霍乱弧菌的实验室

标本采集，送检和保存 霍乱的病原学检查 病原分离技术要点
标本采集，送检和保存



粪便：标本的采集以病人粪便为主，水样便采取1-3ml.成 形便采取指甲大小的粪便，亦可用直肠拭子（要求棉拭子 插入直肠3-5cm处采取）。接种于碱性胨水培养基，37增 菌6-8h后，划线接种于4号琼脂培养基。 如是高度怀疑的疑似病人或急诊病人可在接种碱性胨水培 养基的同时直接再接种于4号琼脂培养基一个。 不能立即检查的，要把采集标本放入碱性胨水培养基或文 腊二氏保存液或采集标本插入Cary-Blair半固体保存培养 基中。
霍乱菌株的管理，保存与上送




对首发病例分离的霍乱菌株需送上一级实验室作进一步鉴 定或复合。 送前应按要求完成相应霍乱弧菌的常规鉴定：o1/o139群 霍乱诊断血清玻片凝集试验，革兰氏染色与形态，氧化酶 试验，动力观察等。 按《感染人类高致病微生物菌毒种或标本运输管理规定》 要求，存放菌种，常温下运输。 送交上一级CDC复核鉴定前，应填写好菌种转送记录单。

病原分离技术要点



霍乱是烈性传染病，对首发病人的病原学诊断要做到快速， 准确并及时作出检测报告（阳性报告不超过24h) 因是用玻片凝聚试验作出鉴定，所以要求平板分离要有单 个菌落，要求用9cm的平板分离，不允许9cm的平板分离 二份以上样品。 因o139和o1群抗原性不一样，所以血清凝集必须要分别 用用o1群霍乱弧菌多价诊断血清和o139群诊断血清作玻 片凝集试验，不能只用一个，同时要作生理盐水对照。
霍乱弧菌的病原学特点
-形态与染色： 弧状或逗点状 -革兰染色阴性 有一根单鞭毛，细菌运动非常活跃，呈鱼 群穿梭样或流星状 -培养特性：营养要求不高，生长较快，兼性厌氧。 最适生长温度为37 ℃ ， 怕酸嗜碱，最适pH7.2-7.4, PH7.4-9.6快速生长 O抗原：耐热，耐受100℃2h,特异性高，分群 和分型的基础。 H抗原：不耐热，特异性低
℃
- 抗原性
-生化反应：发酵葡萄糖，甘露醇，蔗糖，产酸不产气
霍乱红试验（+） o/129敏感试验（+） 赖氨酸，鸟氨酸脱羧酶（+） 精氨酸双水解酶（-） 氧化酶（+）粘丝试验（+）
-致病性：侵袭力 （鞭毛
菌毛）
霍乱肠毒素 -抵抗力：水中存活20天，怕酸耐碱，庆大霉素耐药 -消毒： 漂白粉
霍乱弧菌常规检验
谢谢
疑似病人或急诊病人如何处理




如是高度怀疑的疑似病人或急诊病人可在接种碱性胨水培 养基的同时直接再接种于4号琼脂培养基一个。 标本直接涂片，镜检观察有没有呈鱼群穿梭样或流星状运 动活跃的细菌，如有加一滴霍乱诊断血清后再观察细菌运 动情况（3分钟运动被抑制为制动试验+） 标本直接涂片作革兰氏染色，镜检观察弧状或逗点状，革 兰染色阴性的细菌。 如形态典型，运动活泼，制动试验+，可作出疑似初步报 告，报涂片见到xx形态，xx染色性细菌等。--常见于紧急 情况
霍乱病原分离培养及鉴定
鉴定： - 以血清学（玻片凝集）为主，结合形态学，生化反应作出 判断。 玻片凝聚试验： - 试剂：o1群霍乱弧菌多价和单价诊断血清 o139群诊断血清 - 方法：从分离培养基上挑起可疑菌落分别用o1群霍乱弧菌 多价诊断血清和o139群诊断血清作玻片凝集试验，立即出 现凝集者为阳性，同时设生理盐水对照。
霍乱弧菌抗原结构及分类





抗原结构：霍乱弧菌有耐热的菌体（O)抗原和不耐热的鞭毛（H)抗原， H抗原为霍乱弧菌属所共有，O抗原有群特异性3型特异性两种抗原， 是霍乱弧菌分群和分型个基础。 WHO腹泻控制中心将霍乱弧菌分为三群： -O1群霍乱弧菌：古典生物型和埃尔托生物型。 O1群 的特异抗原有ABC三种，其中A抗原为O1群共有， A与其他B和C结合则可分为三型：原型-AC（稻叶），异型-AB（小 川），中间型-ABC（彦岛） -非O1群霍乱弧菌：H抗原与O1相同，O抗原则不同，可分137个血清 型，一般引起的胃肠型腹泻不作霍乱处理。但O139除外，它在92年 被认定为真正的霍乱弧菌。 -不典型O1群霍乱弧菌：该菌不产生肠毒素，无致病性。
霍乱弧菌的实验室检测
霍乱的流行病学


霍乱的病原菌：霍乱弧菌 是我国《传染病防治法》：甲类传染病（又称2号病）， 是国际检疫的烈性传染病 霍乱：七次世界大流行： 1817-1923年 六次大流行 （均从印度恒河三角洲发源地）~古典生物型； 1961年 第七次大流行 ElTor生物型（我国以ElTor生物 型为主） 1992年 在印度， 孟加拉， 泰国发生的霍乱，分离到菌 株不与O1群霍乱血清凝集，定为O139群，被认为下一次 大流行的主角。浙江省94年发现，
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霍乱病原分离培养及鉴定





选择性的增菌培养基：碱性胨水ph8.5 37增菌培养6-8h后 移种 常用的强选择性培养基： ph8.4-ph8.6 庆大霉素琼脂（GTA） 四号琼脂 硫代硫酸钠盐-枸橼酸盐-胆盐-蔗糖琼脂（TCBS） 弱选择性培养基：（现基本不用） 碱性琼脂，碱性胆盐琼脂 菌落特征：扁平湿润半透明，菌落中心呈灰黑色 生化反应：