CFX96 实时荧光定量PCR培训教材PPT
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实时荧光定量PCR技术全面分析ppt课件
定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR 扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终 精确的对起始模板的定量分析
4
常规vs实时
优缺点比较 定量PCR
常规PCR
灵敏度高 高精确度 安全省时
只能进行半定量或定性 分析 不安全易污染 费时费力
5
定量PCR三个基本概念
扩增曲线
背景期
指数增 长期
相关系数(R2) ---大于0.99
平行管重复性 ---SD小于0.167
58
标准曲线差
可能的影响因素
稀释精度 加样精度 反应体系的优化 模板降解
59
定量PCR的新 运用
60
等位基因分型（SNP研究) MicroRNA分析 基因拷贝数（CNV)分析 蛋白质分析
61
62
相对定量的问题 样品材料不均一造成的差别
内标基因 内标通常是b-actin、GAPDH、18SrRNA等看家基因 （内标基因的表达要相对恒定，表达不受处理因素影响） 对目的基因进行均一化：去除样本间加样量不同带来的 误差
19
SYBR Green I法进行相对定量的问
题
问题：
SYBR Green I可以与非特异性双链结合 信号 结果不准确
理想的PCR反应： 非X理n=X想0×的2PnCR反应：
Xn=X0(1+Ex)n
方程式两边同时取对数得:
log Xn=log (X0 (1+Ex)n)
整理方程式得:
n：扩增反应的循环次数
Xn：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率
log X0= (- log(1+Ex) )×n+ log Xn
结合双链DNA分子小沟 延伸结束，形成双链DNA，SYBR Green结合到双螺旋小沟中，当受到适 合光源激发，发射出荧光，反映产物 浓度
4
常规vs实时
优缺点比较 定量PCR
常规PCR
灵敏度高 高精确度 安全省时
只能进行半定量或定性 分析 不安全易污染 费时费力
5
定量PCR三个基本概念
扩增曲线
背景期
指数增 长期
相关系数(R2) ---大于0.99
平行管重复性 ---SD小于0.167
58
标准曲线差
可能的影响因素
稀释精度 加样精度 反应体系的优化 模板降解
59
定量PCR的新 运用
60
等位基因分型（SNP研究) MicroRNA分析 基因拷贝数（CNV)分析 蛋白质分析
61
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相对定量的问题 样品材料不均一造成的差别
内标基因 内标通常是b-actin、GAPDH、18SrRNA等看家基因 （内标基因的表达要相对恒定，表达不受处理因素影响） 对目的基因进行均一化：去除样本间加样量不同带来的 误差
19
SYBR Green I法进行相对定量的问
题
问题：
SYBR Green I可以与非特异性双链结合 信号 结果不准确
理想的PCR反应： 非X理n=X想0×的2PnCR反应：
Xn=X0(1+Ex)n
方程式两边同时取对数得:
log Xn=log (X0 (1+Ex)n)
整理方程式得:
n：扩增反应的循环次数
Xn：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率
log X0= (- log(1+Ex) )×n+ log Xn
结合双链DNA分子小沟 延伸结束，形成双链DNA，SYBR Green结合到双螺旋小沟中，当受到适 合光源激发，发射出荧光，反映产物 浓度
实时荧光定量PCR介绍课件
实时荧光定量PCR介绍
4/5/2024 • 21
质粒标准品构建流程
目的基因
PCR
目的基因
目的基因克隆
目的基因
基因组DNA 质粒
质粒提取，OD值定量。将质粒梯度稀释至105-101 copies/ul，作为标准品。
实时荧光定量PCR介绍
4/5/2024 • 22
体外转录RNA标准品构建流程
目的基因
4/5/2024 • 12
RT Primer的选择
• Random Primer • Oligo dT Primer • Gene Specific Primer
Random 6mer Primer Gene Specific Primer
Oligo dT Primer
PCR F-Primer PCR R-Primer
实时荧光定量PCR介绍
4/5/2024 • 13
RT Primer的选择
Random
目的片段在mRNA任何位
5’
目的片段
3’ 置都能使用。通常mRNA
F
R
Random
表达量分析最适。
5’
目的片段
AAA··· 3’ 适用于mRNA表达量分析，
F
R
提升反应检测的灵敏度。
1,500 base
OOligligooddTTPPrirmimeer r 目的片段在距Poly(A) Tail
Real Time PCR用引物与普通PCR引物设计要求不同
普通PCR引物 目的是获得目的基因，对非特异性反应和引物二聚 体要求不严格。
Real Time PCR引物 目的是让目的基因按照理论值进行扩增，对非特异 性反应和引物二聚体要求严格。
实时荧光定量PCR ppt
SYBR Green I
5’
3’
SG Excitation
SG
Emission
SG
3’
SG
5’
SG
SYBR Green I
Excitation
SG
5’ 3’
SG SG SG
Emission 3’ 5’
SG
Taqman 探针
一种短的寡核苷酸序列，5’末端连接有荧光报 告基团，3’端连接有荧光淬灭基团。报告基团和 淬灭基团紧密接近，几乎探测不到荧光信号。
10
20
21
30
40
Ct值: 是指在PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入
指数增长阶段的拐点所经历的循环次数。
实时荧光定量PCR 数学原理
PCR反应扩增方程：Xn=X0﹡(1+En)n Xn： 第n次循环后扩增产物量 X0 ： 起始模板量 n ： 扩增循环次数 En ： 第n轮PCR扩增的效率
实时荧光定量PCR 数学原理
软件系统
实时荧光定量PCR 应用
目的基因定量检测：如基因拷贝数确定、 病毒DNA（如乙肝病毒）含量测定 基因表达研究：组织或细胞中基因表达 （mRNA水平） 基因突变研究：对单个突变位点的检测 （如单核苷酸多态性研究）
实时荧光定量PCR 定量检测方法
绝对定量法
扩增曲线 标准曲线
阈值 109 108 107 106 105 104 103 102 101 100
利用已知起始模板DNA含量的标准品可做出标准曲线，得 到该PCR扩增反应存在的线性关系。
实时荧光定量PCR 定量检测方法
绝对定量法
标准曲线
利用已知起始模板DNA含量的标准品可做出标准曲线，得 到该PCR扩增反应存在的线性关系。
实时荧光定量PCR实验原理与技术 ppt课件
非特异的双链如引物二聚体或非特异性扩增产物等结合。
要避免这些非特异荧光信号对定量精确性的影响，可以利
用热循环仪内设定的熔解反应程序对扩增产物进行熔解曲 线分析。
熔解曲线峰为 单一峰形，未 见其他峰值， 并且峰的形状 也比较锐利。 扩增产物特异 性好。
qRT-PCR技术实验操作（优化）
有研究建议在每一个循环中 PCR 延伸后增加一步，即
水解探针法
分子信标
Scorpion引物/探针 复合探针
qRT-PCR技术影响因素
① 样品RNA 的完整性 ② RNA 样品中的基因组 DNA污染
③ 特异性良好的引物
④ PCR反应体系的优化 ⑤ 反转录所得 cDNA 的量必须精确地等于相应的
mRNA的量 ⑥ 可靠的内标基因：
TEF-2
热循环参数的设置 上机前样本的制备 检测程序的设置 运行检测程序果分析 扩增曲线 结果的显示与输出
qRT-PCR技术实验操作
qRT-PCR技术实验操作（优化）
qRT-PCR技术实验操作（优化）
qRT-PCR技术实验操作（优化）
假阳性：荧光染料能和任何 ds DNA 结合，因此它也能与
qRT-PCR技术实验操作（优化）
1、同管扩增：减少操作误差，引物间影响大
2、异管扩增：扩增结果真实可信，具有操作误差
总RNA提取； 2. 模板cDNA制作； 3. 半定量PT-PCR：
1.
1. 引物设计及选择：a)上下游引物设计在跨内含子的
2.
3. 4. 5.
一个外显子的5’端和下一个外显子的3’端。b)设计在 两个离得远的外显子上。 引物的长度：严格配对17-19bp。最后一个碱基为C或 G；GC含量为40％-60％之间。如此，管家基因与目 的基因的退火温度基本一致。长度一般设计为 350bp-600bp之间 内参的选择 同管扩增或异管扩增的选择 PCR循环数的选择
PPT荧光定量PCR(共31张PPT)
➢ 3’端标记有荧光淬灭集团（Quencher，Q） ➢ 探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发
荧光
➢ Taq酶有5’→3’外切核酸酶活性，可水解探针
荧光标记物的选择
绝对定量：指的是用已知的标准曲线来推算未知的样本 的量，绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的 拷贝数或浓度
以不同稀释度的标准品为模板进行定量PCR并获得对应的CT，即可制作 标准曲线
25
y = -3.2461x + 26.443
20
R2 = 0.9976
15
E=103.2647%
10
5
0
0
2
4
6
8
以lg（CT）为纵坐标，lg（拷贝数）为横坐标，绘制标准曲线 扩增效率（E）= （10-1/斜率-1） × 100% 相关系数（R2）应大于0.99，越接近1越好 E应介于95%与105%，越接近100%越好
Ct值：每个反应管内的荧光信号达到荧光域值时所需的循环数。
✓ 每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系， 起始拷贝数越多，
CT值越小
✓ 利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此只要获得未知样品的Ct值，即可 从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数
非特异性荧光标记 ➢ SYBR Green I
❖ 引物质量尽可能避免自身及上下游错配、发卡 结构
❖ 跨越内含子设计引物
❖ Primer-BLAST确认引物的特异性，避免扩增出 1000 bp以下的非目的产物
方法
优点
缺点
适用范围
绝对定量
定量准确
工作量较大， 需额外绘制目 标基因的标准 曲线
所有
相对定量
荧光
➢ Taq酶有5’→3’外切核酸酶活性，可水解探针
荧光标记物的选择
绝对定量：指的是用已知的标准曲线来推算未知的样本 的量，绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的 拷贝数或浓度
以不同稀释度的标准品为模板进行定量PCR并获得对应的CT，即可制作 标准曲线
25
y = -3.2461x + 26.443
20
R2 = 0.9976
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E=103.2647%
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以lg（CT）为纵坐标，lg（拷贝数）为横坐标，绘制标准曲线 扩增效率（E）= （10-1/斜率-1） × 100% 相关系数（R2）应大于0.99，越接近1越好 E应介于95%与105%，越接近100%越好
Ct值：每个反应管内的荧光信号达到荧光域值时所需的循环数。
✓ 每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系， 起始拷贝数越多，
CT值越小
✓ 利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此只要获得未知样品的Ct值，即可 从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数
非特异性荧光标记 ➢ SYBR Green I
❖ 引物质量尽可能避免自身及上下游错配、发卡 结构
❖ 跨越内含子设计引物
❖ Primer-BLAST确认引物的特异性，避免扩增出 1000 bp以下的非目的产物
方法
优点
缺点
适用范围
绝对定量
定量准确
工作量较大， 需额外绘制目 标基因的标准 曲线
所有
相对定量
实时荧光定量PCR的原理、操作及其应用PPT课件
THANKS FOR WATCHING
感谢您的观看
它利用荧光染料或荧光探针标记特异性引物，在PCR反应过 程中，随着DNA或RNA的扩增，荧光信号被逐渐释放，通过 检测荧光信号的强度，可以实时监测DNA或RNA的扩增量。
实时荧光定量PCR的原理概述
实时荧光定量PCR的基本原理是在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针，这些荧光物质 与DNA或RNA结合后，在特定波长光的激发下产生荧光信号。
环介导等温扩增技术
在恒温条件下进行核酸扩增，具有快速、特异性强和灵敏度高等优 点。
纳米材料与PCR的结合
利用纳米材料的特性，提高PCR的检测效率和灵敏度。
提高检测灵敏度与特异性
信号放大技术
通过使用信号放大系统，提高检测信号，从而提高检测灵 敏度。
特异性引物和探针的设计
针对目标基因设计特异性引物和探针，降低非特异性扩增 和交叉污染的风险。
选择合适的内参基因
选择稳定的内参基因
01
内参基因应具有稳定的表达水平，不受实验处理的影响。
验证内参基因的稳定性
02
通过实时荧光定量PCR技术，对候选内参基因进行稳定性评估。
使用多个内参基因参基因进行数据校正。
数据解读与报告
标准化处理
对原始数据进行标准化处理，消 除不同样本间的差异。
样本处理
对样本进行破碎、离心、 提取核酸等处理，以获得 待测的DNA或RNA。
浓度和纯度测定
使用紫外分光光度计等设 备测定核酸浓度和纯度， 确保符合实验要求。
引物设计与选择
引物设计
根据目标基因序列，利用 引物设计软件进行引物设 计。
引物筛选
根据实验需求，筛选出特 异性好、扩增效率高的引 物。
CFX96 实时荧光定量PCR培训教材PPT
染料重新分配
1.2kb 200bp
2.5kb
200bp 1.2kb 2.5kb
Source: Barrett et al., Quantace Ltd.
高分辨溶解曲线
High Resolution Melt (HRMes - LCgreen, EvaGreen and Syto9 (DNA饱和染料，低抑制作用)
传统 PCR
传统 PCR
传统 PCR
传统 PCR
通过凝胶电泳对终产物进 行定性分析 (30 cycles)
PCR: 理论vs. 实际
Log Target DNA
• In theory, PCR reactions amplify exponentially, doubling every cycle and grow forever. • In reality,
Saturation Dyes
Eva Green Mix
Bio-Rad
Dye saturation leaves no room for relocation events during melting
PCR 抑制作用
1x
1.5x
Source: Barrett et al., Quantace Ltd.
Input
1 X 106 1 X 105 1 X 104 1 X 103 1 X 102
C(t)
17.09 ± 0.04 20.10 ± 0.06 23.41 ± 0.05 26.68 ± 0.05 30.26 ± 0.26
定量PCR优点
定量：对初始模板的绝对定量 优点：更灵敏，宽广的动力学范围 污染机会少：闭管化学 没有后处理：不用杂交、电泳、拍照
-实时荧光定量PCRppt课件
标准品的稀释 Real-time PCR 数据的分析 Real-time PCR产物的电泳
荧光定量 PCR 所使用的荧光化学可分为两种：荧光 探针和荧光染料。
荧光定量 PCR 最常用的方法是 DNA 结合染料 SYBR GreenⅠ的非特异性方法和 Taqman 水解探针 的特异性方法，
新疆医科大学第一附属医院
The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University
解曲线来分析产物的均一性有助于分析由 SYBR Green I 得到定量结果。另外， 因为 SYBR Green I 不能区分不同扩增子发出的荧光而导致它不能用于多重反
应。
新疆医科大学第一附属医院
The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University
新疆医科大学第一附属医院
The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University
-实时荧光定量 PCR
新疆医科大学第一附属医院
The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University
（一）实时荧光定量PCR原理 和应用
新疆医科大学第一附属医院
The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University
PCR 定量PCR 荧光化学监测物质 实时荧光定量PCR应用
ＰＣＲ技术
新疆医科大学第一附属医院
The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University
实时荧光定量PCR技术ppt课件
斜率与扩增效率
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
荧光定量PCR化学原理
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个
2、用校准样本的ΔCT值归一试验样本的ΔCT值：
ΔΔCT= ΔCT（test) - ΔCT（calibrator)
3、计算表达水平比率：
2 –ΔΔCT=表达量的比值
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
平台PCR仪介绍
ABI 7500 fபைடு நூலகம்st
特征：
使用96孔板，样品量大，仪器稳定，结果分析直
观
ABI试剂ROX校正物理方面的误差：枪的误差
（如试剂体积）、耗材质量（如管盖厚度、透光
性能不一致）所导致的光能损失、仪器稳定性
（如孔间、批间温度的波动）
Rn= Normalization = Reporter / Referenc
基因在不同组织中的表达差异
药物疗效考核
耐药性研究
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
实时荧光定量PCR(qPCR,RT-PCR)的原理及应用ppt课件
内标（Endogenous Control） 通常是18S、28S、β-actin、GAPDH基因等看家基因
在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定， 受环境因素影响小 内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数 量
15
RT-PCR技术的数据分析
PCR分四个阶段
16
RT-PCR技术的数据分析如何定量？-ΔΔCt
实时荧光定量PCR技术 的原理及应用
（Real Time Quantitative PCR）
2013-11-26
1
实时荧光定量PCR目录 Contents
一、实时荧光定量PCR的定义 二、RT-PCR技术的原理及试验流程 三、RT-PCR技术的数据分析
四、RT-PCR技术的应用
2
实时荧光定量PCR的定义
RT-PCR技术的数据分析
21
RT-PCR技术的数据分析
相对定量分析方法 -ΔΔCt
前提:目标序列和内参序列的扩增效率接近100％ 且偏差在 5％以内 1、用目标基因的CT值减内参基因的CT值：
ΔCT（test)= CT （target, test) - CT （ref, test) ΔCT（control)= CT （target, control) - CT （ref, control)
2、用试验样本的ΔCT值减校准样本的ΔCT值：
ΔΔCT= ΔCT（test/control) - ΔCT（calibrator)
3、计算表达水平比率： 相对表达量RQ= 2 –ΔΔCT
22
RT-PCR技术的数据分析
SYBR Green 熔解曲线分析
23
RT-PCR技术的应用
• 临床疾病诊断：各型肝炎、艾滋病、禽流感等传染病诊断 和疗效评价；肿瘤标志物及瘤基因检测实现肿瘤病诊断； 遗传基因检测实现遗传病诊断。
在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定， 受环境因素影响小 内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数 量
15
RT-PCR技术的数据分析
PCR分四个阶段
16
RT-PCR技术的数据分析如何定量？-ΔΔCt
实时荧光定量PCR技术 的原理及应用
（Real Time Quantitative PCR）
2013-11-26
1
实时荧光定量PCR目录 Contents
一、实时荧光定量PCR的定义 二、RT-PCR技术的原理及试验流程 三、RT-PCR技术的数据分析
四、RT-PCR技术的应用
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实时荧光定量PCR的定义
RT-PCR技术的数据分析
21
RT-PCR技术的数据分析
相对定量分析方法 -ΔΔCt
前提:目标序列和内参序列的扩增效率接近100％ 且偏差在 5％以内 1、用目标基因的CT值减内参基因的CT值：
ΔCT（test)= CT （target, test) - CT （ref, test) ΔCT（control)= CT （target, control) - CT （ref, control)
2、用试验样本的ΔCT值减校准样本的ΔCT值：
ΔΔCT= ΔCT（test/control) - ΔCT（calibrator)
3、计算表达水平比率： 相对表达量RQ= 2 –ΔΔCT
22
RT-PCR技术的数据分析
SYBR Green 熔解曲线分析
23
RT-PCR技术的应用
• 临床疾病诊断：各型肝炎、艾滋病、禽流感等传染病诊断 和疗效评价；肿瘤标志物及瘤基因检测实现肿瘤病诊断； 遗传基因检测实现遗传病诊断。
实时荧光定量PCR技术原理ppt课件
样本处理与RNA提取
外界刺激 –10min – 可检测的表达改变 样品离开定义环境 –2min– 裂解、固定细胞 TRIzon（酚、异硫氰酸胍） 裂解液 （氰酸胍，异硫氰酸胍， SDS） 液氮 RNA保存液 小心DNA污染！ 使用DNase 阴性对照
逆转录
逆转录引物选择 下游应用：是否检测其它基因？ Abundant RNA的干扰：mRNA or total RNA？ 检测灵敏度是否足够？
传统PCR检测
Real-time qPCR
激发光
发射光
-- 在PCR反应体系中加入荧光基团。 -- 荧光基团在激发光的作用下，产生波长更长的发射光。 -- 利用荧光信号的变化动态监测整个反应过程。
荧光基团
扩增曲线（primary curve）
扩增曲线： 随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光信号，通过荧光强度的变化监测扩增产物量的变化，从而得到扩增曲线图。 纵坐标：Rn（荧光值） 横坐标：cycle number（循环数）
lgX0与Ct值呈线性关系 根据Ct值可以计算出样本中起始模板所含有的拷贝数 起始拷贝数越多，Ct值越小。
Rn vs. Cycle number-- 扩增曲线
LogDNA vs. Ct -- 标准曲线
.
未知
104
103
106
105
102
10
标准曲线 (standard curve)
标准曲线分析 -- 对已知或未知样本进行系列浓度梯度稀释
主要内容
Real-time qPCR的定量原理
2
Real-time qPCR的检测方法
3
Real-time qPCR的基本概念
外界刺激 –10min – 可检测的表达改变 样品离开定义环境 –2min– 裂解、固定细胞 TRIzon（酚、异硫氰酸胍） 裂解液 （氰酸胍，异硫氰酸胍， SDS） 液氮 RNA保存液 小心DNA污染！ 使用DNase 阴性对照
逆转录
逆转录引物选择 下游应用：是否检测其它基因？ Abundant RNA的干扰：mRNA or total RNA？ 检测灵敏度是否足够？
传统PCR检测
Real-time qPCR
激发光
发射光
-- 在PCR反应体系中加入荧光基团。 -- 荧光基团在激发光的作用下，产生波长更长的发射光。 -- 利用荧光信号的变化动态监测整个反应过程。
荧光基团
扩增曲线（primary curve）
扩增曲线： 随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光信号，通过荧光强度的变化监测扩增产物量的变化，从而得到扩增曲线图。 纵坐标：Rn（荧光值） 横坐标：cycle number（循环数）
lgX0与Ct值呈线性关系 根据Ct值可以计算出样本中起始模板所含有的拷贝数 起始拷贝数越多，Ct值越小。
Rn vs. Cycle number-- 扩增曲线
LogDNA vs. Ct -- 标准曲线
.
未知
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标准曲线 (standard curve)
标准曲线分析 -- 对已知或未知样本进行系列浓度梯度稀释
主要内容
Real-time qPCR的定量原理
2
Real-time qPCR的检测方法
3
Real-time qPCR的基本概念
《荧光定量PCR》幻灯片PPT
根据未 • 知样品的c 值，即可在标准曲线中得到样品的拷贝数。
质粒 • DNA和体外转录的RNA常作为绝对定量的标准品。相对
定量指 • 的是在一定样本中靶基因相对于另一参照基因的量的变
化。
实时荧光定量PCR技术的原理及 应用
(Real time Quantitative PCR)
原理
• 其定量的根本原理是在 PCR 反响体系中参加非 特异性的荧光染料〔如： SYBR GREEN I 〕或特 异性的荧光探针〔如： Taqman 探针〕，实时 检测荧光量的变化，获得不同样品到达一定的 荧光信号〔阈值〕时所需的循环次数： CT 值 〔 Cycle Threshold 〕；
•
当将探针与样品杂交时，探针和与其互补的核酸〔DNA或
RNA〕序列通过氢键严密相连，随后，未被杂交的多余探针被
洗去。最后，根据方法来判断样品中是否，或者何位置含有被测
序列〔即与探针互补的序列〕。
探针设计原那么
• 1. 保守：探针要绝对的保守，有时分型就仅仅依靠探针来决定。理论 上有一个碱基不配对，就可能检测不出来。 2. Taqman探针的长度最好在25-32bp之间，且Tm值在68-72℃之间，确 保探针的Tm值要比引物的Tm值高出5-10℃，这样可保证探针在退火时 先于引物与目的片段结合。 3. 确保探针中GC含量在30-80%。 4. 防止探针中多个重复的碱基出现，尤其是要防止4个或超过4个的G 碱基 5. 探针的5’端不能为G，因为即使单个G碱基与FAM荧光报告基团相连 时， 也可以淬灭FAM基团所发出的荧光信号，从而导致假阴性的出现。 6. Taqman探针应靠近上游引物，即Taqman探针应靠近与其在同一条 链上的 上游引物。两者的距离最好是探针的5’端离上游引物的3’有一 个碱基。 7. 防止探针与引物之间形成二级构造。 8. 对于多重定量PCR，例如SNP分型检测时，SNP位点应设计在探针的 中间位置，并且两种探针的Tm值应相近。
质粒 • DNA和体外转录的RNA常作为绝对定量的标准品。相对
定量指 • 的是在一定样本中靶基因相对于另一参照基因的量的变
化。
实时荧光定量PCR技术的原理及 应用
(Real time Quantitative PCR)
原理
• 其定量的根本原理是在 PCR 反响体系中参加非 特异性的荧光染料〔如： SYBR GREEN I 〕或特 异性的荧光探针〔如： Taqman 探针〕，实时 检测荧光量的变化，获得不同样品到达一定的 荧光信号〔阈值〕时所需的循环次数： CT 值 〔 Cycle Threshold 〕；
•
当将探针与样品杂交时，探针和与其互补的核酸〔DNA或
RNA〕序列通过氢键严密相连，随后，未被杂交的多余探针被
洗去。最后，根据方法来判断样品中是否，或者何位置含有被测
序列〔即与探针互补的序列〕。
探针设计原那么
• 1. 保守：探针要绝对的保守，有时分型就仅仅依靠探针来决定。理论 上有一个碱基不配对，就可能检测不出来。 2. Taqman探针的长度最好在25-32bp之间，且Tm值在68-72℃之间，确 保探针的Tm值要比引物的Tm值高出5-10℃，这样可保证探针在退火时 先于引物与目的片段结合。 3. 确保探针中GC含量在30-80%。 4. 防止探针中多个重复的碱基出现，尤其是要防止4个或超过4个的G 碱基 5. 探针的5’端不能为G，因为即使单个G碱基与FAM荧光报告基团相连 时， 也可以淬灭FAM基团所发出的荧光信号，从而导致假阴性的出现。 6. Taqman探针应靠近上游引物，即Taqman探针应靠近与其在同一条 链上的 上游引物。两者的距离最好是探针的5’端离上游引物的3’有一 个碱基。 7. 防止探针与引物之间形成二级构造。 8. 对于多重定量PCR，例如SNP分型检测时，SNP位点应设计在探针的 中间位置，并且两种探针的Tm值应相近。
实时荧光定量PCR技术PPT课件(模板)
Cycle number
Sample
Ck 104
Ck 102 Lg of DNA concentration
qPCR 常用实验方法
A
B
C
简单 成本较低
适用于多重PCR 特异性较好
可进行SNP检测 特异性非常好
SYBR Green I 染料法——原理
SYBR Green I 是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色 激发波长的染料
大多数荧光定模量板PCRD实N验的AC量T值越在1多8-30，之间荧。 光达到 荧rea光lm定阈a量steP值rCmRix的参数循解析环-- C数T值越少，即Ct值越小。
-引物和扩增产物二级结构的预测
乙1v肝标病准人品血ii+液9Lv中稀oHg释B模缓V的冲板绝液对，起定得量标始准浓品iii度与Ct值呈线 性关系。 已知在50%的乳腺肿瘤样本中, ERBB2表达异常, 因此可以作为一个检测标准
待Sta测n样da本rd拷cu贝rv数e （copies/ul标）准=待品测样本浓度5×/样1本0分3 子量×268×.110814 28.64
C-不al要ibr有at连or续: 可4以个用G 带有PCR扩增子的合成的RNA或cDNA寡核苷酸；
输C乙用RHTee入肝Nfa值eol要 病tr-h是eTy查人ne判cRm找血e断NpR的液lAa实Nt蛋中eA验C白Hp成oBo或no功Vtl是r的s与o；l基绝(否N因对的T标标名定C重)准准称量检要品品验参q考PCR体系55××（11引00物45 ）
实验数据 实cD验NA步合骤成：(提两取步H法BVqRDTN-PAC；R)
T9a5q~m1 anS探lop针e法: -—3.—原理
c可D以NA是影含响有q目PC的R基敏因感的度质粒、PCR产物、基因组DNA等。
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T
标准曲线
105 copies/well
Ct值特性
ProductT = (Template0)2n
(n = # of cycles)
ProductT = (Template0)23.32 = (Template0)10
Input
120 ng 60 ng 30 ng 15 ng
C(t)
24.38 ± 0.09 25.64 ± 0.09 26.68 ± 0.04 27.71 ± 0.04
实时荧光定 量PCR原理与 应用
Gene Expression Division China Marketing Bio-Rad Laboratories
提纲
•PCR
•定量PCR
•荧光化学监测物质 •实时荧光定量PCR应用
PCR目的及背景
多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)简称ＰＣＲ技术，是８ ０年代中期发展起来的一种体外扩增特异ＤＮＡ片段的技术。此法操 作简便， 可在短时间内在试管中获得数百万个特异的目的ＤＮＡ序列 的拷贝. 分子克隆， 目的基础检测，遗传病的基因诊断，法医学，考古学等方 面得到了广泛的应用。 ＰＣＲ技术实际上是在模板ＤＮＡ， 引物和４种脱氧核苷酸存在的条 件下依赖于ＤＮＡ聚合酶的酶促合反应，ＰＣＲ技术的特异性取决于 引物和模板ＤＮＡ结合的特异性。 反应分三步：①变性 （denaturation）；②退火（annealing）；③延伸（ex tension）， 反应过程见图。
C(t) value
Threshold line
C(t) value
18.12 +/- 0.04
定量PCR分析初始模板特点
标准曲线
108
标准曲线
108
106
标准曲线
108
106
104
标准曲线
108
106
104
102
标准曲线
108
106
104
102
T
标准曲线
标准曲线
108
106
104
102
融解曲线反应程序
1、融解曲线在定量PCR反应完成之后
2、软件自动分析结果，生成融解曲线图谱
融解曲线分析-原始图谱
融解曲线分析-导数图谱
EvaGreen 饱和荧光染料
非饱和双链DNA荧光染料：e.g. SYBR GreenI 饱和双链DNA荧光染料：e.g. Eva Green
饱和染料特点
饱和型的专用DNA染料 高浓度不抑制PCR反应 当双链DNA局部解链时，游离下来的染料不会重新结合到DNA分子上去, 荧光强度的降低精准可靠地反映出DNA分子的解链情况
Cycle 2
Linear Log View View
F 4X模板 F F F F
荧光检测
荧光监测化学物质
30-40 循环
荧光阈值与Ct值
•荧光阈值：在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧光强度标准(即PCR 扩增产物量的标准) •Ct值的定义是PCR扩增过程中，扩增产物(荧光信号）到达阈值时（进入指 数增长期）所经过的扩增循环次数
操作简单测定，又可单点测定
提纲
•PCR
•定量PCR
•荧光化学监测物质 •实时荧光定量PCR应用
荧光化学物质
非特异性标记 SYBR Green I Eva Green
特异性的荧光探针 TaqMan 分子信标(Molecular beacons)
– Able to resolve 0.1oC increments （仪器在融解过程中 更密集地收集数据） – Algorithm able to separate small difference in Tm（分 析算法可以分辨Tm值的微小差异）
Hardware
Software
Just import CFX Melt Data
(—) G:G – Wild-type (—) A:A – Homozygous Mutant (—) G:A – Heterozygous
Methylation Studies – CGU (Taipei)
Temperature shifted
Difference curve
TAQMAN 探针
SYBR Green I
SYBR Green I
SYBR Green I
SYBR Green I
SYBR Green I
使用方便，只需要一对 引物 －－ 不必设计复杂 的荧光探针 熔解曲线 －－鉴定PCR有无杂 带、引物二聚体 便宜 灵敏 无模板特异性 －－不能分辨非特异 产物 不能做复合PCR扩增
传统 PCR
传统 PCR
传统 PCR
传统 PCR
通过凝胶电泳对终产物进 行定性分析 (30 cycles)
PCR: 理论vs. 实际
Log Target DNA
• In theory, PCR reactions amplify exponentially, doubling every cycle and grow forever. • In reality,
染料重新分配
1.2kb 200bp
2.5kb
200bp 1.2kb 2.5kb
Source: Barrett et al., Quantace Ltd.
高分辨溶解曲线
High Resolution Melt (HRM)
Chemistry
– DNA binding dyes - LCgreen, EvaGreen and Syto9 (DNA饱和染料，低抑制作用)
Precision Melt - Genotyping
Homozygous - CC
Heterozygous - CT
Homozygous - TT
SsoFast EvaGreen & SNP Genotyping
Discrimination of a Class 2 SNP
GA Mutation
TAQMAN 探针
TAQMAN 探针
TaqMan探针小结
对目标序列有很高的特异性 ---特别适合于SNP检测 可以在一个反应中进行两个基因的定量 荧光强度与反应物成正比
反应成本较高
设计复杂
提纲
•PCR
•定量PCR
•荧光化学监测物质 •实时荧光定量PCR应用
定量PCR应用I-实时定量
Input
1 X 106 1 X 105 1 X 104 1 X 103 1 X 102
C(t)
17.09 ± 0.04 20.10 ± 0.06 23.41 ± 0.05 26.68 ± 0.05 30.26 ± 0.26
定量PCR优点
定量：对初始模板的绝对定量 优点：更灵敏，宽广的动力学范围 污染机会少：闭管化学 没有后处理：不用杂交、电泳、拍照
Automatic selection of Pre- and Post- Melt regions
Normalize curves
Just check normalized plots and apply temperature shift
Automatically detects clusters
Theoretic al increase Reali ty
Cycle #
普通PCR分析终产物特点
108
106
104
102
100 倍稀释
提纲
•PCR
•定量PCR
•荧光化学监测物质 •实时荧光定量PCR应用
定量PCR
模板
通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析
F
Cycle 1
2X 模板
F F 本底期、指数扩增期、平台期
Saturation Dyes
Eva Green Mix
Bio-Rad
Dye saturation leaves no room for relocation events during melting
PCR 抑制作用
1x
1.5x
Source: Barrett et al., Quantace Ltd.
DNA定量－拷贝数研究（替代Southern Blot） –病原体定量检测 –转基因拷贝数的检测 RNA定量－基因表达差异（替代Northern Blot) 单个或多个基因地表达谱分析 –不同组织、器官 –不同时期 –不同处理
定量PCR应用II：终点读板
•基因突变分析 –单基因遗传病诊断，如血友病、地贫 •SNP扫描 –疾病相关基因鉴定，如牛皮癣、哮喘相关基因SNP的 鉴定 –SNP检测与临床表现的相关性，如抗高血压药物疗效 的个体差异 –药物副反应的预防，如麻醉意外 •物种鉴定、菌株鉴定–各种病毒，细菌，病毒–病原体检 测，如炭疽菌，E coli. O157