,此时收集的流出液即为较纯的清蛋白。
经DEAE纤维素阴离于交换柱纯化的清蛋白、γ-球蛋白液往往体积较大,样品质量分数较低。
为便于鉴定,常需浓缩。
浓缩的方法很多,本实验选用聚乙二醇透析浓缩的方法。
血清清蛋白、γ-球蛋白分离纯化后,选用醋酸纤维薄膜电泳法鉴定其纯度。
【试剂与器材】1.试剂.(1)饱和硫酸铵溶液:称取固体硫酸铵850g加入1000mL蒸馏水中,在70~80℃下搅拌促熔,室温中放置过夜,瓶底析出白色结晶,上清液即为饱和硫酸铵液。
血清蛋白的分离提纯与鉴定
血清蛋白的分离提纯与鉴定血清蛋白的分离、提纯与鉴定血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、提纯于鉴定一、实验目的:1、掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法2、掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法3、掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法4、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法5、了解柱层析技术二、实验原理:蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。
对于不同的蛋白质,其分子量、溶解度及等电点等都有所不同。
利用相同蛋白质在这些性质上的差别,利用适当的物理方法可以拆分提纯相同蛋白质。
a.盐析法:在蛋白质溶液中加入大量中性无机盐后,由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质,致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃至消失。
同时,加盐后由于离子强度发生改变,蛋白质表面的电荷大量被中和,从而破坏了蛋白质的胶体性质,导致蛋白质溶解度降低,蛋白质分子之间易于聚集沉淀,进而使蛋白质从水溶液中沉淀析出。
b.凝胶层析:利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。
当溶液通过sephadeg-25凝胶柱时,溶液中分子直径小的蛋白质无法步入凝胶颗粒网孔,而分子量大的无机盐能够步入凝胶颗粒的网孔中,因此在洗清过程中,小分子的盐会被迟滞而后洗清出,从而达至回去盐的目的。
c.离子交换层析:离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆的交换,利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。
d.纯度鉴别(醋酸纤维素薄膜电泳):血清中各种蛋白质的等电点相同,通常都高于ph7.4。
它们在ph8.6的缓冲液中均解离带负电荷,在电场中向正极移动。
由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同,因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。
因此电泳时可将它们分离为清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。
三、材料与方法a材料样品:人混合血清试剂:葡聚糖凝胶(g-25)层析柱、deae纤维离子交换层析柱、饱和硫酸铵溶液、醋酸铵缓冲溶液、20%磺基水杨酸、1ocl2溶液、氨基黑染色液、漂洗液、ph8.6巴比妥缓冲溶液、电泳仪、电泳槽b实验步骤盐析(细拆分)→葡聚糖凝胶层析(脱盐)→deae纤维素色谱法层析(提纯)→醋酸纤维素薄膜电泳(纯度鉴别)具体操作流程示意:(一)盐析+凝胶柱层析除盐:取血清0.8ml,边摇边缓慢滴加饱和硫酸铵溶液0.8ml,混匀室温放置10min,4000r/min离心10min沉淀(含球蛋白)加水0.6ml溶解上清液(含清蛋白、少量α球蛋白和β球蛋白)过葡聚糖凝胶g-25层析柱(1.0×7cm)过葡聚糖凝胶g-25层析柱(1.0×7cm)用1ml0.02mol/lnh4ac缓冲液清洗层析柱内壁,继续用0.02mol/lph6.5nh4ac 缓冲液(2ml)洗脱,流出液量约1ml时开始检测蛋白质用1ml0.02mol/lnh4ac缓冲液清洗层析柱内壁,继续用0.02mol/lph6.5nh4ac缓冲液洗脱,流出液量约1ml时开始检测蛋白质磺基水杨酸检测蛋白质磺基水杨酸检测蛋白质继续用2ml0.02mol/lnh4ac缓冲液洗涤继续用2ml0.02mol/lnh4ac缓冲液洗涤收集含有蛋白质的峰液12滴收集含有蛋白质的峰液12滴bacl2检测so42-阴性bacl2检测so42-阴性用2-3ml0.02mol/lnh4ac缓冲液再生平衡(二)色谱法层析(提纯):用2-3ml0.02mol/lnh4ac缓冲液再生平衡除盐后搜集的球蛋白过deae-纤维素层析柱(1.0×6cm)用1ml0.02mol/lnh4ac缓冲液冲洗层析柱内壁,稳步用0.02mol/lph6.5nh4ac缓冲液(3ml)洗清,流入液量约1ml已经开始检测蛋白质挑浓度最低的1管作纯度鉴别(醋酸纤维素薄膜电泳法)磺基水杨酸检测蛋白质搜集所含蛋白质的洗脱液每管及10几滴,已连续搜集3管除盐后搜集的明蛋白deae-纤维素柱不必再造,可以轻易用作提纯清蛋白过deae-纤维素层析柱(1.0×6cm)用1ml0.06mol/lnh4ac缓冲液冲洗层析柱内壁,用约5ml0.06mol/lnh4ac缓冲液流洗,除去α球蛋白和β球蛋白磺基水杨酸检测蛋白质2管均作纯度鉴别(醋酸纤维素薄膜电泳法)(三)醋酸纤维素薄膜电泳:deae-纤维素柱先用6mll.5mol/lnacl-0.3mol/lnh4ac溶液流洗,再用10ml0.02mol/lnh4ac缓冲液流洗再造均衡搜集所含清蛋白的洗脱液每管及10几滴,已连续搜集2管1、点样(如下图):-点样线+点样区(粗面)1.5cm2cm点样线尽量点得细窄而均匀,宁少勿多2、电泳:①薄膜细面向下②点样端置阴极端③两端紧贴在滤纸盐桥上,膜应轻轻拉平电压:110v时间:50min3、染色和冲洗:电泳完毕后,关闭电源,将膜取出,直接浸于染色液中5min。
血清白蛋白、γ-球蛋白的分离纯化与鉴定
血清白蛋白、γ-球蛋白的分离纯化与鉴定1.盐析1)取血清2.0ml加到一支15ml离心管中,加0.01M PBS液(PH7.2)2.0ml摇匀。
再逐滴加入PH7.2饱和硫酸铵溶液2.0ml,边加边摇匀。
静置15分钟,3000rpm离心10分钟,用滴管小心吸出上层清液置一干净一次性试管中(尽量全部吸出,但不得有沉淀物)做白蛋白脱盐之用。
2)将沉淀用1.0ml PBS液搅拌溶解,再逐滴加入饱和硫酸铵0.5ml,混匀。
静置15分钟,3000rpm 离心10分钟,倾去上清液。
沉淀用PBS液10滴搅拌溶解,作为γ-球蛋白脱盐之用。
2.白蛋白脱盐与纯化脱盐1)装柱取层析柱1支,用0.02mol/LNH4Ac湿润层析柱,剩余约1/4柱高的液柱时关闭出口。
沿柱内壁缓慢灌入,用PH6.50.02mol/LNH4Ac缓冲液事先浸泡好的稀糊状葡聚糖凝胶G-25悬液约10ml,床面要平整,严防气泡,。
待分层后打开出口,待液面恰与床面重合时,关闭出口。
2)加样与洗脱用细长滴管吸取白蛋白溶液,在靠近床面处沿柱内壁缓慢加入,打开出口,调节流速为6滴/分钟。
待白蛋白完全进入床面后,再用0.02mol/LNH4Ac 5~10ml进行洗脱。
3)收集取小试管12支,依次编号,收集洗脱液,每管收集0.5ml(约12滴),共收集12管后,关闭出口。
4)检测准备一块干净的反应板,向每个孔中按编号顺序依次滴入收集到的洗脱液各1滴,再于各孔内依次滴入20%磺基水杨酸1滴,检测是否出现沉淀(有白色沉淀就说明白蛋白已经洗脱下来)。
将出现沉淀的几管洗脱液留下,进一步做BaCl2浓度检测。
于干净的反应板各孔内依次加入前一步已证明含有白蛋白的洗脱液各1滴,再对应依次加入BaCl2 1滴,检测是否出现沉淀(无白色沉淀就说明无SO42-)。
纯化5)装柱取层析柱1支,用0.06mol/LNH4Ac湿润层析柱,剩余约1/4柱高的液柱时关闭出口。
沿柱内壁缓慢灌入,事先已用0.06mol/LNH4Ac浸泡好的稀糊状DEAE悬液,床面要平整,严防气泡。
血清清蛋白及γ-球蛋白的分离
血清清蛋白及γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定目的要求1.1.熟悉蛋白质分离纯化的总体思路。
2.2.掌握盐析、离心、层析、浓缩、电泳等技术在蛋白质分离纯化中的综合作用。
3.3.学会设计和制定分离纯化蛋白质的方法。
实验原理血清中蛋白质按电泳法一般可分为五类:清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白,其中γ-球蛋白含量约占16%,100ml血清中约含1.2g左右。
首先利用清蛋白和球蛋白在高浓度硫酸铵溶液溶解度的差异而进行沉淀分离,此为盐析法。
半饱和硫酸铵溶液可使球蛋白沉淀析出,清蛋白则仍溶解在溶液中,经离心分离,沉淀部分即为含有γ-球蛋白的粗制品。
用盐析法分离而得的蛋白质中含有大量的中性盐,会妨碍蛋白质进一步纯化,因此首先必须去除。
常用的方法有透析法、凝胶层析法等。
本实验采用凝胶层析法,其目的是利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。
当溶液通过SephadexG--25凝胶柱时,溶液中分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒的网孔,而分子直径小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔之中.因此在洗脱过程中,小分子的盐会被阻滞而后洗脱出来,从而可达到去盐的目的。
脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白,利用它们等电点的不同可进行分离。
清蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白的PI<6.0;γ-球蛋白的PI为7.2左右。
因此在PH6.3的缓冲溶液中,各类球蛋白所带电荷不同。
经DEAE(二乙基氨基乙基)纤维素阴离子交换层析柱进行层析时,带负电荷的α-球蛋白和β-球蛋白能与DEAE纤维素进行阴离子交换而被结合;带正电荷的γ-球蛋白则不能与DEAE纤维素进行交换结合而直接从层析柱流出。
因此随洗脱液流出的只有γ-球蛋白,从而使γ-球蛋白粗制品被纯化。
其反应式如下:用上述方法分离得到γ-球蛋白是否纯净,单一。
可将纯化前后的γ-球蛋白进行电泳比较而鉴定之。
提高醋酸铵溶液的浓度到0.06 mol/L,DEAE纤维素层析柱上的ß-球蛋白及部分a-球蛋白可被洗脱下来。
本科基础实验血清中r球蛋白的分离与鉴定
50%上清 (含血清清蛋 白)
50%沉淀 (含、-球 蛋白)
(六)盐析分离效果(结果):下次实验利用电泳法检测。
二、利用透析方法除去蛋白质溶液中的盐
(一)透析实验原理 透析是一种分离纯化方法, 利用小分子能自由通过半透膜,而大分子不能通过半透膜 的性质将混合物中的大分子和小分子分开
二、利用透析方法除去蛋白质溶液中的盐
一、利用盐析方法分离血清清蛋白和γ-球蛋白
(二)用于盐析实验的盐: (HN4)2SO4最常用,此外NaCl、磷酸盐等也曾用于
盐析。 (三)盐析实验中盐浓度的表示方法: (HN4)2SO4饱和度
例如,饱和(HN4)2SO4、50%饱和(HN4)2SO4、 33%饱和(HN4)2SO4
注意,不是100ml中含50g或33g (HN4)2SO4,查 附表可知具体含量。
(二)透析实验所用器材
半透膜:一般制成袋状,称为透析袋;也有非袋状,例如 透析盒等。
《截留分子量(MWCO)》:大于截留分子量的分 子不能通过半透膜,因而留在透析袋内;小于截留分子量的 分子能自由通过半透膜,因而能被除去。
每种透析袋都注明截留分子量,例如3500、7000、 10000,300000等。
醋酸纤维素膜电泳方法鉴定血清清蛋白和γ-球蛋白
(一)、醋酸纤维素膜电泳实验原理
醋酸纤维素薄膜电泳法是以醋酸纤维素薄膜作为支持 物的电泳方法。
带电粒子在电场中泳动(电泳),其方向和速率取决 于粒子所带电荷的多少和粒子的大小。
各种蛋白质的等电点不同,因而在溶液中所带静电荷不 同,导致在电场中移动的速度不同故可利用电泳法将它 们分开。此外,蛋白质的分子量和构象等也会影响移动 速度。
浸泡:将膜浸润。 点样:将样品加到膜的一端。 通电:电泳。 染色:将膜放入染色液中(膜本身和蛋白都被染色)。 漂洗:洗掉膜的颜色,保留蛋白的颜色。
血清γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定-lhy-图文
1)
饱和(NH4)2SO4 1ml
弃上清
取1ml血清
静置5min
作1ml标记线
3500r/min 5min
边加边摇!
加PBS溶解沉淀至1ml
2)
饱和(NH4)2SO4 0.5ml
静置5min
弃上清
3500r/min 5min 边加边摇!
加PBS 0.5ml溶解沉淀
2.脱盐
1) 装柱
排气、调整凝胶浓度、装柱
无光泽面点样、量少、一次、迅速
3)上槽 点样面朝下、点样线勿接触滤纸桥,置负极
4)电泳 120V;40min
5)染色 丽春红染色液中浸泡 2min
6)漂洗 依次进行三次漂洗, 至背景无色
蛋白双缩脲法定量 (见P159)
肽键 +Cu2+
OH-
紫红色复合物
蛋白质浓度与A540呈正比
试剂
空白管 标准管 测定管1 测定管2
4.64
5.06
5.06
5.12
6.85~7.5
分子量( 6~9
5~20
30
×104)
含量(% 60~70 2~3.5
4~7
)
电泳缓冲液: pH=8.6 血清蛋白泳动方向? 各种血清蛋白泳动顺序?~18
电泳操作
1)电泳前准备 2)点样( 各组点γ-球蛋白液、每个电泳槽点2份血清)
二、结果 1.脱盐检测结果
1)纳氏试剂、双缩脲试剂颜色反应结果(半定量) 2)收集哪些洗脱液用于鉴定
2.电泳鉴定结果
绘出血清和γ-球蛋白液电泳结果
3.双缩脲法定量鉴定结果
计算γ-球蛋白液浓度
三、讨论 根据结果评价分离效果, 分析原因
血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳
本科基础实验血清中r球蛋白的分离与鉴定
BaCl溶液 1-2滴 除盐结果
实验现象
二、利用透析方法除去蛋白质溶液中的盐
(五)透析结束后,分别将透析袋内的血清清蛋白和γ-球 蛋白转入小离心管中,做好标记,按实验老师要求保存在 4oC冰箱中,下周利用电泳方法检测血清清蛋白和γ-球蛋 白的纯度,以此评价盐析的效果。
第2周::水或缓冲液,视情况而定。
二、利用透析方法除去蛋白质溶液中的盐
(二)透析实验方法
1. 根据所要分离的混合物分子大小 选择截留分子量适合的透析袋。
2. 清洗透析袋(新袋要事先在沸水 中煮5分钟),检查是否漏液。
3. 将待透析样品加入透析袋,扎紧 袋口。
4. 将透析袋放入装有透析液的容器 中。
浸泡:将膜浸润。 点样:将样品加到膜的一端。 通电:电泳。 染色:将膜放入染色液中(膜本身和蛋白都被染色)。 漂洗:洗掉膜的颜色,保留蛋白的颜色。
醋酸纤维素膜电泳方法鉴定血清清蛋白和γ-球蛋白
(三)、本实验内容:利用醋酸纤维素膜电泳方法鉴定盐 析得到的血清清蛋白和γ-球蛋白,并与未经过分离的血清 原样对比,评价盐析分离效果。
一、利用盐析方法分离血清清蛋白和γ-球蛋白
(四)盐析实验方法
(1)利用饱和(HN4)2SO4溶液 首先配制饱和(HN4)2SO4溶液, 将蛋白质溶液置于冰浴上,使之冷却。 在快速搅拌的情况下,逐滴滴加饱和(HN4)2SO4溶液至 所需浓度。 离心,分别收集上清和沉淀。
一、利用盐析方法分离血清清蛋白和γ-球蛋白
可选择常用的、相对价廉的、MWCO为1万的透析袋、
二、利用透析方法除去蛋白质溶液中的盐
(四)透析实验结果:
溶液名称 1 ml 蒸馏水
所加试剂名称 双缩脲试剂 4 mL
1 ml 酪蛋白
血清免疫球蛋白的提取分离、纯化及鉴定
I 血液及组织样品的制备分析组织中某种物质的含量、探索物质代谢的过程和规律,经常使用动物的肝、肾、脑、粘膜和肌肉等组织,也选用全血、血浆、血清或者无蛋白血滤液等血液样品,有时也采用尿液、胃液等完成各种生化实验。
掌握以上各种实验样品的正确处理和制备方法是保证生化实验顺利进行的关键。
一、血液样品(一)采血测定用的血液,多由静脉采集。
一般在饲喂前空腹采取,因此时血液中化学成分含量比较稳定,采血时所用的针头、注射器,盛血容器要清洁干净;接血时应让血液沿着容器壁慢慢注入,以防溶血和产生泡沫。
(二)血清、全血及血浆的制备1.血清的制备血清是全血不加抗凝剂自然凝固后析出的淡黄清亮液体。
制备方法是:将刚采集的血液直接注入试管或离心管中。
将试管放成斜面,让其自然凝固,一般经3h 血块自然收缩而析出血清;也可将血样放入37 ℃恒温箱内,促使血块收缩,能较快约析出血清。
为了缩短时间,也可用离心机分离(未凝或凝固的均可离心),分离出的血青,用吸管吸出置于另一试管中,若不清亮或带有血细胞,应重离心,加盖冷藏备用。
2.全血及血浆的制备取清洁干燥的试管或其它容器,收集动物的新鲜血液,立即与适量的抗凝剂充分混合,所得到的抗凝血为全血。
每毫升血液中加入抗凝剂的种类可以根据实验的需要进行选择,但是用量不宜过大,否则将影响实验的结果。
将已抗凝的全二于2,000r / min 离心10min ,沉降血细胞,取上层清液即为血浆。
血浆比血清分离得快而且量多:两者的差别,主要是血浆比血清多含一种纤维蛋白原,其它成分基本相同。
3.抗凝剂凡能够抑制血液凝固反应进行的化合物称为抗凝剂。
抗凝剂种类甚多,实验室常用的有如下几种,可根据情况选择使用。
(1)草酸钾(钠)优点是溶解度大,可迅速与血中钙离子结合,形成不溶性草酸钙,使血液不凝固。
每毫升血液用1-2mg 即可。
配制方法:配制10%草酸钾水溶液二吸取此液0.1ml 放入一试管中,慢慢转动试管,泛草酸钾尽量铺散在试管壁上,置80 ℃烘箱烤干(若超过150 ℃则分解),管壁即呈一薄层三色粉末,加塞备用。
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生物化学实验报告姓名:学号:专业年级:组别:第六实验室生物化学与分子生物学实验教学中心一、实验室规则1.实验前应认真预习实验指导,明确实验目的和要求,写出预实验报告。
2.进入实验室必须穿白大衣。
严格遵守实验课纪律,不得无故迟到或早退。
不得高声说话。
严禁拿实验器具开玩笑。
实验室内禁止吸烟、用餐。
3.严格按操作规程进行实验。
实验过程中自己不能解决或决定的问题,切勿盲目处理,应及时请教指导老师。
4.严格按操作规程使用仪器,凡不熟悉操作方法的仪器不得随意动用,对贵重的精密仪器必须先熟知使用方法,才能开始使用;仪器发生故障,应立即关闭电源并报告老师,不得擅自拆修。
5.取用试剂时必须“随开随盖”,“盖随瓶走”,即用毕立即盖好放回原处,切忌“张冠李戴”,避免污染。
6.爱护公物,节约水、电、试剂,遵守损坏仪器报告、登记、赔偿制度。
7.注意水、电、试剂的使用安全。
使用易燃易爆物品时应远离火源。
用试管加热时,管口不准对人。
严防强酸强碱及有毒物质吸入口内或溅到别人身上。
任何时候不得将强酸、强碱、高温、有毒物质抛洒在实验台上。
8.废纸及其它固体废物严禁倒入水槽,应倒到垃圾桶内。
废弃液体如为强酸强碱,必须事先用水稀释,方可倒入水槽内,并放水冲走。
9.以实事求是的科学态度如实记录实验结果,仔细分析,做出客观结论。
实验失败,须认真查找原因,而不能任意涂改实验结果。
实验完毕,认真书写实验报告,按时上交。
10.实验完毕,个人应将试剂、仪器器材摆放整齐,用过的玻璃器皿应刷洗干净归置好,方可离开实验室。
值日生则要认真负责整个实验室的清洁和整理,保持实验整洁卫生。
离开实验室前检查电源、水源和门窗的安全等,并严格执行值日生登记制度。
二、实验报告的基本要求实验报告通过分析总结实验的结果和问题,加深对有关理论和技术的理解与掌握,提高分析、综合、概括问题的能力,同时也是学习撰写研究论文的过程。
1.实验报告应该在专用的生化实验报告本上、按上述格式要求书写。
2.实验报告的前三部分①实验原理、②实验材料(包括实验样品、主要试剂、主要仪器与器材)、③实验步骤(包括实验流程与操作步骤)要求在实验课前预习后撰写,作为实验预习报告的内容。
预习时也要考虑并设计好相应实验记录的表格。
3.每项内容的基本要求(1)实验原理:简明扼要地写出实验的原理,涉及化学反应时用化学反应方程式表示。
(2)实验材料:应包括各种来源的生物样品及试剂和主要仪器。
说明化学试剂时要避免使用未被普遍接受的商品名和俗名。
试剂要标清所用的浓度。
(3)实验步骤:描述要简洁,不能照抄实验讲义,可以采用工艺流程图的方式或自行设计的表格来表示,但对实验条件和操作的关键环节应写清楚,以便他人重复。
(4)实验记录:包括主要实验条件、实验中观察到的现象及实验中的原始数据。
(5)结果(定量实验包括计算):应把所得的实验结果(如观察现象)和数据进行整理、归纳、分析、对比,尽量用图表的形式概括实验的结果,如实验组与对照组实验结果的比较表等(有时对实验结果还可附以必要的说明)。
(6)讨论:不应是实验结果的重述,而是以结果为基础的逻辑推论。
如对定性实验,在分析实验结果的基础上应有中肯的结论。
还可以包括关于实验方法、操作技术和有关实验的一些问题,对实验异常结果的分析和评论,对于实验设计的认识、体会和建议,对实验课的改进意见等。
(7)结论:一般实验要有结论,结论要简单扼要,说明本次实验所获得的结果。
三、实验报告的评分标准(百分制)1.实验预习报告内容(30分)学生进入实验室前应预习实验,并书写预习报告。
实验预习报告应包括以下三部分:①实验原理(10分):要求以自己的语言归纳要点;②实验材料(5分):包括样品、试剂及仪器。
只列出主要仪器、试剂(常规材料不列);③实验方法(15分):包括流程或路线、操作步骤,要以流程图、表格式给出要点,简明扼要。
依据各部分内容是否完整、清楚、简明等,分以下三个等级给分。
优秀:项目完整,能反映实验者的加工、整理、提炼。
合格:较完整,有一定整理,但不够精炼。
不合格:不完整、缺项,大段文字,完全照抄教材,记流水账。
实验预习报告不合格者,不允许进行实验。
该实验应重新预约,待实验室安排时间后方可进行实验。
2.实验记录内容(20分)实验记录是实验教学、科学研究的重要环节之一,必须培养严谨的科学作风。
实验记录的主要内容包括以下三方面:①主要实验条件(如材料的来源、质量;试剂的规格、用量、浓度;实验时间、操作要点中的技巧、失误等,以便总结实验时进行核对和作为查找成败原因的参考依据);②实验中观察到的现象(如加入试剂后溶液颜色的变化);③原始实验数据:设计实验数据表格(注意三线表格式),准确记录实验中测得的原始数据。
记录测量值时,要根据仪器的精确度准确记录有效数字(如吸光值为0.050,不应写成0.05),注意有效数字的位数。
实验记录应在实验过程中书写;应该用钢笔或者圆珠笔记录,不能用铅笔。
记录不可擦抹和涂改,写错时可以准确划去重记。
记录数据时请教师审核并签名。
实验记录分以下三个等级给分。
优秀:如实详细地记录了实验条件、实验中观察到的现象、结果及实验中的原始数据(如三次测定的吸光度值)等;实验记录用钢笔或者圆珠笔记录,没有抹擦和涂改迹象。
书写准确,表格规范(三线表)。
有教师的签字审核。
合格:记录了主要实验条件,但不详细、凌乱;实验中观察到的现象不细致;原始数据无涂改迹象,但不规范。
有教师的签字审核。
不合格:记录不完整,有遗漏;原始数据有抹擦和涂改迹象、捏造数据(以0分计);图、表格形式错误;用铅笔记录原始数据;无教师的签字审核。
若记录的结果有怀疑、遗漏、丢失,必须重做实验,培养严谨的科学作风。
3.结果与讨论(45分)(1)数据处理(5分)对实验中所测得的一系列数值,要选择合适的处理方法进行整理和分析。
数据处理时,要根据计算公式正确书写中间计算过程或推导过程及结果,得出最终实验结果。
要注意有效数字的位数、单位(国际单位制)。
经过统计处理的数据要以X±SD表示。
可分成以下三个等级给分。
优秀:处理方法合理,中间过程清楚,数据格式单位规范。
合格:处理方法较合理,有中间计算过程;数据格式单位较规范。
不合格:处理方法不当;无中间过程;有效数字的位数、单位不规范。
(2)结果(20分)实验结果部分应把所观察到的现象和处理的最终数据进行归纳、分析、比对,以列表法或作图法来表示。
同时对结果还可附以必要的说明。
要注意图表的规范:表格要有编号、标题;表格中数据要有单位(通常列在每一列顶端的第一行或每一行左端的第一列)。
图也要有编号、标题,标注在图的下方;直角坐标图的纵轴和横轴要标出方向、名称、单位和长度单位;电泳图谱和层析图谱等要标明正、负极方向及分离出的区带、色带或色斑的组分或成分。
电泳结果还要标记泳道,并在图题下给出泳道的注释;要标出分子量标准的各条带的大小。
并且注意需要结合图表对结果进行较详细的解释说明。
可分成以下三个等级给分。
优秀:实验结果有归纳、解释说明,结果准确,格式规范。
合格:堆砌实验现象、数据,解释说明少。
不合格:最终实验结果错误且无解释说明,图表、数字不规范。
(3)讨论(20分)讨论应围绕实验结果进行,不是实验结果的重述,而是以实验结果为基础的逻辑推论,基本内容包括:①用已有的专业知识理论对实验结果进行讨论,从理论上对实验结果的各种资料、数据、现象等进行综合分析、解释,说明实验结果,重点阐述实验中出现的一般规律与特殊性规律之间的关系;②实验结果提示了哪些新问题,指出结果与结论的理论意义及其大小;③对实践的指导与应用价值;④实验中遇到的问题、差错和教训,与预想不一致的原因,有何待解决的方法,提出在今后的实验中需要注意和改进的地方;⑤实验目的是否达到。
同时能结合查阅的其他文献等资料进行讨论,有独到的见解。
在实验结果和理论分析的基础上,经过推理,归纳规律得出结论。
结论要严谨、精炼,表达要准确,与实验目的呼应。
也分三个等级给分。
优秀:分析实验结果的问题与经验;分析实验设计的优劣;能提出实验技术、方法的改进意见;能结合自己查阅的其他资料来讨论,有自己独到的见解;有结论。
合格:仅针对实验结果进行讨论,有一定自己的见解。
不合格:将讨论写成注意事项分析或回答思考题等,与实验结果无关。
4.格式与版面(5分)按照实验报告的书写格式、版面是否整洁、工整,分三个等级给分。
优秀:实验报告字体工整,版面整洁。
合格:实验报告字体较工整,版面较整洁。
不合格:实验报告字体潦草,版面凌乱。
5. 加分(5~10分):以全英文书写实验报告视情况加5~10分。
Introduction to Biochemistry ExperimentBiochemistry experiment is a preclinical curriculum of omni-specialties in biomedicine and an experimental curriculum for going with biochemistry teaching. Its task is to help students to understand and master the basic technical principles and methods in biochemistry, to possess the abilities of analyzing problems and working out solutions independently. By learning this curriculum, the students should understand the basic experimental principles of spectrophotometry,chromatography, electrophoresis and centrifuge, et al.,master the basic technical skills commonly used with these principles and possess the abilities to apply the skills systematically and to optimize the experiment conditions. The goal of biochemistry experiment is to make the students strengthen their grasp of the biochemistry theories and to integrate what they have learned with scientific research and clinical application.There are 9 experiments that represent most important areas of biochemistry including characterization of proteins and nucleic acid by electrophoresis and spectroscopic or chromatographic analysis. These experiments are essential for a typical one-semester course and are to be revised and updated when necessary. New experiments will be added to this list in the future to cover more topics of biochemistry and to reflect the many advances in biochemistry.Biochemistry Laboratory Rules1.Pre-Laboratory PreparationAll students must prepare BEFORE ARRIVING IN THE LABORATORY. The experiments are designed so that they can be carried out – with proper advance planning –within the four-hour laboratory periods. It is expected that students should have a fundamental understanding of the theory and practices pertaining to the experiment before entering the laboratory to conduct these experiments.Biochemical experiments often employ toxic chemicals. For the health and safety of all students, the experimental protocols must be studied and the day’s activities should be planned in advance. If it becomes obvious that a student is ill-prepared, he or she will not be permitted to continue the experiment.2.Safety Precautions in the Biochemistry LaboratoryAll INJURIES, no matter how minor, should be reported to the instructor IMMEDIATELY. If you have any questions regarding the safe handling of any biochemical, consult your instructor.3.Strictly follow the experimental procedures.Turn to instructors immediately for help once the laboratory instruments don’t work.DON’T try to fix the breakdown by yourself. Proper compensation for loss because of your own fault will be demanded.4.Disposal of SolutionsIn most cases the solutions used during the laboratory can be disposed of as directed by laboratory personnel at the end of the period. Any volatile organic solvents should be placed in the hood as directed. Laboratory personnel will then dispose of these solvents.5.Solid trashes including waste papers are prohibited to discard into the sink.6.All the glassware should be cleaned immediately after use. And all the reagent bottles and instruments should be placed neatly after use.7.An experiment report should be submitted to the Professor and/or TAs in time. Laboratory Report1.Although students will work in pairs for all experiments, each student must turn in an individual laboratory report, written by himself or herself. These reports should be clearly written in ink, typed, or printed and be clear and legible. If mistakes are made, neatly cross them out and enter the corrections nearby. Reports should be written in the third person (e.g., do not use “I” or “we”).STAPLE a Title Page to the top of the report and STAPLE the accompanying graphs, tables, and laboratory notebook sheets to the back. If the report is not clearly presented, the instructor may return the report without grading it.2.Each laboratory report should consist of:a. Title PageA title page for each experiment is required and should state the title of theexperiment, the name of the student, the dates of the laboratory periods covered, the names of the laboratory partners, and the date that the laboratory report is due.b. ObjectivesStatement of the point of the experiment - in no more than two sentences.c. ProceduresDO NOT recapitulate the laboratory protocol. Write in you OWN words. A clear flowchart of the procedures is recommended.d. ResultsThis section should summarize your observations presented in the form of graphs, calculations, tables, etc.e. DiscussionEvaluate your data. Explain what you observed and also why you think the data were as observed. Do not restate procedures! List possible sites of error.Whenever possible demonstrate your understanding of the theory behind the experiment. Support your results (e.g.: “Using the linear portion of the Absorbance vs. Concentration graph to calculate the slope, it was determined that...”) (Limit ed to only one page per experiment for experiments 1 - 6 and four pages for experiment 7-9).3.If any laboratory report is not completed and turned in by the end of the quarter, the student maybe receive an Incomplete for the course at the discretion of the instructors;alternatively a “zero” for the missing laboratory report will be recorded and the final grade determined accordingly.【实验报告第一部分(预习报告内容):①实验原理、②实验材料(包括实验样品、主要试剂、主要仪器与器材)、③实验步骤(包括实验流程、操作步骤和注意事项);评分(满分30分):XX】1、实验原理:蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。