霍乱弧菌的检验程序
传染病检测SOP工作手册-霍乱弧菌[2]
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霍乱弧菌实验室检测SOP手册1.标本的采集和送检1.1.标本的采集：采集标本的好坏，对检验工作的质量影响很大。
为尽快获得细检查结果，应在发病早期、在服用抗菌药物之前尽快采集标本和及时送到检验室。
标本以病人大便为主。
采便方法用灭菌的棉拭采集排出的新鲜大便，亦可用直肠棉拭或用采便管由肛门插入3㎝～5㎝采集。
一般要求水样便采集1ml～3ml，固形便采取蚕豆大小粪量。
有时病人的呕吐物、沾染大便的衣物和尸体的肠内容物亦可作为检材。
带菌者的大便可用棉拭或直肠棉拭采取。
1.2.标本的送检：采取的标本应立即接种培养基，典型病人的水样便含有大量病菌（106/ml～109/ml），可直接做分离培养并同时增菌培养。
不需做直接分离的均可接种碱性蛋白胨水增菌。
并立即送检验室。
1.3.标本运送途中较远，也可将标本放入文腊氏保存液或卡里—布莱尔运送培养基。
标本与保存液的比例为8ml～10ml保存液加1ml～3ml水样便或蚕豆大的固形便。
也可用厚吸墨纸条吸饱水样便放入小塑料袋内封好送检。
送检标本时，必须认真填写送检单，标本必须妥善包装，专人送检，并防止污染，注意安全，送检箱用后要严密消毒。
2.检验方法2.1.培养方法2.1.1.增菌培养：所有标本都应经过增菌，尤其是恢复期病人、带菌者或用过抗生素的病人标本，需增菌后再分离。
碱胨水接种后放37℃6～8小时，夏日可将运送时间计算在内。
保存液内的标本取1ml种入碱胨水中。
培养后慢慢地从碱胨水生长的菌膜下，取一接种环表层培养物接种于4号或庆大霉素琼脂平板。
标本含菌少时，可实行二次增菌。
取第一次碱胨水增菌后的表层液0.1～0.2ml，接种于另一碱胨水中，37℃6～8小时再做分离。
2.1.2.分离培养：急性典型病人标本在增菌的同时直接做分离培养，这样既可缩短检出的时间，还可避免标本中如有不凝集弧菌经增菌后大量繁殖，影响霍乱弧菌的分离。
其它标本均应增菌后再做分离培养。
当前的习惯多为碱性蛋白胨水增菌，再用强选择性培养基分离，37℃12～16小时长出的菌落，可供做玻片凝集用。
霍乱弧菌实验室检验技术
一、霍乱概述 二、霍乱病原学 三、霍乱弧菌常规检验 四、霍乱弧菌的快速诊断 五、霍乱弧菌的噬菌体-生物分型 六、霍乱菌株的管理、保存与上送
2024/1/3
一、霍乱概述
霍乱是由01群和0139群霍乱弧菌 （V．cholerae）引起的急性肠道传染 病，发病急、传播速度快、波及范 围广、危害严重的甲类传染病。
2024/1/3
必须注意同一样品中O1、O139群霍乱弧 菌可能同时存在，有必要对所有选出的 菌落都进行凝集试验。
提倡所选菌落先经纯培养后再作相关鉴 定，除非情况特殊，一般不提倡直接使 用疑似菌落作玻片凝集。尤其对于TCBS.
如从分离培养基上直接挑取单个菌落进 行血清凝集试验，可能会有假阴性或假 阳性的出现，应谨慎判断结果，特别是 外环境样品。
挑取可疑菌落作玻片凝集
– 与O1群多价和单价血清作玻片凝集反应 – 与O139群抗血清做凝集反应
2024/1/3
血清鉴定：自分离培养基上挑取可疑菌 落与01群霍乱弧菌多价/单价诊断血清及 0139群霍乱弧菌诊断血清做玻片凝集试 验。玻片凝集用血清的效价一般应为 1∶40～1∶50。如可疑菌落在血清中很 快(一般在10s内)出现肉眼可见的明显凝 集，在生理盐水中不凝集者判为阳性。 可疑菌落较多时，应挑选5个以上的菌落 逐个进行玻片凝集检查，必要时，取原 划线菌落边缘透明部分再做玻片凝集， 均为阴性时方可报告未检出01群及0139 群霍乱弧菌。对首发病例菌株需送上一 级实验室做进一步鉴定或复查。
强调在选择培养上发现疑似菌后，首先 考虑进行01/0139群霍乱弧菌的玻片凝集 试验。必须从平板上各挑取5个以上的 （少于5个的全部挑取）疑似菌落进行 01/0139群霍乱弧菌玻片凝集试验。
不同类型的平板上，菌落形态有不同的 特征-----选择你最有把握的。
临床检验技师-微生物检验(2019)讲义第十五章_弧菌科及检验
第十五章弧菌科及检验本章内容一、弧菌属（一）霍乱弧菌（二） O139 型霍乱弧菌（三）副溶血性弧菌（四）其他弧菌二、气单胞菌属与邻单胞菌属（一）气单胞菌属（二）邻单胞茵属革兰阴性直杆菌或弧菌有极端鞭毛氧化酶阳性动力阳性发酵葡萄糖弧菌属——分类根据细菌的抗原性、生化特性、DNA同源性、致病性和耐盐性等将弧菌分为四类：① O1群霍乱弧菌；②不典型O1群霍乱弧菌 : 能被 O1群血清凝集但不产生致病毒素；③非 O1 群霍乱弧菌；④其他弧菌：包括副溶血性弧菌、溶藻弧菌、河弧菌、创伤弧菌、麦氏弧菌和拟态弧菌。
大多数为非病原菌，对人类致病的主要有霍乱弧菌和副溶血性弧菌，分别引起霍乱和食物中毒。
霍乱弧菌——生物学特性形态与结构形态：弧形或逗点状，“鱼群状”。
人工培养后呈杆状。
染色： G-。
特殊结构：有菌毛，无芽胞，部分有荚膜。
一端有一根粗而长的鞭毛，悬滴观察可见穿梭样或流星状运动。
·培养特性营养要求：不高，可无盐生长。
气体环境：兼性厌氧。
菌落特征：耐碱不耐酸。
pH8.5 的碱性蛋白胨水：培养6～ 9h，增菌形成菌膜。
碱性琼脂平板：较大圆形扁平、无色透明或半透明似水滴状菌落。
硫代硫酸盐 - 柠檬酸盐 - 胆盐 - 蔗糖琼脂平板（ TCBS）：较大黄色菌落。
亚碲酸钾琼脂平板：还原亚碲酸钾成金属碲，使菌落中心呈灰褐色。
庆大霉素琼脂：形成的菌落中心呈灰褐色。
·抗原·变异性：有形态变异、菌落变异、溶血性变异和毒力变异。
霍乱弧菌——微生物检验及鉴定·标本采集：以粪便（米泔水样便）为主，尽可能在用药之前采取。
及时接种适宜培养基。
常用的保存或运送培养基有碱性蛋白胨水、文- 腊二氏保存液和卡 - 布运送培养基等。
·形态学检查：①动力观察：米泔水样粪便悬滴观察可见流星或穿梭状运动的细菌。
②制动试验：加霍乱多价诊断血清后弧菌凝集，运动停止。
③涂片染色：革兰染色，观察革兰染色阴性呈鱼群状排列的弧菌。
弧菌科
不耐热的H抗原
为共同抗原
耐热的O抗原
具有群特异性和型特异性，是霍乱弧菌分群和 分型的基础
分型
根据O抗原的不同，现有155个血清群 O1群、O139群引起霍乱
O139血清群的抗原编码基因中出现了36kb的新基因 缺少了O1群高分子量的O抗原侧链 与O1群抗血清无交叉反应，但可与O22血清群和 O155血清群产生交叉反应，遗传学特征和毒力基因 与O1群相似。
培养特性
TCBS琼脂平板: 0.5~2.0mm大小，蔗糖不发酵而呈蓝绿色菌落 普通血平板: 不溶血或只产生α溶血 从腹泻患者中分离到的菌株95%以上在我妻（wagatsuma）琼脂上产生 β溶血现象，称为神奈川现象（Kanagawa phenomenon, KP） 嗜盐性选择平板: 较大，圆形，隆起，稍浑浊，半透明或不透 明，无粘性
（二）生物学特性
1. 形态
革兰阴性杆菌，有鞭毛（极单毛），无荚膜， 无芽胞
2. 抗原结构
耐热的菌体（O）抗原，具有群特征性，副溶 血性弧菌的O抗原有13种 鞭毛抗原，不耐热，无型特异性
3．培养特性
营养要求不高 在无盐培养基上不能生长，最适合生长的 氯化钠浓度为3.5%，超过8%不能生长 最适pH为7.7~8.0，但pH9.5时仍能生长， 最适生长温度为30~37℃ 在碱性胨水中经6~9h增菌可形成菌膜
用于霍乱弧菌的鉴别试验
霍乱红试验 霍乱弧菌有色氨酸酶和硝酸盐还原能力。 霍乱弧菌和其他弧菌均有此种反应 粘丝试验（String Test） 弧菌属细菌除副溶血性弧菌部分菌株外，均有此反应 O/129敏感试验 O/129 （2，4－Diamino－6，7－Diisopropylpteridine，2，4二氨基 －6，7－二异丙基喋啶） 10μg及150μg纸片周围出现任何大小的抑菌环均为敏感。 O1群和非O1群霍乱弧菌均敏感。 但已有对O/129耐药的菌株出现。用此试验作鉴定时，需特别谨 慎。需结合其他试验结果如耐盐生长试验等综合考虑
霍乱弧菌检测方法 文档
霍乱弧菌的检测霍乱弧菌相关知识：稻叶型（A、C）古典型小川型（A、B、C少量）O1群霍乱弧菌：彦岛型（A、B、C）稻叶型（A、C）艾尔托型小川型（A、B、C少量）彦岛型（A、B、C）实验室准备：1.培养基：碱性蛋白胨水、TCBS、4号或庆大霉素琼脂、营养平板、半固体菌种保存管。
2.试剂：拉丝实验用试剂（0.5%去氧胆酸钠水溶液）、氧化酶试剂（1%盐酸对氨基二甲基苯胺或盐酸对氨基四甲基苯胺水溶液。
3.诊断血清：O1群霍乱诊断血清、稻叶型霍乱血清、小川型霍乱血清、O139群霍乱血清。
4.快诊试剂：O1群霍乱胶体金标记快诊卡、O139群霍乱胶体金标记快诊卡。
霍乱弧菌检验流程图：标本37度6-8小时TCBS、4号或庆大霉素琼脂小时胶体金快诊卡/制动等试验血清学凝集试验氧化酶实验拉丝实验O/129敏感试验初步报告、菌种保存一、采样（一）水样便采取1-2毫升，成形便采取指甲大小的粪量。
病人呕吐物、沾染粪便的衣物、尸体的肠腔和口腔内容物亦可做为检材；（二）外坏境样本可采取病人的污染衣物、剩饭菜、可疑食品、抹布、污水、坑塘水、井水、公厕粪便、苍蝇等；（三）按1：10比例置入碱性蛋白胨水增菌液中，迅速送往实验室。
二、增菌、培养（一）所有粪便标本都应经过增菌，尤其是恢复期病人、带菌者或用过抗菌药物的病人标本含菌量少，单靠直接分离不易检出。
需经碱胨水37度增菌6-8小时后分离(夏日可将运送时间计算在内)；（二）标本含菌量少时，为提高检出率可实行2次增菌，取第一次碱胨水增菌后的培养物表层液0.1-0.2毫升，接种于8-10毫升的碱胨水中，37度培养6-8小时后再做分离。
（三）霍乱弧菌好氧，易形成菌膜，故在取出增菌管时动作要轻，接种环于菌膜下取一满环，划线接种于TCBS或4号琼脂平板37℃10~14h孵育培养。
三、快速诊断（一）、直接镜检：为争取最快速度作出诊断，采取病人“米泔水样”大便或呕吐物，悬滴法镜检（最好用暗视野），可见具有流星状动力的细菌。
霍乱弧菌的微生物学诊断检查方法
霍乱弧菌的微生物学诊断检查方法微生物学诊断由于霍乱流行迅速，且在流行期间发病率及死亡率均高，危害极大，因此早期迅速和正确的诊断，对治疗和预防本病的蔓延有重大意义。
直接镜检采取病人“米泔水样”大便或呕吐物。
镜检（涂片染色及悬滴法检查）观察细菌形态，动力特征。
细菌分离培养可将材料接种至碱性蛋白胨水37℃培养6～8小时后，取生长物作形态观察，并转种于碱性平板作分离培养，取可疑菌落作玻片凝集，阳性者再作生化反应及生物型别鉴定试验。
特异性制动试验取检材或新鲜碱性蛋白胨水培养物一滴，置于载玻片上，再加霍乱弧菌多价诊断血清，加盖玻片，用暗视野镜观察，3分钟内运动被抑制的即为阳性，此法优点是快速而特异操作简便，但必须有数量较多的弧菌才检出。
免疫荧光试验除一般免疫荧光法外，还可用荧光菌球法检查。
1.标本采集和运送:霍乱是烈性传染病,凡在流行季节和地区有腹泻症状的患者均应快速准确作出病原学诊断.在发病早期,尽量在使用抗菌药物之前采集标本.可取患者”米泔水”样便,也可采取呕吐物或尸体肠内容物,或采取肛门试子.标本应避免接触消毒液,采取的标本最好就地接种碱性胨水增菌,不能及时接种者可用棉签挑取标本或将肛门试子直接插入卡-布运送培养基中.送检标本装在密封,不易破碎的容器中,置室温由专人输送.甘油盐水保存液不适合于弧菌的运送.2．标本直接检查:荚膜肿胀试验：特异性抗血清与相应细菌的荚膜抗原特异性结合形成复合物时，可使细菌荚膜显著增大出现肿胀的试验常用于肺炎链球菌、流感嗜血杆菌等的检测革兰染色：革兰染色过程所用四种不同溶液和作用：1、碱性染料这在简单染色中已讨论过，此处用结晶紫。
2、媒染剂其作用是增强染料与细菌的亲和力，更好地加强染料与细胞的结合。
常用的媒染剂是碘液。
3、脱色剂帮助染料从被染色的细胞中脱色。
利用细菌对染料脱色的难易程度不同，而将细菌加以区分。
革兰阳性细菌不易被脱色剂脱色，而革兰阴性细菌则易被脱色。
常用的脱色剂是丙酮或乙醇，这里所用的是95%的乙醇。
霍乱弧菌的检验程序
霍乱弧菌的检验程序临床细菌实验室接到高度疑似患者标本，应尽快地进行检验。
具体处理方法如下。
1.临床标本（患者排泄物、呕吐物、肛拭、肛管内容物及残留、剩余食物等）直接涂片，观察动力，再做制动试验以及革兰染色，镜检发现革兰阴性、细小、直的、微弯、逗号状的杆菌。
疑似者即予电话报告2.标本直接接种：①血琼脂平板；②弧菌鉴别性平板（4号琼脂平板、碱性琼脂平板）；③接种碱性胨水3.保留原始标本（不可置于冰箱冷藏）4.35℃孵育上述所有平板及胨水5.6~8h后：①取碱性胨水培养物涂片（直接观察动力、做制动试验）染色镜检；②移种鉴别性琼脂平板和血琼脂平板；③霍乱红试验；④观察血琼脂平板，见有微小菌落生长。
立即涂片染色，霍乱多价血清凝集，氧化酶试验。
如符合霍乱弧菌的推断性鉴定，可作出早期初步报告。
6.继续孵育过夜后，做玻片凝集试验。
自分离平板上挑取可疑菌落与霍乱多价诊断血清做玻片凝集试验，所用血清的效价应在1：80～1：160，如过浓，则稀释后再做凝集。
将稀释血清滴加在洁净的载玻片上，挑取可疑菌落混悬于血清内，即刻（一般不超过10s）出现肉眼可见的明显凝集者为阳性。
菌落应以生理盐水作对照，不发生凝集。
为了提高阳性检出率，应多挑可疑菌落进行玻片凝集。
将O1群霍乱多价血清凝集阳性菌落再做氧化酶、涂片染色镜检，初步推断性鉴定，将此高度疑似菌株，报告当地疾病控制中心做最后鉴定。
霍乱弧菌的检测1.涂片检查：取新鲜送检标本涂片2张，干燥后，用乙醇或甲醇固定，分别用革兰染色剂1：10稀释的石碳酸复红染色，用油镜检查，观察有无革兰阴性呈鱼群排列的弧菌。
悬滴检查：取患者粪便，制成悬滴标本或圧滴标本，检查细菌的动力，霍乱弧菌古典型和EL-Tor型常呈穿梭状及活泼的活动，在悬滴涂片中加O1群霍乱弧菌诊断血清后，在显微镜下观察，若原运动活泼的现象停止，为制动试验阳性。
2.培养：取疑似患者粪便直接接种于碱性蛋白胨水中，进行增菌，同时划线接种于碱性琼脂平板或TCBS平板及血液琼脂平板，孵育于35℃。
霍乱弧菌实验室检测
分离培养（两管两板法）：
接种后的碱性蛋白胨水37℃培养过夜，取菌膜下表层培养物接种选择性培养 基（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板）．同时吸0.1～0.2 ml表层培养物转种于 10ml碱性胨水管中作二次增菌，37℃培养6～8h再划线接种于选择性培养基
平板分离及可疑菌落挑取
平板分离
选择性分离平板应采用9cm分离平板（不建议采用7cm平板），一个平 板分离一个样品（严禁一个平板分离2份或以上样品！！ ）。 样品平板分离时应进行分区划线分离，平板分离的单个菌落数量应该达到 50个以落挑取
经典的鉴定步骤要求每个平板应挑取5个以上可疑菌落,转种于克氏双糖斜 面或者普通琼脂斜面待分纯培养后,再进行O1、O139群血清玻片凝集试验， 鉴于对霍乱疫情应急处理的考虑,现大多数监测实验室一般采用将血清玻片 凝集试验前置的做法,作为快速筛查的手段,直接对平板上生长的单个可疑菌 落进行玻片凝集试验,出现明显凝集时可做初步报告,对平板上出现可疑凝集 的菌株必须马上转种于克氏双糖斜面或者普通琼脂斜面,待纯培养物生长良 好后再次进行玻片凝集试验加以确证。 庆大霉素平板和4号琼脂：多呈半透明状，菌落中央常呈灰色或灰黑色，并 随培养时间的延长而加深（由于这类培养基均含有亚碲酸盐成份）。 TCBS（硫代硫酸盐枸櫞酸盐胆盐琼脂）：菌落生长呈黄色发亮、表面光滑、 润湿、稍凸起、边缘整齐。 （TCBS平板生长的菌落不能直挑取进行玻片凝 集试验，需按经典方法进行纯培养后再进行玻片凝集试验）
分离培养要点（两管三板法）：
挑取粪便，直接接种于碱性蛋白胨水（第一管）中，同时划线分离选择 性平板（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板，第一板）。 第一管碱性蛋白胨水在３７ ℃增菌６－８小时，沾取菌膜下表层液体， 划线分离选择性平板（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板，第二板），同时吸取 0.1～0.2 ml表层培养物，接种碱性蛋白胨水（第二管）。 第二管碱性蛋白胨水增菌１８小时后划线分离选择性平板（庆大／四号 ／ＴＣＢＳ平板，第三板）。
霍乱弧菌检测的方法与结果探究
霍乱弧菌检测的方法与结果探究摘要目的：探究分离培养法和胶体金免疫层析法，两种霍乱弧菌检测方法和结果差异。
方法：从2015年至2016年，选取608例霍乱弧菌样本，同时使用分离培养法和胶体金免疫层析法进程检测，并就两种方法的结果符合率进行比较。
致性为优，符合率定位100%。
结果：608例霍乱弧菌样本中，培养法阳性20例，胶体金免疫层析法检测结果与培养法一致为阳性；培养法阴性588例，胶体金免疫层析法检测585例为阴性，3例为阳性，经培养法复核，确定3例为阴性。
结论：胶体金免疫层析法作为一种新兴的霍乱弧菌检测方法，可以快速完成霍乱弧菌的检测，且具有较高的准确性，将其应用于霍乱弧菌检测，可有效提高疫情防控质量。
关键词霍乱弧菌；检测的方法；结果霍乱弧菌（V.cholera）是霍乱的病原体，属于弧菌科，是革兰氏阴性菌的一种。
霍乱弧菌主要分为埃尔托生物型（EL-Tor bio-type）和古典生物型（Classical biotype）两种。
培养法是卫生部规定的霍乱弧菌标准方法，适用于各种霍乱弧菌标本，检测结果准确、可靠，但整体检测时间相对较长。
近几年，胶体金免疫层析法被提出用于霍乱弧菌标本检测，与培养法相比，胶体金免疫层析法检测更加快速。
本文针对两种检测方法进行对比，实验结果如下。
1材料与方法1.1材料pH8.6碱性蛋白胨水（杭州微生物试剂厂）；TCBS（硫代硫酸盐枸橼酸盐胆盐琼脂）；霍乱弧菌O1群多价血清和小川稻叶O139分型血清（浙江省疾病预防控制中心）；霍乱弧菌胶体金免疫快速检测卡（郑州博赛生物技术有限公司）。
所有试剂均在有效期以内。
1.2样本来源本组试验中608例霍乱弧菌样本，均收集于疑似霍乱感染者粪便以及霍乱疫情采集标本。
试验中检测为阳性的霍乱弧菌样本，均送至相关疾病预防控制中心进一步确认（其中呕吐物2份，肛拭18份）。
其余腹泻患者肛拭988分，均通过培养法检测验证为阳性。
1.3方法根据《霍乱防治手册》（第五版）规定进行病原菌分离培养和血清鉴定；胶体金免疫层析法操作方法如下：一，采取适量以增菌的碱性蛋白胨水滴入检测卡中，均匀摇晃，观察5min内的试验结果。
微生物检验11
弧菌科
一群菌体短小、弯曲成弧形或直杆状的 革兰阴性细菌 兼性厌氧，发酵葡萄糖，许多菌株生长 需要2%~3%氯化钠 需要2%~3%氯化钠 大多数菌株氧化酶阳性 具有一端单一鞭毛、运动迅速 弧菌科细菌广泛分布于自然界，以水中 最为多见。其中有一些种对人类致病。
弧菌科( 弧菌科(Vibrionaceae)
1.形态 1.形态
新从患者标本中分离出的细菌革兰染色阴性， 弧形或逗点状 在患者“米泔水” 在患者“米泔水”样便中，可呈头尾相接的 “鱼群”样排列 鱼群” 菌体一端有鞭毛，悬滴观察时呈“穿梭” 菌体一端有鞭毛，悬滴观察时呈“穿梭”样运 动 有普通菌毛和性菌毛 O139群有荚膜 O139群有荚膜
2. 抗原成分
3.标本直接检查 3.标本直接检查
涂片染色镜检 取标本直接涂片，固定染色。油镜观察有无“鱼群” 取标本直接涂片，固定染色。油镜观察有无“鱼群”样排列的革兰阴 性弧菌 动力和制动试验 直接取“米泔水”样便，制成悬滴(或压滴)标本后， 直接取“米泔水”样便，制成悬滴(或压滴)标本后，在暗视野或相差 显微镜下直接观察呈穿梭样运动的细菌。 显微镜下直接观察呈穿梭样运动的细菌。 同法重新制备另一标本涂片，在悬液中加入1滴不含防腐剂的霍乱多 同法重新制备另一标本涂片，在悬液中加入1 价诊断血清(效价≥1：64)。 价诊断血清(效价≥1：64)。可见最初呈穿梭状运动的细菌停止运动并 发生凝集，则为制动试验阳性。 发生凝集，则为制动试验阳性。可推定为霍乱弧菌存在 快速诊断 通过直接荧光抗体染色和抗O1群抗原的单克隆抗体凝集试验 群抗原的单克隆抗体凝集试验， 通过直接荧光抗体染色和抗O1群抗原的单克隆抗体凝集试验，能够 快速诊断霍乱弧菌感染 霍乱毒素的测定 用改良的ELISA法 将纯化的GM1包被 以俘获标本中的CT。 包被， 用改良的ELISA法，将纯化的GM1包被，以俘获标本中的CT。或采 用乳胶凝集测定CT， 用乳胶凝集测定CT，有较高的灵敏度和特异性
霍乱弧菌采样及快速检测操作注意事项
霍乱弧菌采样注意事项
一．尽早采样，最好在用药前。
二．采样量要足够，固体粪便1-2g，液体粪便1-2ml放入10ml 碱性胨水中。
三．采样时要填写送检单，内容包括患者姓名、性别、年龄、采样日期、送样单位、送样人。
四．采样后专人及时送检，防治污染。
霍乱弧菌快速检测操作及注意事项
一、操作步骤：
1、待检试纸条置于洁净干燥的工作台上
2、用干净的吸管或加样器吸取样品或增菌样品2-3滴，滴加到检测条样品加入端（白色端），开始计时。
3、2-15分钟内观查结果。
15分钟后结果不计。
二、结果判断：
阴性：一条红线出现，即质控线
阳性：两条红线出现，即检测线（中间）和质控线
无效：无红线出现
三、样品处理
1、直接检测：水样便
2、增菌检测：1-2ml接种至10ml碱性胨水中。
37℃6-8
小时或过夜。
3、水样、食品标本略。
四、注意事项
1、检测试纸条4-30℃阴凉避光干燥处保存，注意防潮，有效期一年。
2、用新鲜标本，不得使用陈旧标本。
3、加样时用干净吸管或干净加样器加样，若将检测条直接浸入样品中不得超过0.5cm。
4、实验后彻底消毒污染区及具有传染可能的污染物。
霍乱弧菌检验程序
霍乱弧菌检验程序霍乱弧菌检验程序一、检查对象一天内腹泻三次或三次以上的病人。
二、标本采集及处理1、采集时间：在未服用抗生素前采样。
2、采集方式：用棉拭子或采便管从肛门插入直肠3—5厘米取样，必须看到有粪便黏附才可：对于自然排出的水样便、呕吐物及保存液保存的标本可直接接种分离或吸取0.5ML、成形大便取黄豆左右大小。
3、标本送检：标本采集后应立即送检。
若不能立即送检，可保存于碱性蛋白胨水中尽快送检验。
24小时以上才能送检的标本，应使用文一腊二氏保存液保存。
4、标本处理：将标本直接分离接种于4号琼脂及放入8—10ML碱性蛋白胨水中增菌。
“两管三板”：送检标本马上接种一个4号琼脂平板、同时碱性蛋白胨水培养管增菌；—8小时后接种增菌管内标本于第二块4号琼脂平板，同时转种第二管碱性蛋白胨水；6—8小时后继续接种第二管碱性蛋白胨水的标本于第三块4号琼脂平板上。
三、检验程序：1、弧菌形态：弧菌生长快、菌落大、培养4—5小时，原划线处有菌苔生长，8—10小时可长出小菌落，16小时菌落直径可达2毫米。
菌落略带灰色、半透明、扁平、稍隆起、光滑湿润，培养时间延长或室温放置后，菌落略带黄色，中心厚而周围透明，培养基含亚碲酸钾使得菌落成灰色，中心形成黑色金属碲沉淀。
在平皿上挑取典型菌落做玻片凝集试验。
2、玻片凝集试验：首先要注意抗原抗体比例和保证抗原（菌株）的纯洁性，使用O1群和O139群两种诊断血清。
如未获单个菌落，可挑取可疑菌苔边缘透明部分做玻片凝集。
注意，凝集的菌落应以生理盐水作对照，检查有无自然凝集；然后用此玻片显微镜下看动力（动力活泼如流星样）；再将此玻片革兰氏染色看弧菌形态。
3、弧菌分型：稻叶型和小川型诊断血清做玻片凝集试验进一步分型。
四、报疫程序：一旦发现阳性可疑标本立即用铁罐保存，通知送检科室，确认病人资料；上报医院总值班2460或2560，派车送海珠区防疫站确证。
五、标本处理：发现Ⅱ号菌阳性可疑标本，即送标本往防疫站确认。
霍乱弧菌检测
1、古典生物型（前六次大流行）
2、E1 Tor 生物型（第7次 1961年来）。
两个生物型具有相同的血清型。我国流行以 El Tor霍乱弧菌为主。
霍乱弧菌古典生物型和 El-Tor生物型的区别
特征
古典生物型
羊红细胞溶血
-
鸡红细胞凝集
-
VP 试验
-
CAMP 试验
-
多粘菌素 B 敏感试验
+
Ⅳ组噬菌体裂解
快速诊断
标本
增菌培养 碱性蛋白胨水
分离培养（TCBS、碱性平板） 血清学鉴定 初步报告
生化鉴定分型 确诊报告
直接涂片 动力、制动试验
霍乱弧菌（V.cholera）是人类霍乱的病原 体，霍乱是一种古老且流行广泛的烈性传 染病之一。曾在世界上引起多次（7次）大 流行。
主要表现为剧烈的呕吐、腹泻、失水，死 亡率甚高。属于国际检疫的烈性传染病。
霍乱弧菌属于弧菌科弧菌属，革兰染色阴性 菌体短小，稍弯曲，两端钝圆，长1.5～ 2.0µm,宽0.3～0.4µm 。
样品分别接种一个9cm 直径的庆大霉素琼脂 或TCBS 琼脂平板和一个碱性琼脂平板进行划 线分离培养。
同时，以无菌吸管吸取0.2-0.5ml 增菌液接种 到新的碱性蛋白胨水中，进行二次增菌培养后， 再如上述步骤进行划线分离培养。
特别强调所有环境样品的增菌分离培养步骤必 须包括上述二次增菌和强、弱双平板分离。
用于霍乱弧菌的鉴定试验有：①霍乱红试验:霍乱弧菌的 两种生物型均呈阳性反应，但是，本反应并非霍乱弧菌 特有，许多能分解色氨酸和还原硝酸盐的细菌，均能产 生阳性反应；②糖发酵试验:霍乱弧菌分解葡萄糖、蔗糖、 甘露醇产酸不产气，不发酵阿拉伯糖；③粘丝试验:弧菌 属细菌除副溶血弧菌部分菌株外，均有此反应；④ O/129敏感试验：参照药敏试验方法进行。将O/129 10μg和150μg的纸片贴在接种有待测菌的琼脂平板上， 35℃孵育18～24h后，纸片周围出现任何大小的抑菌环 均为敏感；O1群和非O1群霍乱弧菌均敏感，但已有对 O/129耐药的菌株出现；O139群对O/129耐药，用此 试验作鉴定时需特别谨慎，需结合其他试验结果加以综 合考虑；⑤耐盐试验:霍乱弧菌可在不含氯化钠和含有6 ％氯化钠培养基中生长，氯化钠浓度高于6％则不生长。
荧光PCR检测霍乱弧菌流程与方法
荧光PCR检测霍乱弧菌流程与方法霍乱弧菌是引起人类霍乱的病原菌.也是我国传染病防治法规定的甲类传染病病原之一作为国际检疫传染病——霍乱的病原诊断.以检出O。
群霍乱弧菌或O。
剪群霍乱弧菌为准。
O.群霍乱弧菌可再分为古典生物型和埃尔托生物型埃尔托霍乱弧菌在外环境水源中长期存在.特别是在水体PH值为7.6—8.5、水温26—32cI=、氯化物260—278mg ／L的条件下抵抗力强.生长良好。
水体及水产品中的甲壳类、贝壳类、鱼类及两栖类水生动物(牛蛙、蟾蜍)等易受霍乱弧菌的污染。
1样品、材料和仪器1.1样品为水样和鱼1.2营养肉汤、营养琼脂、碱性蛋白胨水、PH8.4的庆大霉素琼脂培养基来源于北京陆桥技术有限责任公司。
I.3霍乱O。
群多价诊断血清、小川型血清、稻叶型血清、O。
剪群血清为兰州生物制品研究所产品。
1.4API20E编码及配套生化反应板为法国生物一梅里埃公司的产品。
1.5霍乱弧菌O，菌群实时荧光PCR检测试剂盒及霍乱弧菌通用型实时荧光PCR检测试剂盒为深圳太太基因工程有限公司研制1.6荧光PCR仪：博日FQD一33A2操作步骤2.1细菌的分离培养、玻片凝集及血清分型严格按照SN／T1239—20o3《国境口岸霍乱检验规程》来进行。
2.2API鉴定将营养琼脂平板上的纯菌落用API20E试验条进行鉴定根据说明表读反应.参照鉴定表、分析图索引和APILAB软件得到鉴定结果。
2.3实时荧光PCR检测霍乱弧菌按照深圳太太基因工程有限公司提供的试剂盒方法来进行。
2.3.1增菌液处理(样本处理区)取待测样本增菌液lml到1.5Hll无菌离心管中.8000rpm离心5min，尽量吸弃上清：加入50ulDNA提取液，混匀后沸水浴5min.13000rpm离心5min.取上清保存于一20cI=备用以待检测2.3.2扩增试剂准备(PCR前准备区、从试剂盒中取出PCR反应液.室温融化并振荡混匀.取出Taq酶及UNG酶.第一次使用时2000rpm 离心10s.以收集粘在管壁上的酶贮液设所需要的PCR反应管管数为nfn=1管阴性对照+1管阳性对照+样本数1，每个测试反应体系配制如下表：表1测试反应体系配制堕型垦生!竺璺竺用量(u1)22，50.50,06计算好各试剂的使用量.加入一适当体积离心管中.颠倒混匀.2000rpm离心10s.向设定的n个PCR反应管中分别加入23u1..转移至样本处理区。
霍乱弧菌实验室检验技术
抗原构造
O139群霍乱弧菌不被已知的O1-O138群霍乱弧 菌诊断血清所汇集。表明本菌的抗原性与O1群 和其它非O1群霍乱弧菌有明显区别。 革兰氏阴性菌的抗原性都是由细胞壁的脂多 糖（LPS）所决定。通过对O139群霍乱弧菌的 LPS进行化学分析和血清学分析后发现O139群 霍乱弧菌缺少O1群霍乱弧菌LPS中的特异性成 分。 通过两者进行提取其LPS然后进行被动溶血试 验与被动溶血抑制试验检测，结果显示两者抗 原性有显著不同。O139群霍乱弧菌有荚膜而 O1群霍乱弧菌无荚膜。
2012-5-4
两者不同点：
群所致病中有44 O139群所致病中有 44.3% 可发生腹部痉 139 群所致病中有 44. 也有引起严重粘液性腹泻的， 挛 ， 也有引起严重粘液性腹泻的 ， 进入 外周血液可引起发热， 外周血液可引起发热 ， 出现菌血症或败 血症。 印度出现20 例病人中有17 例发热、 20例病人中有 17例发热 血症 。 印度出现 20 例病人中有 17 例发热 、 白细胞增多。 白细胞增多 。 而 O1 群引起的病人未曾见 过。 鉴别两者， 必须通过血清学诊断 来区分。 血清学诊断来区分 鉴别两者 ， 必须通过 血清学诊断 来区分 。 22群与 139群血清有交叉汇集反应 群与O 群血清有交叉汇集反应， O22群与O139群血清有交叉汇集反应，必 须用O22群弧菌吸收 群弧菌吸收， 须用O22群弧菌吸收，去除交叉汇集现象。
病，发病急、传播速度快、波及范 围广、危害严重的甲类传染病。 ♦ 是国内交通检疫传染病之一。 ♦ 也是当今三种国际检疫传染病中最 严重的一种。
2012-5-4
霍乱病原菌发现
♦ 1883年德国科学家Koch发现霍乱弧菌 ♦ 1905年埃及埃儿托检疫站首次分离到
霍乱病原菌检测标本的采集方法、运输和保存
• 5. 海水产品 • 选取活海水产品或涂抹拭子，置于塑料袋 内（拭子标本可按粪便拭子保存运输方法 处置），尽快送往实验室。如在一箱甲鱼 中可采取数只甲鱼的体表作为一个标本送 检，这比只做一只甲鱼体内检查其阳性检 出机会可能更多。霍乱监测时，海水产品 常作为重点采集监测的对象。注意采集过 程中不同食品及不同部位不能交叉污染。
另外霍乱在我国属于传染病法规定的甲类报告管理传染病在卫生部人间传染的病原微生物名录2006年中霍乱弧菌流行株危害程度为第二类属于高致病性微生物级别非流行株危害程度为第三类要求在生物安全ii级实验室bsl2操作病原体
霍乱病原菌检测标本的 采集方法、运输和保存
：
重庆市南岸CDC 许磊
一、标本的采集和送检
生物安全的要求
• 霍乱属于肠道传染病，对实验室操作以及 样品采集等方面的生物安全应按照肠道感 染细菌性疾病的通用生物安全要求。另外， 霍乱在我国属于传染病法规定的甲类报告 管理传染病，在卫生部《人间传染的病原 微生物名录》（ 2006 年）中，霍乱弧菌流 行株危害程度为第二类，属于高致病性微 生物级别（非流行株危害程度为第三类）， 要求在生物安全 II 级实验室（ BSL-2 ）操作 病原体。
• 对于霍乱疫情或疑似霍乱疫情的现场调查 和样本采集过程中，必须注意生物安全防 护，调查采样人员应咨询实验室人员，做 好个人防护以及避免采集标本过程中的感 染以及标本再污染其他物霍乱病例/带菌者/接触者粪便标本时
（三）标本送检程序
• 医院内临床检验标本由专人进行送检，采 样后立即送检到南岸区疾控中心检验科办 理交接手续。
• 粪便标本如果运送时间不超过24h，还 可将其放在碱性蛋白胨水中室温运送。 标本与碱性蛋白胨水的比例为8mL～ 10mL碱性蛋白胨水可加入1mL～3mL 液体便或指甲大小的成形便。过多的 粪便量会降低保存液的pH值。如果没 有合适采便器材以及没有运送培养基 时，可用无菌吸水纸条浸于液体粪便 中，然后将吸水纸条密封于塑料袋中， 放入冷藏箱中运往实验室。
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霍乱弧菌的检验程序
临床细菌实验室接到高度疑似患者标本，应尽快地进行检验。
具体处理方法如下。
1.临床标本（患者排泄物、呕吐物、肛拭、肛管内容物及残留、
剩余食物等）直接涂片，观察动力，再做制动试验以及革兰染色，镜检发现革兰阴性、细小、直的、微弯、逗号状的杆菌。
疑似者即予电话报告
2.标本直接接种：①血琼脂平板；②弧菌鉴别性平板（4号琼脂
平板、碱性琼脂平板）；③接种碱性胨水
3.保留原始标本（不可置于冰箱冷藏）
4.35℃孵育上述所有平板及胨水
5.6~8h后：①取碱性胨水培养物涂片（直接观察动力、做制动
试验）染色镜检；②移种鉴别性琼脂平板和血琼脂平板；③霍乱红试验；④观察血琼脂平板，见有微小菌落生长。
立即涂片染色，霍乱多价血清凝集，氧化酶试验。
如符合霍乱弧菌的推断性鉴定，可作出早期初步报告。
6.继续孵育过夜后，做玻片凝集试验。
自分离平板上挑取可疑
菌落与霍乱多价诊断血清做玻片凝集试验，所用血清的效价应在1：80～1：160，如过浓，则稀释后再做凝集。
将稀释血清滴加在洁净的载玻片上，挑取可疑菌落混悬于血清内，即刻（一般不超过10s）出现肉眼可见的明显凝集者为阳性。
菌落应以生理盐水作对照，不发生凝集。
为了提高阳性检出率，
应多挑可疑菌落进行玻片凝集。
将O1群霍乱多价血清凝集阳性菌落再做氧化酶、涂片染色镜检，初步推断性鉴定，将此高度疑似菌株，报告当地疾病控制中心做最后鉴定。
霍乱弧菌的检测
1.涂片检查：取新鲜送检标本涂片2张，干燥后，用乙醇或甲醇固定，分别用革兰染色剂1：10稀释的石碳酸复红染色，用油镜检查，观察有无革兰阴性呈鱼群排列的弧菌。
悬滴检查：取患者粪便，制成悬滴标本或圧滴标本，检查细菌的动力，霍乱弧菌古典型和EL-Tor型常呈穿梭状及活泼的活动，在悬滴涂片中加O1群霍乱弧菌诊断血清后，在显微镜下观察，若原运动活泼的现象停止，为制动试验阳性。
2.培养：取疑似患者粪便直接接种于碱性蛋白胨水中，进行增菌，同时划线接种于碱性琼脂平板或TCBS平板及血液琼脂平板，孵育于35℃。
增菌培养孵育6h后，取表面菌膜移种于上述平板上，进行分离培养，并同时涂片，革兰染色和悬滴标本，检查形态及活动力。
各种分离培养的平板在孵育18~24h后观察菌落，挑取可疑菌落，先与生理盐水混匀，观察有无自凝现象。
再用O1群霍乱多价血清做玻片凝集试验，立即出现明显凝集者为阳性，有条件者再做血清分型。
如在选择培养基生长典型菌落，运动活泼呈穿梭状，氧化酶
阳性的革兰阴性弧形菌并与霍乱多价诊断血清凝集者，可判定为O1群霍乱弧菌。
在霍乱流行期间，根据上述结果并结合临床即可对病人作出霍乱病的早期诊断。
并立即向当地疾控部门报告信息。
注：霍乱弧菌诊断血清试剂的使用方法
于洁净玻片上滴1滴血清，然后取少量被检菌落与血清混匀，轻轻摇动玻片，1分钟内肉眼判断结果，试验应以生理盐水做阴性对照。
检验结果的解释：于1分钟内呈明显凝集者为阳性，呈均匀浑浊者为阴性。