07章 生物制药工艺学 凝胶层析
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55
凝胶柱床大小与所需凝胶量的关系
56
（二）凝胶柱的装填
凝胶柱底部支持物，有棉花、玻璃纤 维、玻璃珠、垂熔玻璃等。 空柱中应留约1/5的水或溶剂. 不断搅拌下使胶粒均匀沉降，使不发 生凝胶分层和胶面倾斜。
57
（三）凝胶床的检查和维护
观察有无凝胶分层、沟流和气泡等现象。
有色物质溶液过柱，观察柱床有无沟流， 色带是否平整。 检查物质为蓝色葡聚糖。
42
五、多孔玻璃微球(Bio-glas)
特点：1、化学稳定性高、强度大。 2、对糖类、蛋白质等物质有吸附作用。 3、编号表示其孔径 , 越大，分离分子量也越大。
43
六、疏水性凝胶（hydrophobic gels）
聚甲基丙烯酸酯凝胶和聚苯乙烯凝胶。 Styragel商品, 分离范围为1 600～40 000 000。 生物珠（Bio-Bead S），适于分离分子量较小的 物质。 分离不溶水的有机物质。
（ 一 ） 亲 脂 性 葡 聚 糖 凝 胶 （ Lipophilic Sephadex） 骨架结构上引入一些有机基团，如甲基、羟 丙基，使呈亲脂性，同时保留亲水性。
（二）交联葡聚糖离子交换剂（ Sephadex –ion-exchanger） 将活性交换基团连接于葡聚糖凝胶上制成的 各种交换剂。
（1）使大分子的分配系数Kd=0； （2）小分子的Kd=1。
50
2．分级分离
（1）使各种物质的Kd值尽可能 相差大。 （2）不使它们分子量分布在凝胶 分离范围的一侧。 （3）分子量大于渗入限的3倍， 并小于排阻限的1/3。
如用Sephadex G-200分离血清 蛋白质的效果要比Sephadex G150为好。
20
一、葡聚糖凝胶 (Sephadex)
商品名为Sephadex G类 . 交联葡聚糖的基本骨架是葡 聚糖。 再经3-氯-1，2-环氧丙烷为 交联剂，形成三维网状结构 的高分子化合物。 其交联度是通过交联剂的加 量及反应条件来控制的。
21
Sephadex G
编号间接反映： 1、吸液量； 2、溶涨时间； 3、凝胶孔径； 4、分离范围
36
琼脂糖凝胶分离范围
琼脂糖凝胶有3个规格：Sepharose2B、4B、6B分 别表示琼脂糖浓度为2%，4%，6%。
37
几种蛋白质Kav值
38
（二）架桥琼脂糖凝胶（Sepharose CL）
架桥琼脂糖凝胶为琼 脂线性分子经 1 ， 3- 二 溴丙醇交联的凝胶。
凝胶孔径均匀，机械 强度明显加大。 对热和化学物质的稳 定性大大增加,在 pH3~14范围内稳定。
1
洗脱曲线
2
第一节 凝胶层析原理
凝胶层析的分离过程是在装有多 孔物质填料的柱中进行的。 柱的总体积为 Vt ，它包括填料的 骨架体积Vg，填料的孔体积 Vi(内 水体积)以及填料颗粒之间的体积 V0（外水体积）。 Vt= Vi +V0+Vg
3
4
一、原理
当具有一定分子量分布的高聚 物溶液从柱中通过时，较小的 分子在柱中停留时间比大分子 停留的时间要长，样品各组分 即按分子大小顺序而分开，最 先淋出的是最大的分子。 Ve=V0+Vi Kd flash
22
葡聚糖凝胶性能与编号的关系
编号 交联 吸液量 度 膨胀 速度 凝胶 孔径 分离限 凝胶 强度
大 （ Sephadex G－150 ）
小 （ Sephadex G－ 50 ）
小
大
慢
大
大
小
大
小
快
小
小Leabharlann 大23葡聚糖凝胶（G类）的规格
24
思考题
用葡聚糖凝胶分 离蛋白质与多糖 时，其分离范围 不同，为什么？
方法
（1）直接将样品加到层析床表面。 （2）样品比重高。
62
（二）洗脱与收集
1、洗脱剂。 2 、流速（操作压、型号、 粒度）。 3、分部收集器。
63
（三）凝胶柱的再生
反冲 重新装柱
64
四、主要参数测算
V0及Vi的测算 Kd及Kav的值 分辨率R
65
（一）V0及Vi的测算
17
四、凝胶层析的特点
（1）凝胶层析操作简便，所需设备 简单。 （2）分离效果较好，重复性高。 （3）分离条件缓和。 （4）应用广泛（除盐，分子量测定， 分离纯化）。 （5）分离操作较慢。流速
18
19
第二节 凝胶的结构和性质
一、葡聚糖凝胶 (Sephadex) 二、修饰葡聚糖凝胶 (Modified Sephadex) 三、聚丙烯酰胺凝胶 （Bio-Gel P） 四、琼脂糖类凝胶 （Sepharose ） 五、多孔玻璃微球 (Bio-glas) 六、疏水性凝胶（hydrophobic gels）
5
二、凝胶层析的几种理论
（一）平衡排除理论 （二）扩散分离理论 （三）流动分离理论
6
（一）平衡排除理论
当溶质层流过一个填料颗粒这段距离时， 溶质分子已多次进出于填料的孔，达到 平衡。 平衡条件是在流速很慢时的一个极端情 况。
7
（二）扩散分离理论
溶质分子在流经凝胶柱的 过程中，在流动相和固定 相之间没有达到平衡，存 在着流速依赖性。
58
操作压
层析柱由于进出口之 间液位压力差形成的 对凝胶颗粒的压力称 作“操作压”。
59
层析床横截面所允许的最大压力
60
三、凝胶层析操作
（一）样品和加样 蛋白质类样品浓度 : 不大 于4%。
加样时应尽量减少样品的 稀释，及凝胶床面的搅动。
样品粘度对洗脱曲线的影响 柱：交联葡聚糖G-25，4×85cm； 流速180ml/h； 样品：0.1%血红蛋白+1.0%氯化钠； （1）相对粘度为0.118； （2）相对粘度为0.042； （3）相对粘度为0.010 61
干胶以10倍以上吸液量的溶剂浸泡。 热法溶涨(水浴)。
54
二、凝胶层析柱的设计和制备
（一）层析柱的选择 层析柱长度与直径的比值称作“柱 比”。
对于类分离，柱床体积一般为样品 溶液体积的5倍，柱比5到10。 对于分级分离，柱床体积大于样品 体积 25 倍以上，甚至多达 100 倍。 柱比在25至100之间。
51
分级分离
A 血清蛋白 7万 G 免疫球蛋白 17万 M 脂蛋白 200万
52
（二）凝胶粒度的选择
细粒凝胶柱流速低，洗 脱峰窄，分辨率高，用 于精制分离或分析。
粗粒凝胶柱流速高，洗 脱峰平坦，分辨率低， 用于粗制分离，脱盐。
53
（三）凝胶的预处理
使用前须溶涨，使干胶颗粒充分吸收溶剂， 并达到平衡。
28
交联葡聚糖离子交换剂
29
（三）Supperdex系凝胶 由高交联度多孔琼脂糖与葡聚糖共价结合 而成。 （四）Sephacryl系凝胶 是由烯丙烷基葡聚糖经甲叉双丙烯酰胺共 价交联制成的。 理化稳定性好，为硬性凝胶，可耐高压灭 30 菌。
Supperdex系凝胶
31
25
葡聚糖凝胶（G类）特点
1、孔径。 2、稳定性。 3、吸附作用。 4、芳香族化合物和杂环化合物。
26
保存
保存的方法有干法、湿法和半缩法三种。
湿法：加入一定量的防腐剂臵于冰箱中作 短期保存（6个月以内）。 常用0.02%叠氮化钠、0.02%三氯叔丁醇、 20%乙醇等。
27
二、修饰葡聚糖凝胶 (Modified Sephadex)
34
四、琼脂糖类凝胶 （Sepharose ）
（一）琼脂糖凝胶
结构是由 β-D-半乳糖与3， 6-脱水-L-半乳糖以 α1，3-和β-1，4-糖苷键相间连接而成的链状分子。
35
琼脂糖凝胶特点
1、没有共价键的交联。 2、孔径 琼脂糖的浓度。 3、琼脂糖凝胶的化学稳定性较差。 4、非特异性吸附力低。 5、颗粒强度差。 6、分离范围大。
48
一、凝胶的选择和处理
（一）凝胶的选择—凝胶性质、分离目的
(1).将分子量极为悬殊的两类物质分开，如 蛋白质与盐类，称作类分离或组分离。
(2).将分子量相差不大的大分子物质加以分 离，如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做 49 分级分离。
1．类分离
选用Sephadex G-25凝胶，分离范围 1 000～5 000。
Sephacryl系凝胶
32
三、聚丙烯酰胺凝胶
商品名为生物凝胶-P（Bio-Gel P）。 该凝胶由丙烯酰胺组成；以亚 甲基双丙烯酰胺为交联剂，聚 合而成。 特点： 1、孔径； 2、稳定性、强度； 3、无非特异吸附，保存方便； 4、编号反映出它的分离界限。
33
聚丙烯酰胺凝胶的性质
生物凝胶的编号反映出它的分离界限。 如Bio-Gel P-100。
39
Sepharose CL的性质
40
（三）超胶（Utro-gel ACA）
超胶是琼脂糖与聚丙烯酰胺的混合凝胶。 商品名称后面的编号为两位数，各表示混 合胶中聚丙烯酰胺与琼脂糖的百分浓度。
41
（四） Superose系凝胶
是由 珠状 琼 脂糖 经 两次 交 联制得的可用于 HPLC的高速凝胶过滤介质。 有6%和12%两个规格。
聚苯乙烯和苯乙烯样品淋出曲线 的流速依赖性 1．流速为0.65ml/min； 2．流速为2.0ml/min
8
（三）流动分离理论
红细胞在毛细管中流动时比 血浆流得快.
较大的分子较先通过或绕过 这个填料颗粒，使溶质能按 其大小进行分离。
9
分离过程
三种不同分子量物 质的混合样品用某 种规格的凝胶柱进 行分离。 样品加入，以水或 其他溶液进行洗脱， 即得洗脱曲线 。
11
三、分配系数Kd
排阻系数：
当Kd=1时，洗脱体积Ve=V0+Vi，为全渗入。 当Kd=0时，洗脱体积Ve=V0，为全排阻。 0 ＜ Kd ＜ 1 时，洗脱体积 Ve=Vo+KdVi ，为部分渗 入。
12
物质的Kd值
13
Kav 有效分配系数
14
过柱法测定V0及Vi
Ve=Vo+KdVi
44
常用的商品化凝胶介质
45
一
46
第七章 凝胶层析
第一节 第二节 第三节 第四节 第五节
凝胶层析的基本原理 凝胶的结构和性质 凝胶层析的实验条件和操作 色谱峰变宽的问题 凝胶层析的应用
47
第三节 凝胶层析的实验条件和操作
一、凝胶的选择和处理 二、凝胶层析柱的设计和制备 三、凝胶层析操作 四、主要参数测算
66
（二）分配系数测定
分配系数
当测得某物质的 Ve 及 Vt ，内水体积 Vi 及 外水体积V0时，算出Kd及Kav的值。
Kd及Kav Ve被认为是一种组分对于某一个 凝胶柱的特征常数。
67
（三）分辨率
第七章 凝胶层析 (Gel chromatography)
分子筛层析 (molecular sieve chromatography) 凝胶过滤 (Gel filtration) 排阻层析 (exclusion chromatography)
将样品混合物通过一定孔径的凝胶固定相， 由于各组分流经体积的差异，使不同分子量 的组分得以分离的层析方法。
如用全排阻（ Kd=0 ）或全渗入（ Kd=1 ）的物 质过柱，测量其洗脱体积，计算该凝胶柱的 V0 值及Vi值。
蓝色葡聚糖（Kd=0） 重铬酸钾（Kd=1）
15
分配系数测定
Kd
16
思考题
已知两种蛋白在Sephadex G-100上的Kd (如血清白蛋白Kd为0.2，细胞色素C为0.7)， 通过Kd 的大小我们能得到哪些信息？
1．重量法 Vt=Vo+Vi+Vg =π /4· d2h Vi=g· Wr Vo=Vt－（Vi+Vg） Vg估算为1cm3/g干胶。 2．过柱法 已知物质的洗脱体积 Ve=Vo+KdVi 如用全渗入（Kd=1）或全排阻（Kd=0）的物质过柱， 测量其洗脱体积，计算该凝胶柱的V0值及Vi值。 常用蓝色葡聚糖（Kd=0）及重铬酸钾（Kd=1）。
10
分离过程
最先流出物质 A ， A 分子量最大，只 能从颗粒间隙流过， “全排阻”。 其流经体积最小，等于外水体积 V0 。 最后流出物质 C ，它分子量最小， “全渗入”。流经体积是外水体积与 内水体积之和V0+Vi。 物质B分子量介于渗入限与排阻限之 间。 “部分排阻”或“部分渗入”。 流经体积 Ve 是全部外水体积加上内 水体积的一部分，即Ve=V0+KdVi
凝胶柱床大小与所需凝胶量的关系
56
（二）凝胶柱的装填
凝胶柱底部支持物，有棉花、玻璃纤 维、玻璃珠、垂熔玻璃等。 空柱中应留约1/5的水或溶剂. 不断搅拌下使胶粒均匀沉降，使不发 生凝胶分层和胶面倾斜。
57
（三）凝胶床的检查和维护
观察有无凝胶分层、沟流和气泡等现象。
有色物质溶液过柱，观察柱床有无沟流， 色带是否平整。 检查物质为蓝色葡聚糖。
42
五、多孔玻璃微球(Bio-glas)
特点：1、化学稳定性高、强度大。 2、对糖类、蛋白质等物质有吸附作用。 3、编号表示其孔径 , 越大，分离分子量也越大。
43
六、疏水性凝胶（hydrophobic gels）
聚甲基丙烯酸酯凝胶和聚苯乙烯凝胶。 Styragel商品, 分离范围为1 600～40 000 000。 生物珠（Bio-Bead S），适于分离分子量较小的 物质。 分离不溶水的有机物质。
（ 一 ） 亲 脂 性 葡 聚 糖 凝 胶 （ Lipophilic Sephadex） 骨架结构上引入一些有机基团，如甲基、羟 丙基，使呈亲脂性，同时保留亲水性。
（二）交联葡聚糖离子交换剂（ Sephadex –ion-exchanger） 将活性交换基团连接于葡聚糖凝胶上制成的 各种交换剂。
（1）使大分子的分配系数Kd=0； （2）小分子的Kd=1。
50
2．分级分离
（1）使各种物质的Kd值尽可能 相差大。 （2）不使它们分子量分布在凝胶 分离范围的一侧。 （3）分子量大于渗入限的3倍， 并小于排阻限的1/3。
如用Sephadex G-200分离血清 蛋白质的效果要比Sephadex G150为好。
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一、葡聚糖凝胶 (Sephadex)
商品名为Sephadex G类 . 交联葡聚糖的基本骨架是葡 聚糖。 再经3-氯-1，2-环氧丙烷为 交联剂，形成三维网状结构 的高分子化合物。 其交联度是通过交联剂的加 量及反应条件来控制的。
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Sephadex G
编号间接反映： 1、吸液量； 2、溶涨时间； 3、凝胶孔径； 4、分离范围
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琼脂糖凝胶分离范围
琼脂糖凝胶有3个规格：Sepharose2B、4B、6B分 别表示琼脂糖浓度为2%，4%，6%。
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几种蛋白质Kav值
38
（二）架桥琼脂糖凝胶（Sepharose CL）
架桥琼脂糖凝胶为琼 脂线性分子经 1 ， 3- 二 溴丙醇交联的凝胶。
凝胶孔径均匀，机械 强度明显加大。 对热和化学物质的稳 定性大大增加,在 pH3~14范围内稳定。
1
洗脱曲线
2
第一节 凝胶层析原理
凝胶层析的分离过程是在装有多 孔物质填料的柱中进行的。 柱的总体积为 Vt ，它包括填料的 骨架体积Vg，填料的孔体积 Vi(内 水体积)以及填料颗粒之间的体积 V0（外水体积）。 Vt= Vi +V0+Vg
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一、原理
当具有一定分子量分布的高聚 物溶液从柱中通过时，较小的 分子在柱中停留时间比大分子 停留的时间要长，样品各组分 即按分子大小顺序而分开，最 先淋出的是最大的分子。 Ve=V0+Vi Kd flash
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葡聚糖凝胶性能与编号的关系
编号 交联 吸液量 度 膨胀 速度 凝胶 孔径 分离限 凝胶 强度
大 （ Sephadex G－150 ）
小 （ Sephadex G－ 50 ）
小
大
慢
大
大
小
大
小
快
小
小Leabharlann 大23葡聚糖凝胶（G类）的规格
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思考题
用葡聚糖凝胶分 离蛋白质与多糖 时，其分离范围 不同，为什么？
方法
（1）直接将样品加到层析床表面。 （2）样品比重高。
62
（二）洗脱与收集
1、洗脱剂。 2 、流速（操作压、型号、 粒度）。 3、分部收集器。
63
（三）凝胶柱的再生
反冲 重新装柱
64
四、主要参数测算
V0及Vi的测算 Kd及Kav的值 分辨率R
65
（一）V0及Vi的测算
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四、凝胶层析的特点
（1）凝胶层析操作简便，所需设备 简单。 （2）分离效果较好，重复性高。 （3）分离条件缓和。 （4）应用广泛（除盐，分子量测定， 分离纯化）。 （5）分离操作较慢。流速
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第二节 凝胶的结构和性质
一、葡聚糖凝胶 (Sephadex) 二、修饰葡聚糖凝胶 (Modified Sephadex) 三、聚丙烯酰胺凝胶 （Bio-Gel P） 四、琼脂糖类凝胶 （Sepharose ） 五、多孔玻璃微球 (Bio-glas) 六、疏水性凝胶（hydrophobic gels）
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二、凝胶层析的几种理论
（一）平衡排除理论 （二）扩散分离理论 （三）流动分离理论
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（一）平衡排除理论
当溶质层流过一个填料颗粒这段距离时， 溶质分子已多次进出于填料的孔，达到 平衡。 平衡条件是在流速很慢时的一个极端情 况。
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（二）扩散分离理论
溶质分子在流经凝胶柱的 过程中，在流动相和固定 相之间没有达到平衡，存 在着流速依赖性。
58
操作压
层析柱由于进出口之 间液位压力差形成的 对凝胶颗粒的压力称 作“操作压”。
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层析床横截面所允许的最大压力
60
三、凝胶层析操作
（一）样品和加样 蛋白质类样品浓度 : 不大 于4%。
加样时应尽量减少样品的 稀释，及凝胶床面的搅动。
样品粘度对洗脱曲线的影响 柱：交联葡聚糖G-25，4×85cm； 流速180ml/h； 样品：0.1%血红蛋白+1.0%氯化钠； （1）相对粘度为0.118； （2）相对粘度为0.042； （3）相对粘度为0.010 61
干胶以10倍以上吸液量的溶剂浸泡。 热法溶涨(水浴)。
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二、凝胶层析柱的设计和制备
（一）层析柱的选择 层析柱长度与直径的比值称作“柱 比”。
对于类分离，柱床体积一般为样品 溶液体积的5倍，柱比5到10。 对于分级分离，柱床体积大于样品 体积 25 倍以上，甚至多达 100 倍。 柱比在25至100之间。
51
分级分离
A 血清蛋白 7万 G 免疫球蛋白 17万 M 脂蛋白 200万
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（二）凝胶粒度的选择
细粒凝胶柱流速低，洗 脱峰窄，分辨率高，用 于精制分离或分析。
粗粒凝胶柱流速高，洗 脱峰平坦，分辨率低， 用于粗制分离，脱盐。
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（三）凝胶的预处理
使用前须溶涨，使干胶颗粒充分吸收溶剂， 并达到平衡。
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交联葡聚糖离子交换剂
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（三）Supperdex系凝胶 由高交联度多孔琼脂糖与葡聚糖共价结合 而成。 （四）Sephacryl系凝胶 是由烯丙烷基葡聚糖经甲叉双丙烯酰胺共 价交联制成的。 理化稳定性好，为硬性凝胶，可耐高压灭 30 菌。
Supperdex系凝胶
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葡聚糖凝胶（G类）特点
1、孔径。 2、稳定性。 3、吸附作用。 4、芳香族化合物和杂环化合物。
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保存
保存的方法有干法、湿法和半缩法三种。
湿法：加入一定量的防腐剂臵于冰箱中作 短期保存（6个月以内）。 常用0.02%叠氮化钠、0.02%三氯叔丁醇、 20%乙醇等。
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二、修饰葡聚糖凝胶 (Modified Sephadex)
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四、琼脂糖类凝胶 （Sepharose ）
（一）琼脂糖凝胶
结构是由 β-D-半乳糖与3， 6-脱水-L-半乳糖以 α1，3-和β-1，4-糖苷键相间连接而成的链状分子。
35
琼脂糖凝胶特点
1、没有共价键的交联。 2、孔径 琼脂糖的浓度。 3、琼脂糖凝胶的化学稳定性较差。 4、非特异性吸附力低。 5、颗粒强度差。 6、分离范围大。
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一、凝胶的选择和处理
（一）凝胶的选择—凝胶性质、分离目的
(1).将分子量极为悬殊的两类物质分开，如 蛋白质与盐类，称作类分离或组分离。
(2).将分子量相差不大的大分子物质加以分 离，如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做 49 分级分离。
1．类分离
选用Sephadex G-25凝胶，分离范围 1 000～5 000。
Sephacryl系凝胶
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三、聚丙烯酰胺凝胶
商品名为生物凝胶-P（Bio-Gel P）。 该凝胶由丙烯酰胺组成；以亚 甲基双丙烯酰胺为交联剂，聚 合而成。 特点： 1、孔径； 2、稳定性、强度； 3、无非特异吸附，保存方便； 4、编号反映出它的分离界限。
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聚丙烯酰胺凝胶的性质
生物凝胶的编号反映出它的分离界限。 如Bio-Gel P-100。
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Sepharose CL的性质
40
（三）超胶（Utro-gel ACA）
超胶是琼脂糖与聚丙烯酰胺的混合凝胶。 商品名称后面的编号为两位数，各表示混 合胶中聚丙烯酰胺与琼脂糖的百分浓度。
41
（四） Superose系凝胶
是由 珠状 琼 脂糖 经 两次 交 联制得的可用于 HPLC的高速凝胶过滤介质。 有6%和12%两个规格。
聚苯乙烯和苯乙烯样品淋出曲线 的流速依赖性 1．流速为0.65ml/min； 2．流速为2.0ml/min
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（三）流动分离理论
红细胞在毛细管中流动时比 血浆流得快.
较大的分子较先通过或绕过 这个填料颗粒，使溶质能按 其大小进行分离。
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分离过程
三种不同分子量物 质的混合样品用某 种规格的凝胶柱进 行分离。 样品加入，以水或 其他溶液进行洗脱， 即得洗脱曲线 。
11
三、分配系数Kd
排阻系数：
当Kd=1时，洗脱体积Ve=V0+Vi，为全渗入。 当Kd=0时，洗脱体积Ve=V0，为全排阻。 0 ＜ Kd ＜ 1 时，洗脱体积 Ve=Vo+KdVi ，为部分渗 入。
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物质的Kd值
13
Kav 有效分配系数
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过柱法测定V0及Vi
Ve=Vo+KdVi
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常用的商品化凝胶介质
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一
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第七章 凝胶层析
第一节 第二节 第三节 第四节 第五节
凝胶层析的基本原理 凝胶的结构和性质 凝胶层析的实验条件和操作 色谱峰变宽的问题 凝胶层析的应用
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第三节 凝胶层析的实验条件和操作
一、凝胶的选择和处理 二、凝胶层析柱的设计和制备 三、凝胶层析操作 四、主要参数测算
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（二）分配系数测定
分配系数
当测得某物质的 Ve 及 Vt ，内水体积 Vi 及 外水体积V0时，算出Kd及Kav的值。
Kd及Kav Ve被认为是一种组分对于某一个 凝胶柱的特征常数。
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（三）分辨率
第七章 凝胶层析 (Gel chromatography)
分子筛层析 (molecular sieve chromatography) 凝胶过滤 (Gel filtration) 排阻层析 (exclusion chromatography)
将样品混合物通过一定孔径的凝胶固定相， 由于各组分流经体积的差异，使不同分子量 的组分得以分离的层析方法。
如用全排阻（ Kd=0 ）或全渗入（ Kd=1 ）的物 质过柱，测量其洗脱体积，计算该凝胶柱的 V0 值及Vi值。
蓝色葡聚糖（Kd=0） 重铬酸钾（Kd=1）
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分配系数测定
Kd
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思考题
已知两种蛋白在Sephadex G-100上的Kd (如血清白蛋白Kd为0.2，细胞色素C为0.7)， 通过Kd 的大小我们能得到哪些信息？
1．重量法 Vt=Vo+Vi+Vg =π /4· d2h Vi=g· Wr Vo=Vt－（Vi+Vg） Vg估算为1cm3/g干胶。 2．过柱法 已知物质的洗脱体积 Ve=Vo+KdVi 如用全渗入（Kd=1）或全排阻（Kd=0）的物质过柱， 测量其洗脱体积，计算该凝胶柱的V0值及Vi值。 常用蓝色葡聚糖（Kd=0）及重铬酸钾（Kd=1）。
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分离过程
最先流出物质 A ， A 分子量最大，只 能从颗粒间隙流过， “全排阻”。 其流经体积最小，等于外水体积 V0 。 最后流出物质 C ，它分子量最小， “全渗入”。流经体积是外水体积与 内水体积之和V0+Vi。 物质B分子量介于渗入限与排阻限之 间。 “部分排阻”或“部分渗入”。 流经体积 Ve 是全部外水体积加上内 水体积的一部分，即Ve=V0+KdVi