霍乱弧菌检验程序
传染病检测SOP工作手册-霍乱弧菌[2]
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霍乱弧菌实验室检测SOP手册1.标本的采集和送检1.1.标本的采集：采集标本的好坏，对检验工作的质量影响很大。
为尽快获得细检查结果，应在发病早期、在服用抗菌药物之前尽快采集标本和及时送到检验室。
标本以病人大便为主。
采便方法用灭菌的棉拭采集排出的新鲜大便，亦可用直肠棉拭或用采便管由肛门插入3㎝～5㎝采集。
一般要求水样便采集1ml～3ml，固形便采取蚕豆大小粪量。
有时病人的呕吐物、沾染大便的衣物和尸体的肠内容物亦可作为检材。
带菌者的大便可用棉拭或直肠棉拭采取。
1.2.标本的送检：采取的标本应立即接种培养基，典型病人的水样便含有大量病菌（106/ml～109/ml），可直接做分离培养并同时增菌培养。
不需做直接分离的均可接种碱性蛋白胨水增菌。
并立即送检验室。
1.3.标本运送途中较远，也可将标本放入文腊氏保存液或卡里—布莱尔运送培养基。
标本与保存液的比例为8ml～10ml保存液加1ml～3ml水样便或蚕豆大的固形便。
也可用厚吸墨纸条吸饱水样便放入小塑料袋内封好送检。
送检标本时，必须认真填写送检单，标本必须妥善包装，专人送检，并防止污染，注意安全，送检箱用后要严密消毒。
2.检验方法2.1.培养方法2.1.1.增菌培养：所有标本都应经过增菌，尤其是恢复期病人、带菌者或用过抗生素的病人标本，需增菌后再分离。
碱胨水接种后放37℃6～8小时，夏日可将运送时间计算在内。
保存液内的标本取1ml种入碱胨水中。
培养后慢慢地从碱胨水生长的菌膜下，取一接种环表层培养物接种于4号或庆大霉素琼脂平板。
标本含菌少时，可实行二次增菌。
取第一次碱胨水增菌后的表层液0.1～0.2ml，接种于另一碱胨水中，37℃6～8小时再做分离。
2.1.2.分离培养：急性典型病人标本在增菌的同时直接做分离培养，这样既可缩短检出的时间，还可避免标本中如有不凝集弧菌经增菌后大量繁殖，影响霍乱弧菌的分离。
其它标本均应增菌后再做分离培养。
当前的习惯多为碱性蛋白胨水增菌，再用强选择性培养基分离，37℃12～16小时长出的菌落，可供做玻片凝集用。
霍乱检测操作规程
霍乱检测操作规程霍乱是一种由霍乱弧菌引起的急性肠道传染病，其症状包括剧烈腹泻、呕吐和腹痛。
霍乱具有高度传染性，因此在进行霍乱检测时需要遵循一定的操作规程，以确保实验室工作人员和社会公众的安全。
下面是一份霍乱检测的操作规程，以供参考。
1. 实验室准备：- 确保实验室设备和试剂的完好和有效性。
- 准备好所需的培养基、试剂和仪器。
- 提前准备好相关实验记录和报告模板。
2. 实验室设备清洁和消毒：- 定期对实验室设备进行清洁和消毒，特别是接触到样本的仪器和工具。
- 使用合适的消毒剂对实验台面、试剂架和实验室周边进行消毒。
3. 样本采集和处理：- 使用适当的个人防护装备，包括手套、口罩和护目镜。
- 选择合适的采样方法，如直肠拭子、粪便样本或病人的呕吐物。
- 将采样好的样本放入严密密封的容器中，避免样本泄漏和污染其他样本。
- 将样本尽快送往实验室进行处理，以确保有效的检测结果。
4. 霍乱检测方法：- 使用合适的实验方法和试剂进行霍乱的检测，如PCR、免疫学检测或培养方法。
- 按照试剂和仪器的说明书进行实验操作，确保准确和可靠的结果。
- 对实验过程中的废液和废物进行正确处理，以防止污染和传播。
5. 结果判读和报告：- 对检测结果进行仔细的观察和判断，根据标准判定结果的阴阳性。
- 将结果记录在实验记录中，并及时生成报告。
- 如有需要，将结果报告给相应的卫生部门和相关人员。
6. 实验室安全和废物处理：- 在实验室操作过程中，严格遵守实验室安全规定，确保操作人员的安全。
- 对实验室产生的废液和废物进行正确的处置和处理，以降低污染和传播的风险。
- 使用合适的方法和设备对操作台面和工具进行清洁和消毒。
7. 实验室记录和质量控制：- 对实验室操作进行详细的记录，包括样本信息、实验步骤和结果等。
- 定期进行质量控制实验，以确保实验的准确性和可靠性。
- 定期进行实验室内部和外部的质量评估，及时发现和纠正实验中的问题。
总结：霍乱检测的操作规程至关重要，它能确保实验室工作人员和社会公众的安全。
[医药卫生]霍乱弧菌实验室检验技术
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三、霍乱弧菌常规检验
样本采集、送检和保存 霍乱的病原学检查 病原分离技术要点
2019/5/21
样本采集、送检和保存
粪便：标本的采集以病人粪便为主，水样便采 取1～3mL，成形便采取指甲大小的粪量，亦 可用直肠棉拭或采便管由肛门插入直肠内3～ 5cm处采取。急性期病人取水样便标本在增菌 培养的同时可取其粘液絮片或用棉拭子直接接 种于碱性琼脂、TCBS琼脂培养基。带菌者粪 便都应接种碱性蛋白胨水培养基，放37℃增菌 6～8h后，从菌膜下表层取一接种环培养物， 划线接种于碱性琼脂、TCBS琼脂培养基。不 能立即检查的，要放入碱性蛋白胨水或文腊二 氏保存液或插入Cary-Blair二氏半固体保存培养 基中。标本与保存液比例约为1∶5。
2019/5/21
两者不同点：
O139群所致病中有44.3%可发生腹部痉 挛，也有引起严重粘液性腹泻的，进入 外周血液可引起发热，出现菌血症或败 血症。印度出现20例病人中有17例发热、 白细胞增多。而O1群引起的病人未曾见 过。
鉴别两者，必须通过血清学诊断来区分。 O22群与O139群血清有交叉汇集反应，必
– 不典型01群霍乱弧菌：可被多价01群血清所 凝集，但该群菌不产生肠毒素，因此无此病 性
2019/5/21
霍乱病原体分类
O1群
古典生物型 埃尔托生物型
小川型 稻叶型 颜岛型
霍乱弧菌
霍乱病原菌
O139群（Bengal） 非O1群
O2-O200群
腹泻病原菌
2019/5/21
O1群和O139群抗原构造与血清分型
须用O22群弧菌吸收，去除交叉汇集现象。
2019/5/21
总之，O139群霍乱弧菌和O1群弧菌二 者生物型既有区别又有联系。最大区别 是荚膜和O1群生物合成基因的有无这些 提示，O139群霍乱弧菌不是O1群EItor生 物型简单的点突变。可能存在更复杂的 突变机制。
霍乱弧菌的微生物学诊断检查方法
霍乱弧菌的微生物学诊断检查方法微生物学诊断由于霍乱流行迅速，且在流行期间发病率及死亡率均高，危害极大，因此早期迅速和正确的诊断，对治疗和预防本病的蔓延有重大意义。
直接镜检采取病人“米泔水样”大便或呕吐物。
镜检（涂片染色及悬滴法检查）观察细菌形态，动力特征。
细菌分离培养可将材料接种至碱性蛋白胨水37℃培养6～8小时后，取生长物作形态观察，并转种于碱性平板作分离培养，取可疑菌落作玻片凝集，阳性者再作生化反应及生物型别鉴定试验。
特异性制动试验取检材或新鲜碱性蛋白胨水培养物一滴，置于载玻片上，再加霍乱弧菌多价诊断血清，加盖玻片，用暗视野镜观察，3分钟内运动被抑制的即为阳性，此法优点是快速而特异操作简便，但必须有数量较多的弧菌才检出。
免疫荧光试验除一般免疫荧光法外，还可用荧光菌球法检查。
1.标本采集和运送:霍乱是烈性传染病,凡在流行季节和地区有腹泻症状的患者均应快速准确作出病原学诊断.在发病早期,尽量在使用抗菌药物之前采集标本.可取患者”米泔水”样便,也可采取呕吐物或尸体肠内容物,或采取肛门试子.标本应避免接触消毒液,采取的标本最好就地接种碱性胨水增菌,不能及时接种者可用棉签挑取标本或将肛门试子直接插入卡-布运送培养基中.送检标本装在密封,不易破碎的容器中,置室温由专人输送.甘油盐水保存液不适合于弧菌的运送.2．标本直接检查:荚膜肿胀试验：特异性抗血清与相应细菌的荚膜抗原特异性结合形成复合物时，可使细菌荚膜显著增大出现肿胀的试验常用于肺炎链球菌、流感嗜血杆菌等的检测革兰染色：革兰染色过程所用四种不同溶液和作用：1、碱性染料这在简单染色中已讨论过，此处用结晶紫。
2、媒染剂其作用是增强染料与细菌的亲和力，更好地加强染料与细胞的结合。
常用的媒染剂是碘液。
3、脱色剂帮助染料从被染色的细胞中脱色。
利用细菌对染料脱色的难易程度不同，而将细菌加以区分。
革兰阳性细菌不易被脱色剂脱色，而革兰阴性细菌则易被脱色。
常用的脱色剂是丙酮或乙醇，这里所用的是95%的乙醇。
霍乱弧菌实验室检验技术20060409
三、霍乱弧菌的形态学
（一）形态与染色
（二）菌细胞结构 1、细胞壁 ：特异性多糖（O抗原） 2、细胞膜 3、细胞浆：质粒 4、核质：双股一环状DNA 5、荚膜 6、鞭毛：长而粗（H抗原），起运动作用。
四.微生物学特性:
（ 一）. 形态、染色:
自病人新分离的霍乱弧菌为革兰氏阴 性短小稍弯曲的杆菌，无芽胞，菌体两端钝 圆或稍平，菌体单端有一根鞭毛，长可达菌 体长度的4～5倍，运动极为活泼。
五、霍乱弧菌的主要抗原和血清分型
（一）鞭毛抗原（H抗原）：特异性低，不耐热， 100℃ 2h 即被破坏。 （二）菌体抗原（O抗原） ：特异性强，耐热， 具有群和型特异性。 根据O抗原的不同霍乱弧菌已有200个以上 的O血清群 1. O1群 （1）根据O抗原成分的不同分群特异性抗原因子 （A抗原因子）和型特异性抗原因子（B和C抗 原因子）
二.霍乱弧菌在弧菌科的分类地位
弧菌科包括5个属
﹙一﹚ 弧菌属 1.霍乱弧菌﹙V.cholerae﹚：与O1群霍乱弧菌具有共 同鞭毛抗原、生化性状类似，仅菌体抗原不同的弧菌 。目 前有O200以上血清群，其中O1和O139群含有相同的毒素基因， 可引 起 霍 乱流行。
2.其它弧菌：副溶血弧菌﹙V. parahaemolyticus﹚、 河弧菌、拟态弧菌、溶藻弧菌等。
不与022群、0155群及01群粗糙型交叉 凝集。
六.霍乱弧菌的抵抗力
（一）对温度的耐受力
1. 无芽胞，对热耐受力不强。零度以下可活14 天左右。 2. 实验室保存菌种时放室温，不放冰箱 （二） 对干燥的耐受力敏感，干燥的玻片上3小 时左右死亡。 （三）对各种常用消毒剂如含氯制剂、碘制剂 均为敏感。
（2）根据型特异性抗原因子的不同可把O1 霍乱弧菌的两个生物型分为三个血清型： 小川 型霍乱弧菌（ A，B， 少量C） 稻叶型霍乱弧菌（ A， C ）
微生物检验危急值报告程序
微生物检验危急值报告程序
1 目的
对于在血、骨髓、脑脊液等标本中（涂片或培养）发现细菌或真菌，以及发现疑似高致病性病原微生物或国家规定立即上报的法定传染病，第一时间报告给临床医生及医院相关部门，为诊断治疗或隔离防疫赢得时间。
2 适用范围
适用于临床微生物检验的所有血培养、骨髓培养、脑脊液涂片或培养标本，以及可能发现疑似高致病性病原微生物或国家规定立即上报的法定传染病病原体的所有标本。
3 职责
实验室所有经授权工作人员均应执行本程序。
4 程序内容
4.1 微生物检验危急值：
4.1.1 血液、骨髓或脑脊液检出（涂片或培养）病原微生物。
4.1.2 O1群霍乱弧菌、O139群霍乱弧菌、鼠疫杆菌、炭疽杆菌、肠出血大肠埃希菌 O157：H7、伤寒沙门菌、痢疾志贺菌、猪链球菌、结核杆菌（或抗酸染色阳性）、生殖道淋病奈瑟菌、布鲁菌、脑膜炎奈瑟菌等传染性较强的微生物及其他国家规定立即上报的法定传染病病原体。
4.2 微生物危急值报告方式和处理。
4.2.1 血培养、骨髓培养、脑脊液培养的危急值报告方式按《微生物检验结果》中的分级报告程序进行，电话通知相应临床科室并及时填写《检验科危急值报告登记表》。
4.2.2 脑脊液涂片发现细菌或真菌，应立即审发涂片结果，电话通知临床并及时填写《检验科危急值报告登记表》。
4.2.3 检出 O1 群霍乱弧菌、O139 群霍乱弧菌、鼠疫杆菌、炭疽杆菌、肠出血大肠埃希菌 O157：H7、伤寒沙门菌、痢疾志贺菌、猪链球菌、结核杆菌（或抗酸染色阳性）、生殖道淋病奈瑟菌、布鲁菌、脑膜炎奈瑟菌等传染性较强的微生
物或国家规定立即上报的法定传染病病原体，按《疑似高致病性病原微生物标本管理程序》处理。
霍乱弧菌采样及快速检测操作注意事项
霍乱弧菌采样注意事项
一．尽早采样，最好在用药前。
二．采样量要足够，固体粪便1-2g，液体粪便1-2ml放入10ml 碱性胨水中。
三．采样时要填写送检单，内容包括患者姓名、性别、年龄、采样日期、送样单位、送样人。
四．采样后专人及时送检，防治污染。
霍乱弧菌快速检测操作及注意事项
一、操作步骤：
1、待检试纸条置于洁净干燥的工作台上
2、用干净的吸管或加样器吸取样品或增菌样品2-3滴，滴加到检测条样品加入端（白色端），开始计时。
3、2-15分钟内观查结果。
15分钟后结果不计。
二、结果判断：
阴性：一条红线出现，即质控线
阳性：两条红线出现，即检测线（中间）和质控线
无效：无红线出现
三、样品处理
1、直接检测：水样便
2、增菌检测：1-2ml接种至10ml碱性胨水中。
37℃6-8
小时或过夜。
3、水样、食品标本略。
四、注意事项
1、检测试纸条4-30℃阴凉避光干燥处保存，注意防潮，有效期一年。
2、用新鲜标本，不得使用陈旧标本。
3、加样时用干净吸管或干净加样器加样，若将检测条直接浸入样品中不得超过0.5cm。
4、实验后彻底消毒污染区及具有传染可能的污染物。
霍乱弧菌的检验程序
霍乱弧菌的检验程序临床细菌实验室接到高度疑似患者标本，应尽快地进行检验。
具体处理方法如下。
1.临床标本（患者排泄物、呕吐物、肛拭、肛管内容物及残留、剩余食物等）直接涂片，观察动力，再做制动试验以及革兰染色，镜检发现革兰阴性、细小、直的、微弯、逗号状的杆菌。
疑似者即予电话报告2.标本直接接种：①血琼脂平板；②弧菌鉴别性平板（4号琼脂平板、碱性琼脂平板）；③接种碱性胨水3.保留原始标本（不可置于冰箱冷藏）4.35℃孵育上述所有平板及胨水5.6~8h后：①取碱性胨水培养物涂片（直接观察动力、做制动试验）染色镜检；②移种鉴别性琼脂平板和血琼脂平板；③霍乱红试验；④观察血琼脂平板，见有微小菌落生长。
立即涂片染色，霍乱多价血清凝集，氧化酶试验。
如符合霍乱弧菌的推断性鉴定，可作出早期初步报告。
6.继续孵育过夜后，做玻片凝集试验。
自分离平板上挑取可疑菌落与霍乱多价诊断血清做玻片凝集试验，所用血清的效价应在1：80～1：160，如过浓，则稀释后再做凝集。
将稀释血清滴加在洁净的载玻片上，挑取可疑菌落混悬于血清内，即刻（一般不超过10s）出现肉眼可见的明显凝集者为阳性。
菌落应以生理盐水作对照，不发生凝集。
为了提高阳性检出率，应多挑可疑菌落进行玻片凝集。
将O1群霍乱多价血清凝集阳性菌落再做氧化酶、涂片染色镜检，初步推断性鉴定，将此高度疑似菌株，报告当地疾病控制中心做最后鉴定。
霍乱弧菌的检测1.涂片检查：取新鲜送检标本涂片2张，干燥后，用乙醇或甲醇固定，分别用革兰染色剂1：10稀释的石碳酸复红染色，用油镜检查，观察有无革兰阴性呈鱼群排列的弧菌。
悬滴检查：取患者粪便，制成悬滴标本或圧滴标本，检查细菌的动力，霍乱弧菌古典型和EL-Tor型常呈穿梭状及活泼的活动，在悬滴涂片中加O1群霍乱弧菌诊断血清后，在显微镜下观察，若原运动活泼的现象停止，为制动试验阳性。
2.培养：取疑似患者粪便直接接种于碱性蛋白胨水中，进行增菌，同时划线接种于碱性琼脂平板或TCBS平板及血液琼脂平板，孵育于35℃。
霍乱弧菌检验程序
霍乱弧菌检验程序霍乱弧菌检验程序一、检查对象一天内腹泻三次或三次以上的病人。
二、标本采集及处理1、采集时间：在未服用抗生素前采样。
2、采集方式：用棉拭子或采便管从肛门插入直肠3—5厘米取样，必须看到有粪便黏附才可：对于自然排出的水样便、呕吐物及保存液保存的标本可直接接种分离或吸取0.5ML、成形大便取黄豆左右大小。
3、标本送检：标本采集后应立即送检。
若不能立即送检，可保存于碱性蛋白胨水中尽快送检验。
24小时以上才能送检的标本，应使用文一腊二氏保存液保存。
4、标本处理：将标本直接分离接种于4号琼脂及放入8—10ML碱性蛋白胨水中增菌。
“两管三板”：送检标本马上接种一个4号琼脂平板、同时碱性蛋白胨水培养管增菌；—8小时后接种增菌管内标本于第二块4号琼脂平板，同时转种第二管碱性蛋白胨水；6—8小时后继续接种第二管碱性蛋白胨水的标本于第三块4号琼脂平板上。
三、检验程序：1、弧菌形态：弧菌生长快、菌落大、培养4—5小时，原划线处有菌苔生长，8—10小时可长出小菌落，16小时菌落直径可达2毫米。
菌落略带灰色、半透明、扁平、稍隆起、光滑湿润，培养时间延长或室温放置后，菌落略带黄色，中心厚而周围透明，培养基含亚碲酸钾使得菌落成灰色，中心形成黑色金属碲沉淀。
在平皿上挑取典型菌落做玻片凝集试验。
2、玻片凝集试验：首先要注意抗原抗体比例和保证抗原（菌株）的纯洁性，使用O1群和O139群两种诊断血清。
如未获单个菌落，可挑取可疑菌苔边缘透明部分做玻片凝集。
注意，凝集的菌落应以生理盐水作对照，检查有无自然凝集；然后用此玻片显微镜下看动力（动力活泼如流星样）；再将此玻片革兰氏染色看弧菌形态。
3、弧菌分型：稻叶型和小川型诊断血清做玻片凝集试验进一步分型。
四、报疫程序：一旦发现阳性可疑标本立即用铁罐保存，通知送检科室，确认病人资料；上报医院总值班2460或2560，派车送海珠区防疫站确证。
五、标本处理：发现Ⅱ号菌阳性可疑标本，即送标本往防疫站确认。
霍乱弧菌采样及快速检测操作注意事项
霍乱弧菌采样注意事项
一．尽早采样，最好在用药前。
二．采样量要足够，固体粪便1-2g，液体粪便1-2ml放入10ml 碱性胨水中。
三．采样时要填写送检单，内容包括患者姓名、性别、年龄、采样日期、送样单位、送样人。
四．采样后专人及时送检，防治污染。
霍乱弧菌快速检测操作及注意事项
一、操作步骤：
1、待检试纸条置于洁净干燥的工作台上
2、用干净的吸管或加样器吸取样品或增菌样品2-3滴，滴加到检测条样品加入端（白色端），开始计时。
3、2-15分钟内观查结果。
15分钟后结果不计。
二、结果判断：
阴性：一条红线出现，即质控线
阳性：两条红线出现，即检测线（中间）和质控线
无效：无红线出现
三、样品处理
1、直接检测：水样便
2、增菌检测：1-2ml接种至10ml碱性胨水中。
37℃6-8
小时或过夜。
3、水样、食品标本略。
四、注意事项
1、检测试纸条4-30℃阴凉避光干燥处保存，注意防潮，有效期一年。
2、用新鲜标本，不得使用陈旧标本。
3、加样时用干净吸管或干净加样器加样，若将检测条直接浸入样品中不得超过0.5cm。
4、实验后彻底消毒污染区及具有传染可能的污染物。
霍乱弧菌检测
1、古典生物型（前六次大流行）
2、E1 Tor 生物型（第7次 1961年来）。
两个生物型具有相同的血清型。我国流行以 El Tor霍乱弧菌为主。
霍乱弧菌古典生物型和 El-Tor生物型的区别
特征
古典生物型
羊红细胞溶血
-
鸡红细胞凝集
-
VP 试验
-
CAMP 试验
-
多粘菌素 B 敏感试验
+
Ⅳ组噬菌体裂解
快速诊断
标本
增菌培养 碱性蛋白胨水
分离培养（TCBS、碱性平板） 血清学鉴定 初步报告
生化鉴定分型 确诊报告
直接涂片 动力、制动试验
霍乱弧菌（V.cholera）是人类霍乱的病原 体，霍乱是一种古老且流行广泛的烈性传 染病之一。曾在世界上引起多次（7次）大 流行。
主要表现为剧烈的呕吐、腹泻、失水，死 亡率甚高。属于国际检疫的烈性传染病。
霍乱弧菌属于弧菌科弧菌属，革兰染色阴性 菌体短小，稍弯曲，两端钝圆，长1.5～ 2.0µm,宽0.3～0.4µm 。
样品分别接种一个9cm 直径的庆大霉素琼脂 或TCBS 琼脂平板和一个碱性琼脂平板进行划 线分离培养。
同时，以无菌吸管吸取0.2-0.5ml 增菌液接种 到新的碱性蛋白胨水中，进行二次增菌培养后， 再如上述步骤进行划线分离培养。
特别强调所有环境样品的增菌分离培养步骤必 须包括上述二次增菌和强、弱双平板分离。
用于霍乱弧菌的鉴定试验有：①霍乱红试验:霍乱弧菌的 两种生物型均呈阳性反应，但是，本反应并非霍乱弧菌 特有，许多能分解色氨酸和还原硝酸盐的细菌，均能产 生阳性反应；②糖发酵试验:霍乱弧菌分解葡萄糖、蔗糖、 甘露醇产酸不产气，不发酵阿拉伯糖；③粘丝试验:弧菌 属细菌除副溶血弧菌部分菌株外，均有此反应；④ O/129敏感试验：参照药敏试验方法进行。将O/129 10μg和150μg的纸片贴在接种有待测菌的琼脂平板上， 35℃孵育18～24h后，纸片周围出现任何大小的抑菌环 均为敏感；O1群和非O1群霍乱弧菌均敏感，但已有对 O/129耐药的菌株出现；O139群对O/129耐药，用此 试验作鉴定时需特别谨慎，需结合其他试验结果加以综 合考虑；⑤耐盐试验:霍乱弧菌可在不含氯化钠和含有6 ％氯化钠培养基中生长，氯化钠浓度高于6％则不生长。
霍乱弧菌检测方法
霍乱弧菌检测的快速方法霍乱是由霍乱弧菌引起的烈性肠道传染病, 发病急、来势凶猛、传播快是该病的特点, 因而及早培养鉴定出霍乱弧菌对控制该病的流行和治疗有极其重要的意义。
本文作者在1995年9 月～ 2000 年9 月期间, 对我科1 256 例急性腹泻患者粪便和呕吐物培养霍乱弧菌的方法进行改进, 大大缩短了阳性结果的报出时间, 现总结如下。
1 材料与方法1.1材料1.1.1 标本来源1995 年9 月～ 2000 年9 月本院门诊及住院急性腹泻患者新鲜粪便样本1 042 份, 呕吐物214 份。
1.1.2 试剂所用培养基均购自杭州天和微生物制品厂, 霍乱弧菌单克隆抗体购自卫生部兰州生物制品研究所。
1.2 方法用灭菌毛细吸管吸取1m l 患者米汤样粪便或直接将采便管棉拭子接种于10m l 1% 硷性蛋白胨水中, 置37℃培养箱作增菌培养。
快速方法为增菌2 小时后取表面生长物或菌膜转种普通琼脂平板, 6 小时后即可挑取可疑菌落进行鉴定。
另一方法为按常规方法增菌6～ 9 小时后转种于庆大霉素琼脂平板,均按《全国临床检验操作规程》进行鉴定。
2 结果应用快速方法在10 小时内可报出阳性结果, 常规方法则20 小时报出阳性结果。
1 256 份标本中, 共检出15 例霍乱弧菌,均为小川型, 两种方法的阳性率均为1119% (15ö1 256) , 符合率100%。
3 讨论霍乱是我国法定的甲类传染病, 国家要求在接诊24 小时内报出检验结果。
本文在急性腹泻患者粪便霍乱弧菌培养方面采用缩短增菌时间和转种普通琼脂平板的方法, 从传统的增菌6～ 9 小时再转种选择性培养基改为增菌2 小时后开始转种普通琼脂平板, 能使阳性结果在10 小时内发出报告, 比常规方法快10 小时, 对霍乱的诊断治疗均有重要的意义。
增菌2 小时即可转种是由于: (1) 霍乱患者急性期粪便和呕吐物中含有大量的堆乱弧菌, 增菌 2 小时后霍乱弧菌已被增殖数十倍, 此菌数已足以转种。
霍乱弧菌实验室检验技术
抗原构造
O139群霍乱弧菌不被已知的O1-O138群霍乱弧 菌诊断血清所汇集。表明本菌的抗原性与O1群 和其它非O1群霍乱弧菌有明显区别。 革兰氏阴性菌的抗原性都是由细胞壁的脂多 糖（LPS）所决定。通过对O139群霍乱弧菌的 LPS进行化学分析和血清学分析后发现O139群 霍乱弧菌缺少O1群霍乱弧菌LPS中的特异性成 分。 通过两者进行提取其LPS然后进行被动溶血试 验与被动溶血抑制试验检测，结果显示两者抗 原性有显著不同。O139群霍乱弧菌有荚膜而 O1群霍乱弧菌无荚膜。
2012-5-4
两者不同点：
群所致病中有44 O139群所致病中有 44.3% 可发生腹部痉 139 群所致病中有 44. 也有引起严重粘液性腹泻的， 挛 ， 也有引起严重粘液性腹泻的 ， 进入 外周血液可引起发热， 外周血液可引起发热 ， 出现菌血症或败 血症。 印度出现20 例病人中有17 例发热、 20例病人中有 17例发热 血症 。 印度出现 20 例病人中有 17 例发热 、 白细胞增多。 白细胞增多 。 而 O1 群引起的病人未曾见 过。 鉴别两者， 必须通过血清学诊断 来区分。 血清学诊断来区分 鉴别两者 ， 必须通过 血清学诊断 来区分 。 22群与 139群血清有交叉汇集反应 群与O 群血清有交叉汇集反应， O22群与O139群血清有交叉汇集反应，必 须用O22群弧菌吸收 群弧菌吸收， 须用O22群弧菌吸收，去除交叉汇集现象。
病，发病急、传播速度快、波及范 围广、危害严重的甲类传染病。 ♦ 是国内交通检疫传染病之一。 ♦ 也是当今三种国际检疫传染病中最 严重的一种。
2012-5-4
霍乱病原菌发现
♦ 1883年德国科学家Koch发现霍乱弧菌 ♦ 1905年埃及埃儿托检疫站首次分离到
AYL-S7-350 霍乱弧菌检验标准操作规程3.0
霍乱弧菌检验标准操作规程1．概述霍乱弧菌可分为古典生物型和EL-Tor生物型；根据菌体抗原(即O抗原)又可分为155个血清群，其中O1血清群和O139血清群能引起霍乱的发病和流行，是霍乱的病原菌。
2．标本类型粪便标本。
3．鉴定3.1 形态与染色革兰阴性，菌体弯曲呈弧形或逗点状。
3.2 培养特性在TCBS琼脂平板上呈黄色的菌落。
在双氢链霉素洗衣粉琼脂平板上形成中心呈灰褐色的菌落。
3.3 生化反应氧化酶试验阳性；发酵葡萄糖、蔗糖、甘露醇，不发酵乳糖和L阿拉伯糖；动力、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、霍乱红、硝酸盐还原和黏丝试验均阳性；精氨酸双水解酶试验阴性。
3.4 鉴别要点3.4.1 与气单胞菌属、邻单胞菌属的鉴别见表5—41。
表5—41弧菌属、气单胞菌属、邻单胞菌属鉴别的关键性试验试验霍乱弧菌拟态弧菌气单胞菌属邻单胞菌属O/129敏感试验（150ug）S R S氨苄西林（10ug）S R R黏丝试验+ - -肌醇- - +精氨酸- + +注：“+”为90％以上菌株阳性，“一”为90％以上菌株阴性，“s”为敏感，“R”为耐药3.4.2 确诊O1群霍乱弧菌必须具备的条件①涂片为革兰阴性弧菌或杆菌。
②TCBS等选择培养基上典型的菌落特征。
③动力试验阳性，符合生化特性。
④O1群霍乱弧菌诊断血清凝集试验阳性。
3.5操作步骤3 5.1 在碱性蛋白胨水(pH 8.6)中，37℃培养6～8小时后转种TCBS平板。
3.5.2 玻片凝集试验从TCBS琼脂平板或双氢链霉素洗衣粉琼脂平板上挑取可疑菌落，与霍乱多价诊断血清做玻片凝集试验，以生理盐水做阴性对照，诊断血清凝集、生理盐水不凝者为阳性。
做初步鉴定试验后，将此高度怀疑菌送疾病预防控制中心(CDC)做最后鉴定。
4．药敏参见《药物敏感性试验标准操作规程》及CLSI M100一$20最新版本文件。
5．质量控制见《质量管理程序》。
6．检验结果解释与分析初次分离时采用pH 8.6的碱性蛋白胨水增菌，6～8小时，液体呈均匀混浊，表面群菌其O抗原中的ABC因子，又可进一步将其分为小川(AB)、稻叶(AC)形成菌膜。
霍乱弧菌实验室检测
可疑菌落挑取
经典的鉴定步骤要求每个平板应挑取5个以上可疑菌落,转种于克氏双糖斜 面或者普通琼脂斜面待分纯培养后,再进行O1、O139群血清玻片凝集试验， 鉴于对霍乱疫情应急处理的考虑,现大多数监测实验室一般采用将血清玻片 凝集试验前置的做法,作为快速筛查的手段,直接对平板上生长的单个可疑菌 落进行玻片凝集试验,出现明显凝集时可做初步报告,对平板上出现可疑凝集 的菌株必须马上转种于克氏双糖斜面或者普通琼脂斜面,待纯培养物生长良 好后再次进行玻片凝集试验加以确证。 庆大霉素平板和4号琼脂：多呈半透明状，菌落中央常呈灰色或灰黑色，并 随培养时间的延长而加深（由于这类培养基均含有亚碲酸盐成份）。 TCBS（硫代硫酸盐枸櫞酸盐胆盐琼脂）：菌落生长呈黄色发亮、表面光滑、 润湿、稍凸起、边缘整齐。 （TCBS平板生长的菌落不能直挑取进行玻片凝 集试验，需按经典方法进行纯培养后再进行玻片凝集试验）
分离培养（两管两板法）：
接种后的碱性蛋白胨水37℃培养过夜，取菌膜下表层培养物接种选择性培养 基（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板）．同时吸0.1～0.2 ml表层培养物转种于 10ml碱性胨水管中作二次增菌，37℃培养6～8h再划线接种于选择性培养基
平板分离及可疑菌落挑取
平板分离
选择性分离平板应采用9cm分离平板（不建议采用7cm平板），一个平 板分离一个样品（严禁一个平板分离2份或以上样品！！ ）。 样品平板分离时应进行分区划线分离，平板分离的单个菌落数量应该达到 50个以上。
霍乱的实验室检测
样品的采集和运输 不同样品的病原分离流程及技术要点
粪便 水体 水产品，食品等
平板分离及可疑菌落挑取 菌落鉴定 常用快速检测方法
检测工作中应关注的事项
胶体金检测条 荧光PCR检测
霍乱病原菌检测标本的采集方法、运输和保存
• 5. 海水产品 • 选取活海水产品或涂抹拭子，置于塑料袋 内（拭子标本可按粪便拭子保存运输方法 处置），尽快送往实验室。如在一箱甲鱼 中可采取数只甲鱼的体表作为一个标本送 检，这比只做一只甲鱼体内检查其阳性检 出机会可能更多。霍乱监测时，海水产品 常作为重点采集监测的对象。注意采集过 程中不同食品及不同部位不能交叉污染。
另外霍乱在我国属于传染病法规定的甲类报告管理传染病在卫生部人间传染的病原微生物名录2006年中霍乱弧菌流行株危害程度为第二类属于高致病性微生物级别非流行株危害程度为第三类要求在生物安全ii级实验室bsl2操作病原体
霍乱病原菌检测标本的 采集方法、运输和保存
：
重庆市南岸CDC 许磊
一、标本的采集和送检
生物安全的要求
• 霍乱属于肠道传染病，对实验室操作以及 样品采集等方面的生物安全应按照肠道感 染细菌性疾病的通用生物安全要求。另外， 霍乱在我国属于传染病法规定的甲类报告 管理传染病，在卫生部《人间传染的病原 微生物名录》（ 2006 年）中，霍乱弧菌流 行株危害程度为第二类，属于高致病性微 生物级别（非流行株危害程度为第三类）， 要求在生物安全 II 级实验室（ BSL-2 ）操作 病原体。
• 对于霍乱疫情或疑似霍乱疫情的现场调查 和样本采集过程中，必须注意生物安全防 护，调查采样人员应咨询实验室人员，做 好个人防护以及避免采集标本过程中的感 染以及标本再污染其他物霍乱病例/带菌者/接触者粪便标本时
（三）标本送检程序
• 医院内临床检验标本由专人进行送检，采 样后立即送检到南岸区疾控中心检验科办 理交接手续。
• 粪便标本如果运送时间不超过24h，还 可将其放在碱性蛋白胨水中室温运送。 标本与碱性蛋白胨水的比例为8mL～ 10mL碱性蛋白胨水可加入1mL～3mL 液体便或指甲大小的成形便。过多的 粪便量会降低保存液的pH值。如果没 有合适采便器材以及没有运送培养基 时，可用无菌吸水纸条浸于液体粪便 中，然后将吸水纸条密封于塑料袋中， 放入冷藏箱中运往实验室。
霍乱弧菌检测方法 文档
霍乱弧菌的检测霍乱弧菌相关知识：稻叶型（A、C）古典型小川型（A、B、C少量）O1群霍乱弧菌：彦岛型（A、B、C）稻叶型（A、C）艾尔托型小川型（A、B、C少量）彦岛型（A、B、C）实验室准备：1.培养基：碱性蛋白胨水、TCBS、4号或庆大霉素琼脂、营养平板、半固体菌种保存管。
2.试剂：拉丝实验用试剂（0.5%去氧胆酸钠水溶液）、氧化酶试剂（1%盐酸对氨基二甲基苯胺或盐酸对氨基四甲基苯胺水溶液。
3.诊断血清：O1群霍乱诊断血清、稻叶型霍乱血清、小川型霍乱血清、O139群霍乱血清。
4.快诊试剂：O1群霍乱胶体金标记快诊卡、O139群霍乱胶体金标记快诊卡。
霍乱弧菌检验流程图：标本37度6-8小时TCBS、4号或庆大霉素琼脂小时胶体金快诊卡/制动等试验血清学凝集试验氧化酶实验拉丝实验O/129敏感试验初步报告、菌种保存一、采样（一）水样便采取1-2毫升，成形便采取指甲大小的粪量。
病人呕吐物、沾染粪便的衣物、尸体的肠腔和口腔内容物亦可做为检材；（二）外坏境样本可采取病人的污染衣物、剩饭菜、可疑食品、抹布、污水、坑塘水、井水、公厕粪便、苍蝇等；（三）按1：10比例置入碱性蛋白胨水增菌液中，迅速送往实验室。
二、增菌、培养（一）所有粪便标本都应经过增菌，尤其是恢复期病人、带菌者或用过抗菌药物的病人标本含菌量少，单靠直接分离不易检出。
需经碱胨水37度增菌6-8小时后分离(夏日可将运送时间计算在内)；（二）标本含菌量少时，为提高检出率可实行2次增菌，取第一次碱胨水增菌后的培养物表层液0.1-0.2毫升，接种于8-10毫升的碱胨水中，37度培养6-8小时后再做分离。
（三）霍乱弧菌好氧，易形成菌膜，故在取出增菌管时动作要轻，接种环于菌膜下取一满环，划线接种于TCBS或4号琼脂平板37℃10~14h孵育培养。
三、快速诊断（一）、直接镜检：为争取最快速度作出诊断，采取病人“米泔水样”大便或呕吐物，悬滴法镜检（最好用暗视野），可见具有流星状动力的细菌。
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霍乱弧菌检验程序
一、检查对象
一天内腹泻三次或三次以上的病人。
二、标本采集及处理
1、采集时间：在未服用抗生素前采样。
2、采集方式：用棉拭子或采便管从肛门插入直肠3—5厘
米取样，必须看到有粪便黏附才可：对于自然排出的水样便、呕吐物及保存液保存的标本可直接接种分离或吸取
0.5ML、成形大便取黄豆左右大小。
3、标本送检：标本采集后应立即送检。
若不能立即送检，
可保存于碱性蛋白胨水中尽快送检验。
24小时以上才能送检的标本，应使用文一腊二氏保存液保存。
4、标本处理：将标本直接分离接种于4号琼脂及放入
8—10ML碱性蛋白胨水中增菌。
“两管三板”：
送检标本马上接种一个4号琼脂平板、同时碱性蛋白胨水培养管增菌；—8小时后接种增菌管内标本于第二块4号琼脂平板，同时转种第二管碱性蛋白胨水；6—8小时后继续接种第二管碱性蛋白胨水的标本于第三块4号琼脂平板上。
三、检验程序：
1、弧菌形态：
弧菌生长快、菌落大、培养4—5小时，原划线处有菌苔生长，8—10小时可长出小菌落，16小时菌落直径可达2毫米。
菌落略带灰色、半透明、扁平、稍隆起、光滑湿润，培养时间延长或室温放置后，菌落略带黄色，中心厚而周围透明，培养基含亚碲酸钾使得菌落成灰色，中心形成黑色金属碲沉淀。
在平皿上挑取典型菌落做玻片凝集试验。
2、玻片凝集试验：
首先要注意抗原抗体比例和保证抗原（菌株）的纯洁性，使用O1群和O139群两种诊断血清。
如未获单个菌落，可挑取可疑菌苔边缘透明部分做玻片凝集。
注意，凝集的菌落应以生理盐水作对照，检查有无自然凝集；然后用此玻片显微镜下看动力（动力活泼如流星样）；再将此玻片革兰氏染色看弧菌形态。
3、弧菌分型：
稻叶型和小川型诊断血清做玻片凝集试验进一步分型。
四、报疫程序：
一旦发现阳性可疑标本立即用铁罐保存，通知送检科室，确认病人资料；上报医院总值班2460或2560，派车送海珠区防疫站确证。
五、标本处理：
发现Ⅱ号菌阳性可疑标本，即送标本往防疫站确认。
余下的碱性胨水管、直划板等放置于专用铁盒内，留待防疫反馈讯息后，浸5%戊二醛消毒水30分钟后交工人煮沸1小时再清洗或弃置。
同时要登记于烈性传染病登记本和强毒菌株及污染物品处理登记本。