基于免疫分选的T淋巴细胞亚群嵌合性定量分析

[基金项目] 浙江省医卫科研基金和省医卫青年人才基金(2008A036和2008QN008)
[作者简介] 许先国(1971-),男,硕士,副主任技师,主要从事输血医学研究工作。

实验研究
基于免疫分选的T淋巴细胞亚群嵌合性定量分析
许先国,章伟,陈舒,朱发明,吕杭军,严力行
(浙江省血液中心输血研究所,卫生部血液安全研究重点实验室,杭州 310006)
[摘要] 目的:建立基于免疫分选的T淋巴细胞亚群嵌合性定量分析的方法。

方法:以淋巴细胞不同比例混合制备14组人工嵌合体血样,以免疫磁珠阳性选择法获取CD4+和CD8+T细胞亚群,分选后的细胞再进行16位点的短串重复序列(STR)多态性分析。

结果:分选后T细胞亚群提取的DNA量能满足S TR检测要求,当嵌合体中受体比例 10%时,16个STR位点均能检出受体和供体特异性等位基因,按照S TR峰面积计算的受体比例与理论值相符;当受体比例 1%时,仅有部分位点能检出受体特异性等位基因,实测嵌合率与理论值存在差异。

结论:建立了基于免疫分选的T细胞亚群嵌合性定量分析方法,可用于造血干细胞移植术后嵌合体监测。

[关键词] 嵌合体;免疫分选;造血干细胞移植
[中图分类号] R733.7 [文献标识码] A [文章编号] 1004-8685(2011)01-0101-03 Quantitative chi m eris m analysis of T ly mphocyte subsets based on i m m une sorting
X U X ian-Guo,Z H AN G W ei,C H EN Su,Z H U Fa-M ing,LV H ang-jun,YAN L i-X ing
(B l ood Center of Zheji ang P rov i nce;K ey L abo ra t o ry o f B l ood Sa fety R esearch,MOH,H angzhou310006,China)
[Ab stract] O bjective:To establis h a quantitative m ethod for ch i m e ris m ana l y si s o f T ly m phocy te s ubsets based on i m m une sor ti ng.M ethod s:14artific i a l ch i m era g roups w ere m ixed acco rding to d ifferent ly m phocy tes proportion.T he CD4+and CD8+T ce ll subsets w ere sorted by positive se l ection of i m m uno m agne ti c beads,and then were ana l y zed by S TR poly m orph i s m s tech n i que.Resu lts:The DNA s extrac ted fro m so rted T ce lls we re fit f o r S TR de tecti on.A ll S TR a lleles spec ific for recipient or dono r can be detec ted and t he quantitative resu lts w ere cons i sten tw it h theoreti c va l ues i n over10%rec i p i ent ch i m eras.But only partial rec i p i ent a ll e l es can be detec ted and the quan tita ti ve results w ere d iffe rent from t heoretic va l ues i n less t hen1%rec i p i ent chi m e ras.Conc l usion:A quantitative ch i m eris m ana l ys i s o f T ce ll subsets based on i m m une sorting w as estab lished.T he m ethod can be used t o m onitor i ng of he m atopo ietic ch i m eris m fo llo w i ng hema topo i e ti c ste m ce ll transplan tati on.
[K ey words] Chi m era;I mm une sorti ng;H e m atopoietic ste m ce ll transplanta ti on
异基因造血干细胞移植(all o-HSCT)是治疗白血病等血液系统疾病的重要手段,移植后长期存活的最大障碍是移植物抗宿主病(GVHD)和移植物抗白血病效应(GVL)降低导致的疾病复发,并成为移植相关死亡的主要原因[1]。

GVHD和GVL的发生机制均与移植物中的供者淋巴细胞相关,特别是供者T淋巴细胞亚群在患者体内的消长对二者均具有重要作用。

所以对all o-HSCT术后患者进行供者和受者淋巴细胞监测,特别是淋巴细胞亚群定量监测,对患者术后的个性化药物使用、辅助治疗(如供者淋巴细胞再输注)、GVHD的预防等具有重要意义。

本文将免疫磁珠的T细胞亚群分选技术和短串重复序列(STR)的嵌合性定量技术进行偶联,建立了一种基于免疫分选的T淋巴细胞亚群嵌合性定量分析方法,可用于临床all o-HSCT术后的供受体特异性T细胞亚群监测。

1 材料与方法
1.1 研究对象
取2个随机全血样本,选定1个样本为供体,1个样本为受体,并分别计数淋巴细胞(C ell-DYN1700,美国A bbo tt公司),按淋巴细胞不同比例进行两两混合,作为人工嵌合体样本。

1.2 T c/T s和Th/T i亚群分选
以阳性选择法(CD8positi ve iso l a tion kit,挪威D yna l公司)从嵌合样本中分选CD8+T c/T s细胞亚群,将1m l嵌合体血样和25 l含CD8抗体的磁珠混合反应20m i n。

将混合液置磁架上2m i n,洗涤弃上清。

加入针对CD8抗体F ab端的二抗10 l中和磁珠上的CD8抗体,释放磁珠捕获的CD8+细胞亚群。

CD4+T h/T i细胞亚群分选步骤类似。

1.3 STR位点基因扫描分析
参照本实验室建立的方法[2],以Chelex法提取分选后靶细胞的gDNA,以Identifil e r PCR Am plifi cation K it(美国A BI公司)试剂对16个S TR位点进行长度多态性分析。

1.4 方法的准确性和灵敏度验证
采用14组人工嵌合样本(受体比例分别为0、0.01%、
0.1%、1%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%),进行方法的灵敏度和准确性验证。

以各位点峰面积计算嵌合体样本中供体和受体的百分比例(x s),以总体均数t检验法比较实测值与理论值之间的差异。

2 结果
2.1 DNA提取质量
免疫分选后的靶细胞经Chelex法提取,DNA浓度为5ng/ l~15ng/ ,l纯度A
206/280
=1.0~1.5,能满足STR分析要求。

2.2 受体检出灵敏度分析
14组不同比例受体的人工嵌合样本分别经CD4+、CD8+细胞分选和STR检测,各STR位点的峰面积消长趋势与预期相符合(图1:以CD4+分选后的D8S1179位点的14组人工嵌合样本为例)。

结果显示,当受体比例 10%时,16个STR位点均能检测出受体特异性峰;当受体比例 1%时,16个STR 位点中仅有部分位点能检出受体特异性峰,而有些位点未能检出受体特异性峰(如图1的D8S1179位点在1%时未能检出),表明本方法的检出灵敏度在1%左右。

2.3 不同嵌合体样本的准确性分析
分别将14组不同比例受体样本的理论值和实测值
进行
图1 14个不同系列的人工嵌合体样本经CD4+细胞分选后的
S TR检测(以D8S1179位点为例,框中上排数字为等位基因特
异性,下排数字为峰面积)
比较,发现当受体比例 10%时,实测值和理论值之间的差别无统计学意义(P值均>0.05);当受体比例=1%时,实测值和理论值之间的差别有统计学意义(P<0.05),表明本方法的实际灵敏度介于1%~10%之间,CD4+和CD8+细胞分选结果类似(表1)。

对不同比例受体样本的理论值和实测值进行线性回归(图2),得到CD4+和CD8+分选组的回归方程分别为y =0.9785x+0.0134和y=0.9775x+0.0180。

表1 14组不同比例嵌合体的受体比例理论值和实测值比较
理论值00.00010.0010.010.100.200.300.400.500.600.700.800.901.0
CD4+
分选实测值x s未检出未检出未检出0.0203 0.0260.111 0.0300.213 0.0590.317 0.0580.383 0.0570.485 0.0400.620 0.0500.701 0.0570.794 0.0520.887 0.0411.0 0.0 t///2.0001.4300.888 1.1461.1771.460 1.5470.07160.421 1.247/ P///<0.05>0.05>0.05>0.05>0.05>0.05>0.05>0.05>0.05>0.05/
CD8+
分选实测值x s未检出未检出未检出0.0235 0.0250.121 0.0850.218 0.0630.306 0.0450.415 0.0720.515 0.0530.586 0.0610.693 0.0320.813 0.0660.894 0.0361.0 0.0 t///2.0580.957 1.1070.5160.8071.0960.8890.08470.7630.645/ P///<0.05>0.05>0.05>0.05>0.05>0.05>0.05>0.05>0.05>0.05
/
图2 不同比例受体样本的理论值和实测值线性回归
3 讨论
白血病复发和GVHD成为移植相关死亡的主要原因,所
以移植术后的供/受体特异性基因的定量监测,成为防止白血
病复发和GVHD的重要手段[1]。

目前临床上对白血病监测的
方法主要有流式细胞术[3]、肿瘤特异性标志基因检测[4]、非肿
瘤特异性个体识别基因(如STR)检测[5]、基因序列探针[6]等
方法。

本实验利用免疫磁珠分选的高特异性和S TR检测的高灵
敏度,建立了CD4+T h/T i亚群和CD8+T c/T s亚群嵌合性定
量分析方法。

实验表明,虽然分选后细胞提取的DNA浓度
(仅为5ng/ l~15ng/ l)和纯度(A
206/280
=1.0~1.5)较低,
可能不适合于普通的PCR和凝胶电泳检测,但已能完全符合
S TR检测的荧光PCR和毛细管电泳的要求(DNA总量仅要求
为1.0ng~2.5ng),保证了免疫分选和STR两种方法偶联的
可行性。

通过对分选后S TR检出灵敏度的分析,发现本方法
能检出1%以上的受体嵌合率;对于1%以下的样本,由于特异
性峰的高度已经与荧光噪音接近而无法检出(图1)。

但是进
一步对不同嵌合率的实测值和理论值比较,发现只有10%以
上嵌合率时方法的准确性较高,而1%嵌合率时实测值明显高
于理论值,表明本方法真实的检测灵敏度在1%~10%之间。

从CD4+分选组的回归方程y=0.9785x+0.0134也可以看出,
当理论嵌合率x=0,实测值y=0.0134,相当于荧光信号的本
底误差在1%~2%之间,CD8+分选组的情况类似。

所以对于
受体嵌合率较低的样本,如术后复发的早期样本,本方法的准
确性不高,这主要是受S TR本身方法学的限制。

本实验仅对CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群进行嵌合性分
析,由于S TR检测所需的DNA量极低,如果选择更多的免疫
磁珠(如CD4和CD25)进行联合分选,可对T reg调节性T细
胞等进行嵌合性定量分析,再结合患者临床信息(如白血病复
发、急慢性GVHD的发生等)分析,可以更好地理解各类免疫
(下转第105页)
3 讨论
慢性湿疹属于 型迟发型变态反应,斑贴试验根据迟发型变态反应的原理,主要用于检测外源性接触变应原,在皮肤科临床工作中,患者如能提供明确的致病原因或诱因,对疾病的诊断和治疗都能提供很大的帮助,但多数患者不能在病史中提供明确的致敏原,以致持续接触致敏原而致湿疹迁延难愈,因此斑贴试验作为一项安全、有效的查找外源性致敏源的检测方法[4]在慢性湿疹的诊断及防治中具有重要意义。

本组研究中835例慢性湿疹患者斑贴试验的阳性率高达85.39%,与付兰芹等[5]报告的相近,而在性别和年龄上的分布并无显著差异,提示慢性湿疹患者斑试阳性率与年龄及性别无明显相关性;皮损局限型患者的斑试阳性率虽高于泛发型者,但无统计学意义,这是否与病例的选择、地区的差异有关,有待进一步深入研究。

局限型湿疹手足部、头面部的斑试总阳性率虽高于躯干部,但无统计学意义。

而女性组间阳性率比较差别有统计学意义(P<0.05),考虑女性从事家务劳动接触洗涤用品的几率高于男性有关。

20种筛查变应原中阳性率居前5位的依次为:重铬酸钾、硫酸镍、卡巴混合物、甲醛和芳香混合物,与国内外相关报道基本一致[6~9],其中重铬酸钾的阳性率最高,且无明显性别差异,由于重铬酸钾常存在于水泥粉尘、衣物染料、地板蜡、鞋油、油漆、电镀、眼影膏、清洁剂、漂白剂、消毒剂等日常生活经常接触的物质中,因此较其他变应原在慢性湿疹中具备更高的性。

男性病例中,卡巴混合物的阳性率明显高于女性(P< 0.01),卡巴混合物主要存在于天然橡胶制品(轮胎把手、汽配修理、乳胶手套、化纤衣物)中,可能与男性从事的职业接触的机会多于女性有关;而女性病例中,芳香混合物的阳性率明显高于男性(P<0.05),芳香混和物主要以香料添加剂形式广泛存在于护肤品、洗发沐浴液、香皂牙膏,空气消毒剂、医药制剂及各种香甜食品中,与日常生活关系密切,易引起面部、手部湿疹,这可能与女性更多地使用化妆品、洗涤用品有关。

甲醛是化工行业常用的原料,广泛地应用于服装业(整烫印染干洗)、印刷造纸业、化妆品(除臭防汗消毒剂)、医药业(消毒防腐剂)及家居装修材料(油漆家具地板)、皮塑制革业(上光打蜡),许多材料多年之后仍可释放出甲醛,因此对暴露部位的湿疹影响尤为明显。

镍是一种合金成分或在许多金属制品中以杂质的形成存在,许多日用品和工农业用品中均含有镍,生活中常接触有颜料,各种合金(金属饰品、不锈钢餐具)、化肥、洗涤剂、彩色印油、染发剂、矿物油等。

耳部手部湿疹可能与手机金属外壳有关,而脐周的慢性湿疹与金属皮带扣和纽扣密切相关,体内植入不锈钢等含镍的材料或食入富含镍的食物(鱼、牡蛎、洋葱、蘑菇、巧克力、坚果、豆类等),可能诱发系统性接触性皮炎或使湿疹加重泛发。

随着经济的发展和科学的进步,日常生活中患者无法认知的化学添加剂越来越多,多种致敏原同时引起慢性湿疹的可能性也随之增加。

本组资料显示,有41.55%的病例存在3种及3种以上的多种变应原阳性反应,这可能与多种变应原交叉致敏作用相关,使患者难以脱离生活中的致敏原,给湿疹的预防和治疗增加了困难[10]。

男性兼患多种变应原的阳性率明显高于女性,可能与男性更多的化学品职业暴露有关。

自然界中已知的接触致敏原多达数千种,斑贴筛查试验无法对所有变应原进行检测,在病因诊断上仍有局限性。

因此,在评估难治性湿疹预后时应结合患者病史,仔细询问患者日常接触到的可疑物质,并同时进行可疑物的斑贴试验排查,以便早期诊断早期预防早期治疗,从而对疾病的防治及生活质量的提高起到积极的作用。

[参考文献]
[1]赵辨.临床皮肤性病学[M].第3版.南京:江苏科技出版社,
2006:604-606.
[2]孙传兴.临床疾病诊断依据治愈好转标准[M].北京:人民军医出
版社,1998:245.
[3]W ah l beng J E.D i agnositic pat ch tes t[A].Rycroft RGJ.Test book of
con tact d er m atitis[M].B erli n:S pri nger-V erlag,1992:241-265.
[4]秦鸥,王学民.诊断性斑贴试验的临床应用[J].临床皮肤科杂志,
2007,36(12):800-802.
[5]付兰芹,谢文红,余梦清,等.530例皮炎湿疹类皮肤病斑贴试验结
果分析[J].中国预防医学杂志,2006,7(5):412-414.
[6]张桂英,川怡新,文海泉,等.长沙地区188例湿疹及接触性皮炎患
者斑贴试验结果分析[J].临床皮肤科杂志,2002,31(6):357. [7]W ongp i yabovorn J,Puvaband itsi n P.R es u lt of standard patch test i n
pa tients SUS l~et ed of hav i ng allerg i c con tact der m atitis[J].J M ed Ass0c l ha,i2005,88(Supp l4):S177-183.
[8]吴蓓玲,孙洁,余土根,等.2399例过敏性皮肤病斑贴试验结果分
析及临床意义[J].中国卫生检验杂志,2009,19(11):2595-2597.
[9]吴蓓玲,孙洁,余土根,等.杭州地区870例过敏性皮肤病的变应原
调查[J].中华皮肤科杂志,2009,42(11):781-782.
[10]朱国兴,陆春,赖维,等.慢性湿疹和皮炎122例斑贴试验结果分
析[J].临床皮肤科杂志,2006,35(2):81-83.
(收稿日期:2010-09-29)
(上接第102页)
细胞与疾病进展的相关性,进一步指导临床的个性化预防和治疗。

[参考文献]
[1]Balon J,H al abu rda K,B i en i asze w s ka M,et al.Earl y co mp lete donor
he m atopoieti c ch i m eris m i n p eri pheral b l ood i nd i cates the ri sk of exten s i ve graft-versus-host d i sease[J].Bone M arro w Transplant,2005, 35(11):1083-1088.
[2]何吉,许先国,傅启华,等.浙江畲族和汉族人群六个短串联重
复序列位点遗传多态性的研究[J].中华医学遗传学杂志,2003, 20(3):250-252.
[3]徐翀,赵惠君,吴政宏,等.流式细胞术检测儿童B细胞急性淋
巴细胞白血病微小残留病[J].中华血液学杂志,2003,24(6): 295-299.
[4]许兰平,刘开彦,黄晓军,等.慢性粒细胞白血病异基因造血干
细胞移植后bcr-ab l动态监测对低复发患者筛选的意义[J].中华血液学杂志,2008,29(8):522-525.
[5]H u is m an C,de W eger R A,d e V ries L,et al.C h i m eris m anal ys i s
w i th i n6m on t hs of allogeneic ste m cell transp l an tati on p red i cts relapse
i n ac u te myel o i d leuke m i a[J].BoneM arrow T ran s p,l2007,39(5),
285-291.
[6]李倩,杜兵,杨军军,等.应用序列探针检测慢性淋巴细胞白血病
基因异常[J].中国卫生检验杂志,2007,17(4):672-674.
(收稿日期:2010-11-04)。