霍乱弧菌检测方法 文档
霍乱弧菌血清学检测标准操作规程
霍乱弧菌血清学检测标准操作规程
1．目的
规范霍乱弧菌的血清学检测标准操作规程。
2．原理
用已知的霍乱弧菌诊断血清在载玻片上直接与细菌培养物或菌悬液混合，若出现肉眼可见的特异性凝集块，表示该菌即为霍乱弧菌。
3．试剂
霍乱弧菌诊断血清，生理盐水。
4．质控
霍乱弧菌ATCC14035阳性；大肠埃希菌ATCC25922阴性。
5.操作步骤
5.1 先用接种环取1环生理盐水于玻片上，以接种针挑取少许菌落与盐水混匀，再取稀释血清1环与之混合，立即出现凝集者为阳性。
5.2 若有自凝现象改用生理盐水稀释的血清再做凝集。
与O1群霍乱弧菌血清凝集者即可定为霍乱弧菌，然后再进一步对霍乱弧菌分型。
6.结果判断
阴性：试验一侧及对照一侧均为混浊。
阳性：对照一侧均为混浊，试验一侧明显凝集。
自凝：试验一侧及对照一侧
凝集。
7.注意事项
试验时应同时用生理盐水作对照，以防止出现假阳性。
8.临床意义
主要用于霍乱弧菌的鉴定。
霍乱弧菌实验室检测
霍乱弧菌的实验室检测
目的:提高检出率,减少漏检以及误判的发生 手段:
检测人员是否有足够的责任心? 检测试剂准备是否齐全且符合要求? 是否严格按照检测流程进行操作?
霍乱概述
▪ 什么是霍乱?
霍乱是由01群和0139群霍乱弧菌（V．cholerae）
引起的急性肠道传染病，发病急、传播速度快、波 及范围广、危害严重的甲类传染病。
霍乱弧菌
O1群 非O1群
古典生物型 埃尔托生物型
小川型 Ogawa (AB) 稻叶型 Inaba (AC) 彦岛型 Hikojim (ABC)
霍乱病原菌
O139群（Bengal）
O2-O200群
腹泻病原菌
▪ 病原体
O1群，O139群霍乱弧菌
▪ 发病特征：
剧烈腹泻、呕吐、严重脱水时致酸中毒、循环衰竭而致死亡 不治疗或医疗很差的条件下病死率可达到20－50％（重症病人达70－ 100％）
菌落鉴定
▪ 染色镜检
革兰染色阴性的短杆菌
▪ 血清凝集试验：
➢分别使用O1群，O139群霍乱血清进行凝集试验，同时使用生理盐水进行 对照凝集，以排除与生理盐水发生凝集的自凝菌。 ➢生理盐水不凝集，O1群血清明显凝集的菌落，进一步使用稻叶型和小川型 血清进行凝集试验，判定型别：稻叶型血清凝集而小川型血清不凝集的菌落 为稻叶型，小川型血清凝集而稻叶型血清不凝集的菌落为小川型，如稻叶型 血清和小川型血清均出现凝集的时候，要注意鉴别是否为彦岛型，需进行试 管凝集试验且两者的凝集效价均超过一半以上才能判定为彦岛型，因为某些 小川型菌落自身会带有少量的C抗原而出现与稻叶型血清发生弱凝集，因此 如小川型血清凝集较稻叶型血清凝集有明显优势时应维持小川型的判定。 ➢生理盐水不凝集，O139群血清明显凝集的菌落，一般为O139群，但其与 O22群及O155群甚至一些非霍乱弧菌会出现交叉凝集，由上级实验室进行 进一步确认。
霍乱弧菌检测
霍乱弧菌检测文章目录*一、霍乱弧菌检测的基本信息1. 定义2. 专科分类3. 检查分类4. 适用性别5. 是否空腹*二、霍乱弧菌检测的正常值和临床意义1. 正常值2. 临床意义*三、霍乱弧菌检测的检查过程及注意事项1. 检查过程2. 注意事项*四、霍乱弧菌检测的相关疾病和症状1. 相关疾病2. 相关症状*五、霍乱弧菌检测的不适宜人群和不良反应1. 不适宜人群2. 不良反应霍乱弧菌检测的基本信息1、定义霍乱弧菌检测对霍乱有诊断意义。
阳性见于霍乱。
霍乱弧菌检查常规方法是:直接涂片、染色检查、动力观察制动试验。
阳性结果的临床分析显微镜检查可作为快速诊断的参考。
革兰染色镜检可见典型革兰阴性弧菌。
悬滴暗视野检查可见穿梭样活泼运动。
免疫制动试验阳性,具有重要参考意义。
上述结果只能做出初步诊断,最后的确诊仍需以培养结果为准。
2、专科分类传染病检查3、检查分类病原微生物检查4、适用性别男女均适用5、是否空腹非空腹霍乱弧菌检测的正常值和临床意义1、正常值未检出霍乱弧菌。
2、临床意义异常结果: 阳性结果的临床分析:显微镜检查可作为快速诊断的参考。
革兰染色镜检可见典型革兰阴性弧菌。
悬滴暗视野检查可见穿梭样活泼运动。
免疫制动试验阳性,具有重要参考意义。
上述结果只能做出初步诊断,最后的确诊仍需以培养结果为准。
阳性:见于霍乱。
需要检测的人群: 频繁急剧腹泻、呕吐等怀疑为霍乱的病人。
霍乱弧菌检测的检查过程及注意事项1、检查过程增菌称取检样25g,加入装有225mL碱性蛋白胨水(APW)的广口瓶内。
固体样品应以均质器9000r/min-10000r/min打碎,或以剪刀充分剪碎。
(36±1)℃培养6h-8h和16h-24h。
如为牡蛎样品,应同样制备另一份检样,置于APW中,42℃培养6h-8h和16h-24h。
分离以3mm-5mm接种环取6h-8h和16h-24h增菌培养液的表面生长物一环分别划线家终于TCBS琼脂平板至少各一个,于(36±1)℃培养18-24h。
霍乱弧菌检验程序
霍乱弧菌检验程序一、检查对象一天内腹泻三次或三次以上的病人。
二、标本采集及处理1、采集时间：在未服用抗生素前采样。
2、采集方式：用棉拭子或采便管从肛门插入直肠3—5厘米取样，必须看到有粪便黏附才可：对于自然排出的水样便、呕吐物及保存液保存的标本可直接接种分离或吸取0.5ML、成形大便取黄豆左右大小。
3、标本送检：标本采集后应立即送检。
若不能立即送检，可保存于碱性蛋白胨水中尽快送检验。
24小时以上才能送检的标本，应使用文一腊二氏保存液保存。
4、标本处理：将标本直接分离接种于4号琼脂及放入8—10ML碱性蛋白胨水中增菌。
“两管三板”：送检标本马上接种一个4号琼脂平板、同时碱性蛋白胨水培养管增菌；—8小时后接种增菌管内标本于第二块4号琼脂平板，同时转种第二管碱性蛋白胨水；6—8小时后继续接种第二管碱性蛋白胨水的标本于第三块4号琼脂平板上。
三、检验程序：1、弧菌形态：弧菌生长快、菌落大、培养4—5小时，原划线处有菌苔生长，8—10小时可长出小菌落，16小时菌落直径可达2毫米。
菌落略带灰色、半透明、扁平、稍隆起、光滑湿润，培养时间延长或室温放置后，菌落略带黄色，中心厚而周围透明，培养基含亚碲酸钾使得菌落成灰色，中心形成黑色金属碲沉淀。
在平皿上挑取典型菌落做玻片凝集试验。
2、玻片凝集试验：首先要注意抗原抗体比例和保证抗原（菌株）的纯洁性，使用O1群和O139群两种诊断血清。
如未获单个菌落，可挑取可疑菌苔边缘透明部分做玻片凝集。
注意，凝集的菌落应以生理盐水作对照，检查有无自然凝集；然后用此玻片显微镜下看动力（动力活泼如流星样）；再将此玻片革兰氏染色看弧菌形态。
3、弧菌分型：稻叶型和小川型诊断血清做玻片凝集试验进一步分型。
四、报疫程序：一旦发现阳性可疑标本立即用铁罐保存，通知送检科室，确认病人资料；上报医院总值班2460或2560，派车送海珠区防疫站确证。
五、标本处理：发现Ⅱ号菌阳性可疑标本，即送标本往防疫站确认。
霍乱弧菌国标标准方法
霍乱弧菌国标标准方法
霍乱弧菌是一种引起霍乱的弧菌属细菌。
为了有效防控霍乱疫情，国家制定了
相关的标准方法来监测和检测霍乱弧菌的存在和潜在威胁。
以下是关于霍乱弧菌国标标准方法的介绍。
霍乱弧菌国标标准方法主要包括样品采集、实验室分析和结果解读三个方面。
1. 样品采集：根据国家标准方法，样品的采集需要遵循严格的卫生规范。
一般
来说，水样、食物样品和环境表面样品是常见的采集对象。
采集时需要使用无菌容器，避免样品污染。
同时，应根据实际情况选择合适的采集方法和采样点，确保能够准确反映被测对象的情况。
2. 实验室分析：实验室分析是判定霍乱弧菌是否存在的重要环节。
通常采用培
养法进行分析，包括选择适当的培养基、温度和时间等。
在培养过程中，需要注意避免其他细菌的污染，保证结果的准确性。
此外，也可以使用分子生物学技术如PCR检测方法进行快速和准确的分析。
3. 结果解读：根据国家标准方法，对于从采集到的样品中检出霍乱弧菌的，应
根据相应的标准或参考值来进行解读。
结果解读需要根据实验室分析的结果，结合相关的卫生标准来判断是否存在风险，以及是否需要采取相应的控制和预防措施。
综上所述，霍乱弧菌国标标准方法是一种用于监测和检测霍乱疫情的重要手段。
准确采集样品、实验室分析和结果解读是该方法的关键步骤。
通过执行国家标准方法，我们能够及时发现和控制霍乱弧菌的传播，从而保障公众的健康和安全。
霍乱弧菌实验室检验技术
一、霍乱概述 二、霍乱病原学 三、霍乱弧菌常规检验 四、霍乱弧菌的快速诊断 五、霍乱弧菌的噬菌体-生物分型 六、霍乱菌株的管理、保存与上送
2024/1/3
一、霍乱概述
霍乱是由01群和0139群霍乱弧菌 （V．cholerae）引起的急性肠道传染 病，发病急、传播速度快、波及范 围广、危害严重的甲类传染病。
2024/1/3
必须注意同一样品中O1、O139群霍乱弧 菌可能同时存在，有必要对所有选出的 菌落都进行凝集试验。
提倡所选菌落先经纯培养后再作相关鉴 定，除非情况特殊，一般不提倡直接使 用疑似菌落作玻片凝集。尤其对于TCBS.
如从分离培养基上直接挑取单个菌落进 行血清凝集试验，可能会有假阴性或假 阳性的出现，应谨慎判断结果，特别是 外环境样品。
挑取可疑菌落作玻片凝集
– 与O1群多价和单价血清作玻片凝集反应 – 与O139群抗血清做凝集反应
2024/1/3
血清鉴定：自分离培养基上挑取可疑菌 落与01群霍乱弧菌多价/单价诊断血清及 0139群霍乱弧菌诊断血清做玻片凝集试 验。玻片凝集用血清的效价一般应为 1∶40～1∶50。如可疑菌落在血清中很 快(一般在10s内)出现肉眼可见的明显凝 集，在生理盐水中不凝集者判为阳性。 可疑菌落较多时，应挑选5个以上的菌落 逐个进行玻片凝集检查，必要时，取原 划线菌落边缘透明部分再做玻片凝集， 均为阴性时方可报告未检出01群及0139 群霍乱弧菌。对首发病例菌株需送上一 级实验室做进一步鉴定或复查。
强调在选择培养上发现疑似菌后，首先 考虑进行01/0139群霍乱弧菌的玻片凝集 试验。必须从平板上各挑取5个以上的 （少于5个的全部挑取）疑似菌落进行 01/0139群霍乱弧菌玻片凝集试验。
不同类型的平板上，菌落形态有不同的 特征-----选择你最有把握的。
霍乱弧菌的微生物学诊断检查方法
霍乱弧菌的微生物学诊断检查方法微生物学诊断由于霍乱流行迅速，且在流行期间发病率及死亡率均高，危害极大，因此早期迅速和正确的诊断，对治疗和预防本病的蔓延有重大意义。
直接镜检采取病人“米泔水样”大便或呕吐物。
镜检（涂片染色及悬滴法检查）观察细菌形态，动力特征。
细菌分离培养可将材料接种至碱性蛋白胨水37℃培养6～8小时后，取生长物作形态观察，并转种于碱性平板作分离培养，取可疑菌落作玻片凝集，阳性者再作生化反应及生物型别鉴定试验。
特异性制动试验取检材或新鲜碱性蛋白胨水培养物一滴，置于载玻片上，再加霍乱弧菌多价诊断血清，加盖玻片，用暗视野镜观察，3分钟内运动被抑制的即为阳性，此法优点是快速而特异操作简便，但必须有数量较多的弧菌才检出。
免疫荧光试验除一般免疫荧光法外，还可用荧光菌球法检查。
1.标本采集和运送:霍乱是烈性传染病,凡在流行季节和地区有腹泻症状的患者均应快速准确作出病原学诊断.在发病早期,尽量在使用抗菌药物之前采集标本.可取患者”米泔水”样便,也可采取呕吐物或尸体肠内容物,或采取肛门试子.标本应避免接触消毒液,采取的标本最好就地接种碱性胨水增菌,不能及时接种者可用棉签挑取标本或将肛门试子直接插入卡-布运送培养基中.送检标本装在密封,不易破碎的容器中,置室温由专人输送.甘油盐水保存液不适合于弧菌的运送.2．标本直接检查:荚膜肿胀试验：特异性抗血清与相应细菌的荚膜抗原特异性结合形成复合物时，可使细菌荚膜显著增大出现肿胀的试验常用于肺炎链球菌、流感嗜血杆菌等的检测革兰染色：革兰染色过程所用四种不同溶液和作用：1、碱性染料这在简单染色中已讨论过，此处用结晶紫。
2、媒染剂其作用是增强染料与细菌的亲和力，更好地加强染料与细胞的结合。
常用的媒染剂是碘液。
3、脱色剂帮助染料从被染色的细胞中脱色。
利用细菌对染料脱色的难易程度不同，而将细菌加以区分。
革兰阳性细菌不易被脱色剂脱色，而革兰阴性细菌则易被脱色。
常用的脱色剂是丙酮或乙醇，这里所用的是95%的乙醇。
霍乱弧菌的检验程序
霍乱弧菌的检验程序临床细菌实验室接到高度疑似患者标本，应尽快地进行检验。
具体处理方法如下。
1.临床标本（患者排泄物、呕吐物、肛拭、肛管内容物及残留、剩余食物等）直接涂片，观察动力，再做制动试验以及革兰染色，镜检发现革兰阴性、细小、直的、微弯、逗号状的杆菌。
疑似者即予电话报告2.标本直接接种：①血琼脂平板；②弧菌鉴别性平板（4号琼脂平板、碱性琼脂平板）；③接种碱性胨水3.保留原始标本（不可置于冰箱冷藏）4.35℃孵育上述所有平板及胨水5.6~8h后：①取碱性胨水培养物涂片（直接观察动力、做制动试验）染色镜检；②移种鉴别性琼脂平板和血琼脂平板；③霍乱红试验；④观察血琼脂平板，见有微小菌落生长。
立即涂片染色，霍乱多价血清凝集，氧化酶试验。
如符合霍乱弧菌的推断性鉴定，可作出早期初步报告。
6.继续孵育过夜后，做玻片凝集试验。
自分离平板上挑取可疑菌落与霍乱多价诊断血清做玻片凝集试验，所用血清的效价应在1：80～1：160，如过浓，则稀释后再做凝集。
将稀释血清滴加在洁净的载玻片上，挑取可疑菌落混悬于血清内，即刻（一般不超过10s）出现肉眼可见的明显凝集者为阳性。
菌落应以生理盐水作对照，不发生凝集。
为了提高阳性检出率，应多挑可疑菌落进行玻片凝集。
将O1群霍乱多价血清凝集阳性菌落再做氧化酶、涂片染色镜检，初步推断性鉴定，将此高度疑似菌株，报告当地疾病控制中心做最后鉴定。
霍乱弧菌的检测1.涂片检查：取新鲜送检标本涂片2张，干燥后，用乙醇或甲醇固定，分别用革兰染色剂1：10稀释的石碳酸复红染色，用油镜检查，观察有无革兰阴性呈鱼群排列的弧菌。
悬滴检查：取患者粪便，制成悬滴标本或圧滴标本，检查细菌的动力，霍乱弧菌古典型和EL-Tor型常呈穿梭状及活泼的活动，在悬滴涂片中加O1群霍乱弧菌诊断血清后，在显微镜下观察，若原运动活泼的现象停止，为制动试验阳性。
2.培养：取疑似患者粪便直接接种于碱性蛋白胨水中，进行增菌，同时划线接种于碱性琼脂平板或TCBS平板及血液琼脂平板，孵育于35℃。
霍乱弧菌实验室检测完整版
中、重型病例 。 临床诊断病例：符合下列任一类病例均为临床诊断病例。 临床表现为轻、中、重型或中毒型病例，并在腹泻病患者日常生活用品或家居环境中
检出O1群或/和O139群霍乱弧菌；
在一起确认的霍乱暴发疫情中，暴露人群中临床表现为轻、中、重型或中毒型病例。 实验室确诊病例： 临床病人并粪便、呕吐物或肛拭子细菌培养分离到O1群或/和O139群霍乱弧菌 ； 在疫源检索中，粪便培养检出O1群或O139群霍乱弧菌前后各5天内有腹泻症状者。
挑可疑菌落、多价血清凝集
胶体金层析 卡检测
胶体金层析 卡检测
核酸提取 荧光PCR检测
血清分型、生化鉴定
问题：实验时间；灵敏度；初筛；等待时间
标本的采集和运输
采集：
病例：粪便、肛拭子、呕吐物 未使用抗生素之前 “健康”人：粪便、肛拭子 其他传播环节的标本：食物、水、操作台、砧板、下水道口……
要求：位置、数量
运输：
C-B运输培养基（pH8.4） 碱性蛋白胨水：不是最佳的，尤其6小时内还不能进行培养时，不要用 运输培养基用前预冷1-2小时，采样后不能立即运至实验室时，需冷藏
特定地区？
感染因素多样化
初级感染因素、衍生的感染因素
确诊 病例 采样检测
就诊
患者
- 临床及时发现病例 - 细致的流行病学调查 - 实验室检测与分析 - 信息整合 - 控制行动
标本-粪便、呕吐物、水体、食品、、、
前处理：运输、调pH
增菌：碱性蛋白胨水（水体：加十倍浓缩液），6h – 过 夜
涂平板，16h ： 4号琼脂、TCBS、庆大霉素
S
SS S
S
霍乱弧菌检测
该方法适用于早期诊断和快速筛 查，尤其在爆发期间对于大量样
本的检测具有优势。
其他检测方法
01
其他检测方法包括免疫层析试纸 条、免疫荧光抗体染色、电子显 微镜观察等。
02
这些方法在某些情况下可能具有 一定的应用价值，但敏感性和特 异性相对较低，且操作较为繁琐 。
03
霍乱弧菌检测的临床意义
这种方法通常用于回顾性调查和 流行病学研究，因为抗体产生需 要一定时间，且在感染后数月仍
可能保持阳性。
血清学检测不能用于早期诊断， 但对于评估疫苗接种效果和群体
免疫水平具有一定的价值。
分子生物学检测
分子生物学检测利用核酸探针或 PCR技术检测霍乱弧菌的遗传物
质。
分子生物学检测具有高敏感性和 特异性，能够快速地检测出极低
02
霍乱弧菌检测方法
粪便培养检测
粪便培养是检测霍乱弧菌的传统方法 ，通过将粪便样本接种在选择性培养 基上，观察是否有霍乱弧菌生长。
粪便培养通常用于确诊霍乱病例，以 及在爆发期间对疑似病例进行筛查。
粪便培养具有较高的特异性，但敏感 性较低，且需要较长时间才能得到结 果。
血清学检测
血清学检测通过检测患者血清中 的抗霍乱弧菌抗体来诊断霍乱。
加强国际合作与交流，共享先进的检 测技术、试剂和仪器资源，提高全球 霍乱弧菌检测能力。
培训与能力建设
通过国际培训和能力建设项目，提高 各国实验室检测人员的技能和水平， 促进检测技术的普及和应用。
05
案例分析
某地区霍乱弧菌检测案例
01
02
03
背景
某地区出现霍乱疫情，需 要对当地水源、食品和人 群进行霍乱弧菌检测。
特异性
霍乱弧菌采样及快速检测操作注意事项
霍乱弧菌采样注意事项
一．尽早采样，最好在用药前。
二．采样量要足够，固体粪便1-2g，液体粪便1-2ml放入10ml 碱性胨水中。
三．采样时要填写送检单，内容包括患者姓名、性别、年龄、采样日期、送样单位、送样人。
四．采样后专人及时送检，防治污染。
霍乱弧菌快速检测操作及注意事项
一、操作步骤：
1、待检试纸条置于洁净干燥的工作台上
2、用干净的吸管或加样器吸取样品或增菌样品2-3滴，滴加到检测条样品加入端（白色端），开始计时。
3、2-15分钟内观查结果。
15分钟后结果不计。
二、结果判断：
阴性：一条红线出现，即质控线
阳性：两条红线出现，即检测线（中间）和质控线
无效：无红线出现
三、样品处理
1、直接检测：水样便
2、增菌检测：1-2ml接种至10ml碱性胨水中。
37℃6-8
小时或过夜。
3、水样、食品标本略。
四、注意事项
1、检测试纸条4-30℃阴凉避光干燥处保存，注意防潮，有效期一年。
2、用新鲜标本，不得使用陈旧标本。
3、加样时用干净吸管或干净加样器加样，若将检测条直接浸入样品中不得超过0.5cm。
4、实验后彻底消毒污染区及具有传染可能的污染物。
霍乱弧菌检测方法 文档
霍乱弧菌的检测霍乱弧菌相关知识：稻叶型（A、C）古典型小川型（A、B、C少量）O1群霍乱弧菌：彦岛型（A、B、C）稻叶型（A、C）艾尔托型小川型（A、B、C少量）彦岛型（A、B、C）实验室准备：1.培养基：碱性蛋白胨水、TCBS、4号或庆大霉素琼脂、营养平板、半固体菌种保存管。
2.试剂：拉丝实验用试剂（0.5%去氧胆酸钠水溶液）、氧化酶试剂（1%盐酸对氨基二甲基苯胺或盐酸对氨基四甲基苯胺水溶液。
3.诊断血清：O1群霍乱诊断血清、稻叶型霍乱血清、小川型霍乱血清、O139群霍乱血清。
4.快诊试剂：O1群霍乱胶体金标记快诊卡、O139群霍乱胶体金标记快诊卡。
霍乱弧菌检验流程图：标本37度6-8小时TCBS、4号或庆大霉素琼脂小时胶体金快诊卡/制动等试验血清学凝集试验氧化酶实验拉丝实验O/129敏感试验初步报告、菌种保存一、采样（一）水样便采取1-2毫升，成形便采取指甲大小的粪量。
病人呕吐物、沾染粪便的衣物、尸体的肠腔和口腔内容物亦可做为检材；（二）外坏境样本可采取病人的污染衣物、剩饭菜、可疑食品、抹布、污水、坑塘水、井水、公厕粪便、苍蝇等；（三）按1：10比例置入碱性蛋白胨水增菌液中，迅速送往实验室。
二、增菌、培养（一）所有粪便标本都应经过增菌，尤其是恢复期病人、带菌者或用过抗菌药物的病人标本含菌量少，单靠直接分离不易检出。
需经碱胨水37度增菌6-8小时后分离(夏日可将运送时间计算在内)；（二）标本含菌量少时，为提高检出率可实行2次增菌，取第一次碱胨水增菌后的培养物表层液0.1-0.2毫升，接种于8-10毫升的碱胨水中，37度培养6-8小时后再做分离。
（三）霍乱弧菌好氧，易形成菌膜，故在取出增菌管时动作要轻，接种环于菌膜下取一满环，划线接种于TCBS或4号琼脂平板37℃10~14h孵育培养。
三、快速诊断（一）、直接镜检：为争取最快速度作出诊断，采取病人“米泔水样”大便或呕吐物，悬滴法镜检（最好用暗视野），可见具有流星状动力的细菌。
霍乱弧菌溶血素的PCR检测方法
测序 ，获 得 了 ８ ６ ｐ的 Ｈｌ 基 因以 及两 端外 侧 序 ３ｂ ｙ全 列 （ ２ 。 据 Ｇ ｎ ａｋ已登入 的霍乱 弧菌 全序 列 ， 图 ）依 ｅＢ ｎ
采用 ＮＣ ＩＢ Ａ Ｔ软件 进行 序￣ｌ： 。 Ｂ Ｌ Ｓ ｔｌ 表明所 测 Ｏ ｌ对 ： １
人 适 量 菌 苔 ， 匀 ； 沸 １ｒｉ－ ５ ｉ ；０ ０ｐ 离 心 ５ ｉ 混 煮 ０ ｎ １ｒ ｎ ８ ０ｒｍ ａ ａ ａ ｒ ｎ， 取 上清 于 ４Ｃ保 存备 用 。 ￣
０ ０５ ６ ４ ０ ０６ ６ ４ ０ ０７ ６ ４ ０ ００ ６ ５ ０ ０１ ６５ ０ ０２ ６ ５ ０ ０４ ６ ５ ００ ８ ６５ ００ ２ ６７
２９ ３
霍 乱弧菌 霍 乱弧菌 霍 乱弧菌 霍 乱弧菌 霍乱 弧菌 霍乱 弧菌 霍 乱弧菌 霍乱弧 菌 霍乱弧 菌
０ 群 １ Ｏ 群 １ Ｏ 群 １ ０ 群 １ Ｏ 群 ｌ ０ 群 ｌ ０ 群 １ Ｏ 群 １ Ｏ 群 １
同 源 性 达 １０ ０ ％。
Ｍｉ ４ ，上下 引物 各 １ Ｌ终浓度 ０ Ｍ）Ｔ ｑ Ｎ ｘ Ｌ （ ． ５ ，ａＤ Ａ聚合 酶 ０ ５ ，模 板 ５ Ｌ ． Ｌ ２ ，无 菌 去 离 子 水补 至 ５ Ｌ ０ 。采用
稻 叶 ６ ｋ 小 Ｊ ｅ ｌ２ ｆ６ 小川 ｌ ｋ 小 川 ７ Ｉ １ 小川 １ １ ９ 小川 ７ １ 小川 ｌ ａ 稻 叶 ２ ｅ 小Ｊ Ｉ Ｉ ｅ Ｉ
非 Ｏ１非 Ｏ ３ １９
＋ ＋ ＋
＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
＋
＋
标准株
（） ２ 引物 ： 用 Ｇ ｎ ａｋ已登入 的 霍乱 弧 菌 全序 列 ， 利 ｅＢ ｎ 查
找 霍乱 弧菌溶 血素 特有 基 因 ， 用 Ｐｉ ｒ ５０软件 ， 计 了 采 ｒ ． ｍｅ 设
荧光PCR检测霍乱弧菌流程与方法
荧光PCR检测霍乱弧菌流程与方法霍乱弧菌是引起人类霍乱的病原菌.也是我国传染病防治法规定的甲类传染病病原之一作为国际检疫传染病——霍乱的病原诊断.以检出O。
群霍乱弧菌或O。
剪群霍乱弧菌为准。
O.群霍乱弧菌可再分为古典生物型和埃尔托生物型埃尔托霍乱弧菌在外环境水源中长期存在.特别是在水体PH值为7.6—8.5、水温26—32cI=、氯化物260—278mg ／L的条件下抵抗力强.生长良好。
水体及水产品中的甲壳类、贝壳类、鱼类及两栖类水生动物(牛蛙、蟾蜍)等易受霍乱弧菌的污染。
1样品、材料和仪器1.1样品为水样和鱼1.2营养肉汤、营养琼脂、碱性蛋白胨水、PH8.4的庆大霉素琼脂培养基来源于北京陆桥技术有限责任公司。
I.3霍乱O。
群多价诊断血清、小川型血清、稻叶型血清、O。
剪群血清为兰州生物制品研究所产品。
1.4API20E编码及配套生化反应板为法国生物一梅里埃公司的产品。
1.5霍乱弧菌O，菌群实时荧光PCR检测试剂盒及霍乱弧菌通用型实时荧光PCR检测试剂盒为深圳太太基因工程有限公司研制1.6荧光PCR仪：博日FQD一33A2操作步骤2.1细菌的分离培养、玻片凝集及血清分型严格按照SN／T1239—20o3《国境口岸霍乱检验规程》来进行。
2.2API鉴定将营养琼脂平板上的纯菌落用API20E试验条进行鉴定根据说明表读反应.参照鉴定表、分析图索引和APILAB软件得到鉴定结果。
2.3实时荧光PCR检测霍乱弧菌按照深圳太太基因工程有限公司提供的试剂盒方法来进行。
2.3.1增菌液处理(样本处理区)取待测样本增菌液lml到1.5Hll无菌离心管中.8000rpm离心5min，尽量吸弃上清：加入50ulDNA提取液，混匀后沸水浴5min.13000rpm离心5min.取上清保存于一20cI=备用以待检测2.3.2扩增试剂准备(PCR前准备区、从试剂盒中取出PCR反应液.室温融化并振荡混匀.取出Taq酶及UNG酶.第一次使用时2000rpm 离心10s.以收集粘在管壁上的酶贮液设所需要的PCR反应管管数为nfn=1管阴性对照+1管阳性对照+样本数1，每个测试反应体系配制如下表：表1测试反应体系配制堕型垦生!竺璺竺用量(u1)22，50.50,06计算好各试剂的使用量.加入一适当体积离心管中.颠倒混匀.2000rpm离心10s.向设定的n个PCR反应管中分别加入23u1..转移至样本处理区。
霍乱弧菌检测方法
霍乱弧菌检测的快速方法霍乱是由霍乱弧菌引起的烈性肠道传染病, 发病急、来势凶猛、传播快是该病的特点, 因而及早培养鉴定出霍乱弧菌对控制该病的流行和治疗有极其重要的意义。
本文作者在1995年9 月～ 2000 年9 月期间, 对我科1 256 例急性腹泻患者粪便和呕吐物培养霍乱弧菌的方法进行改进, 大大缩短了阳性结果的报出时间, 现总结如下。
1 材料与方法1.1材料1.1.1 标本来源1995 年9 月～ 2000 年9 月本院门诊及住院急性腹泻患者新鲜粪便样本1 042 份, 呕吐物214 份。
1.1.2 试剂所用培养基均购自杭州天和微生物制品厂, 霍乱弧菌单克隆抗体购自卫生部兰州生物制品研究所。
1.2 方法用灭菌毛细吸管吸取1m l 患者米汤样粪便或直接将采便管棉拭子接种于10m l 1% 硷性蛋白胨水中, 置37℃培养箱作增菌培养。
快速方法为增菌2 小时后取表面生长物或菌膜转种普通琼脂平板, 6 小时后即可挑取可疑菌落进行鉴定。
另一方法为按常规方法增菌6～ 9 小时后转种于庆大霉素琼脂平板,均按《全国临床检验操作规程》进行鉴定。
2 结果应用快速方法在10 小时内可报出阳性结果, 常规方法则20 小时报出阳性结果。
1 256 份标本中, 共检出15 例霍乱弧菌,均为小川型, 两种方法的阳性率均为1119% (15ö1 256) , 符合率100%。
3 讨论霍乱是我国法定的甲类传染病, 国家要求在接诊24 小时内报出检验结果。
本文在急性腹泻患者粪便霍乱弧菌培养方面采用缩短增菌时间和转种普通琼脂平板的方法, 从传统的增菌6～ 9 小时再转种选择性培养基改为增菌2 小时后开始转种普通琼脂平板, 能使阳性结果在10 小时内发出报告, 比常规方法快10 小时, 对霍乱的诊断治疗均有重要的意义。
增菌2 小时即可转种是由于: (1) 霍乱患者急性期粪便和呕吐物中含有大量的堆乱弧菌, 增菌 2 小时后霍乱弧菌已被增殖数十倍, 此菌数已足以转种。
出口食品霍乱弧菌的检验方法
出口食品霍乱弧菌的检验方法1．仪器和设备1．1恒温培养箱：36±1℃1．2恒温水浴箱：45±1℃1．3高压灭菌锅1．4拍打式均质器1．5菌落计数器1．6试管:18×150mm 12 mm×100 mm1．7锥形瓶:500ml 250ml1．8平皿：直径为90mm1．9灭菌盒和枪头1．10灭菌袋1．11酒精棉1．12天平:感量0.1g1.13冰箱：0-4℃和-15～-20℃2．培养基的制备2．1碱性蛋白胨水称取15g干粉于1000.0ml蒸馏水中，加热溶解，分装，121℃10min高压灭菌。
2．2硫代硫酸钠、柠檬酸钠、胆盐、蔗糖琼脂（TCBS）称取89.1g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，冷至55℃倾注平板备用。
2．3三糖铁（TSI）称取65g于1升蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，分装试管12mm×100 mm，每管约2～4ml，115℃15分钟高压灭菌，制成高层斜面备用，桔红色。
2．4霍乱双糖铁琼脂（KIA）称取64.5g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热溶解，分装。
121℃15分钟高压灭菌，制成高层斜面备用。
2．5T1N1琼脂称取35g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，121℃15分钟高压灭菌。
倾注平板备用。
在上项成分中改变氯化钠的含量，去除琼脂可制成T1N0和T1N3肉汤。
2．6精氨酸葡萄糖斜面琼脂（AGS）称取58g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，分装，121℃15分钟高压灭菌，制成高层斜面备用。
2．7 O/F实验用培养基（HLGB）称取45.5g溶于1000.0ml蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，分装，每管3ml（有的加矿物油覆盖）121℃15分钟高压灭菌备用。
2．8赖氨酸脱羧酶肉汤生化管2．9MR-VP肉汤生化管3.1样品的分离培养和初步鉴定:注：霍乱弧菌菌落特征形状大，光滑，黄色，稍平，具有不透明中心和半透明的边缘。
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霍乱弧菌的检测
霍乱弧菌相关知识：
稻叶型（A、C）
古典型小川型（A、B、C少量）
O1群霍乱弧菌：彦岛型（A、B、C）
稻叶型（A、C）
艾尔托型小川型（A、B、C少量）
彦岛型（A、B、C）
实验室准备：
1.培养基：碱性蛋白胨水、TCBS、4号或庆大霉素琼脂、营养平板、半固体菌种保存管。
2.试剂：拉丝实验用试剂（0.5%去氧胆酸钠水溶液）、氧化酶试剂（1%盐酸对氨基二甲基苯胺或盐酸对氨基四甲基苯胺水溶液。
3.诊断血清：O1群霍乱诊断血清、稻叶型霍乱血清、小川型霍乱血清、O139群霍乱血清。
4.快诊试剂：O1群霍乱胶体金标记快诊卡、O139群霍乱胶体金标记快诊卡。
霍乱弧菌检验流程图：
标本
37度6-8小时TCBS、4号或庆大霉素琼脂
小时
胶体金快诊卡/
制动等试验血清学凝集试验氧化酶实验拉丝实验O/129敏感试验
初步报告、菌种保存
一、采样
（一）水样便采取1-2毫升，成形便采取指甲大小的粪量。
病人呕吐物、沾染粪便的衣物、尸体的肠腔和口腔内容物亦可做为检材；
（二）外坏境样本可采取病人的污染衣物、剩饭菜、可疑食品、抹布、污水、坑塘水、井水、公厕粪便、苍蝇等；
（三）按1：10比例置入碱性蛋白胨水增菌液中，迅速送往实验室。
二、增菌、培养
（一）所有粪便标本都应经过增菌，尤其是恢复期病人、带菌者或用过抗菌药物的病人标本含菌量少，单靠直接分离不易检出。
需经碱胨水37度增菌6-8小时后分离(夏日可将运送时间计算在内)；
（二）标本含菌量少时，为提高检出率可实行2次增菌，取第一次碱胨水增菌后的培养物表层液0.1-0.2毫升，接种于8-10毫升的碱胨水中，37度培养6-8小时后再做分离。
（三）霍乱弧菌好氧，易形成菌膜，故在取出增菌管时动作要轻，接种环于菌膜下取一满环，划线接种于TCBS或4号琼脂平板37℃10~14h孵育培养。
三、快速诊断
（一）、直接镜检：为争取最快速度作出诊断，采取病人“米泔水样”大便或呕吐物，悬滴法镜检（最好用暗视野），可见具有流星状动力的细菌。
（二）、早期玻片凝集试验：埃尔托弧菌在TCBS、4号琼脂及庆大霉素平皿上生长较快，37度培养8-10小时，在其他杂菌尚未生长或长出很小菌落情况下，埃尔托型菌落直径可达1-2mm。
将已长出较大半透明菌落或湿润菌苔的平皿取出，直接用霍乱多价血清做玻片凝集，阳性者可初步报告。
琼脂平皿继续培养，按常规培养时间再做一次复查。
（三）、要求及注意事项：
1．当霍乱弧菌在4号琼脂及庆大霉素培养基上生长过久（超过36小时）时，会出现菌落粘稠、血清凝集假阴性现象。
2．故应取新鲜培养物（10-14小时）作凝集试验，凝集的菌落立即转种营养琼脂平板。
3．小川型菌株有时在稻叶型单价血清中可出现弱凝集，这并非彦岛型，而是小川型含有少量C抗原成分的缘故。
4．有的标本可能同时存在非O1群霍乱弧菌，可疑菌落较多时，应挑选5个以上的菌落逐个进行玻片凝集检查；
5．必要时，取原划线菌苔边缘透明部分再做玻片凝集（对一次流行的首批病人进行检验时尤应注意）。
6．平皿分离未获分散的单个菌落，而在密集部位仍有可疑菌落时，应将该部分再做分离或经增菌后再做分离；
7．从恢复期病人分离出菌落典型但不凝集的弧菌，这时应以霍乱粗糙型血清做玻片凝集，以确定是否为粗糙型或NAG弧菌。
四、初步鉴定试验：
1．氧化酶实验：在非选择性或非鉴别性培养基如营养琼脂的新鲜培养物上滴加氧化酶试剂1滴，并使其流开。
或将菌落用竹签或牙签挑至滴有试剂的滤纸上，在1分钟内出现粉红-紫红-紫蓝色（有的最后呈黑紫色）。
为氧化酶阳性。
肠杆菌科细菌多不变色或变成粉红色后很快退色为氧化酶阴性。
注意事项：试验时避开含铁物质（如接种环）。
不能直接取产酸培养基上的菌落，
不能取含还原剂的培养基及含亚碲酸盐培养基上的菌落（亚碲酸盐培养基可抑制氧化酶），以免出现假阳性和假阴性。
2．拉丝实验：在玻片上加一滴试剂，取一接种环被检菌的新鲜琼脂培养物在试剂旁边研磨均匀，再与试剂混合制成浓厚悬液。
阳性者很快（30秒内）由混变清并变得很粘稠，再用接种环挑取时，可以拉出细丝来。
阴性者呈均匀悬液状态，与蒸馏水对照相同。
(古典型、埃尔托型和O139群霍乱弧菌均阳性。
)
3．O/129(二氨基二异丙基喋啶)敏感试验：
用接种环或灭菌棉拭子在含0.5%氯化钠的普通平皿上均匀涂抹待检菌，放上10微克、150微克O/129磷酸盐药敏纸片各一片，37度培养过夜。
凡药敏纸片周围出现抑菌圈者为敏感。
古典型、埃尔托型霍乱弧菌二者均敏感；
O139群霍乱弧菌10微克、150微克均不敏感。
五、初步结果报告
霍乱弧菌以血清学鉴定为主，结合菌落形态、特征和初步生化反应可做出判定。
凡具备弧菌菌落特征、与O1群或O139群多价血清凝集，O1群并可用单价血清分型即可判定。
首例病人应辅以氧化酶、拉丝实验、O/129敏感试验。
基层CDC至此即可上报。
报告名称—“稻叶/小川型O1群埃尔托型霍乱弧菌”或“O139群埃尔托型霍乱弧菌”。