罗丹明123
自组装三维BiOCl 多级结构：可调的合成和表征
自组装三维BiOCl 多级结构：可调的合成和表征BiOCl的3D 多级结构组成的二维薄片，互相交叉，在160℃的溶剂热法12小时已成功地合成模板。
三维多级结构的形态和成分特点，通过各种技术进行了调查。
表征结果的基础上，这种三维结构的生长，已经提出了自组装Ostwald熟化过程。
BiOCl纳米片的生长和自组装，可随时调整尿素与BiCl3·5H2O，这生成不同的形态和显微组织的最终产品。
比表面积和孔隙度的3D 多级结构（HAD），BiOCl也进行了调查使用氮吸附和脱附。
紫外光谱显示，带隙能量的3D已经可以从3.05 eV的调整到3.32 EVO。
3D BiOCl 多级结构的准备表明催化活性比在文献报道的高得多的，这是由紫外线照射下降解罗丹明B（罗丹明B）染料的评估。
介绍由于其在在电子，磁性，光电，催化生物医学等领域的潜在应用领域，近年来一直侧重于纳米材料的可控合成形态，方向，维数等，这通常表现出独特的性能。
低维构建模块如纳米粒子，纳米棒，纳米片等等有序自组装成复杂的架构最近已成为材料研究领域热点话题。
高度组织构建模块金属，半导体，聚合物有机- 无机杂化材料，并根据不同的驱动机制生物材料的自组装已经取得了显着进展。
然而，面向装配的纳米构建模块是一般人很难，通常需要模板或基板控制定向生长，它不仅介绍了异构杂质但同时也增加生产成本。
因此，如何开发轻便，温和，易于控制，无模板层次架构与理想和可控形貌，大小和结构的自组装方法具有十分重要的意义。
作为其中最重要的铋卤氧化物氯氧化铋（BiOCl）已作为一种选择性氧化催化剂离子导体，铁电材料，色素等。
最近，它已被发现，可以作为一种光催化剂分解成无机物质有机化合物为纺织染料污染废水净化BiOCl。
例如张和同事报告过，纳米BiOCl更好的表现比二氧化钛（P25，Degussa）上展出的光催化降解甲基橙（MO）染料。
据说，纳米材料的性能在很大程度上取决于大小，形态和维数。
荧光探针汇总
1.Fluo-3 AM （钙离子荧光探针）原理 Fluo-3 AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。
Fluo-3 AM的荧光非常弱，进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fluo-3，从而被滞留在细胞内，和细胞内游离的钙离子结合，结合钙离子后可以产生较强的荧光。
生理意义细胞内钙离子增多是细胞损伤的结果，因此此探针能表征细胞损伤程度激发波长506nm 发射波长 526nm （绿色）备注推荐使用2.Mag-fura-2 AM（钙离子荧光探针）原理Fura-2 AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料。
Fura-2?AM进入细胞后可以被细胞内的酯酶剪切形成Fura-2，从而被滞留在细胞内。
Fura-2可以和钙离子结合，结合钙离子后在330-350nm激发光下可以备注3原理F，Fluo 3备注4.原理。
而DCFH 的备注5.原理123备注氧化后成罗丹明123，荧光强度可能受到线粒体膜电位的影响6.RhodamineI23 （线粒体膜电位荧光探针）原理细胞膜通透的阴离子绿色荧光染料, 能够迅速被活线粒体摄取, 而无细胞毒性。
生理意义标记线粒体膜电位激发波长488nm 发射波长515 ~ 575nm （绿色）生理意义检测线粒体膜电位备注正在使用7.Hoechst 33342 （DNA荧光探针）原理 Hoechst 33342是一种可对DNA 染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测。
Hoechst染料可透过细胞膜在聚AT序列的富集区域的小沟处与DNA结合并对DNA染色而发出强烈的蓝色荧光。
生理意义标记双链DNA激发波长355nm 发射波长465nm （蓝色）备注正在使用8.FDA原理FDA可透过细胞膜并作为荧光素积蓄在活细胞内。
生理意义反映细胞膜完整性和细胞活力激发波长495nm 发射波长520nm （绿色）备注正在使用9.PI （DNA荧光探针）原理它不能透过完整的细胞膜，但能透过凋亡中晚期的细胞和死细胞的膜而将细胞核染红，与细胞核中的DNA结合的PI发出的荧光，与未结合的PI相比，强度会增强20-30倍。
维拉帕米对P-糖蛋白底物罗丹明123经空肠黏膜透过性的影响
【 ｅ ｒｓ Ｐｇ ｃｐｏ ｉ； Ｖ ｒｐ ｍｌ Ｆｕｒｓｅｎｓｄｕ Ｒ ｏａ ｎ ２ Ｋ ｙｗｏｄ 】 —ｌ ｏ ｒ ｅ ｅａ ａ ｉ ｌ ｅｃｉ ｉ ｙ ｔｎ ； ｏ ｏ ｍ； ｈｄｍｉ １３ ｅ
Ｐ 糖 蛋 白 （ ．ｌｃｐｏｅ ， —Ｐ 为 ２ 一 Ｐ ｇ ｏｒｔｉ Ｐｇ ） ｙ ｎ ０世 纪 ９ ０年 代 发现 的一 种肿 瘤 多 药 耐药 （ ｕ ｉｒｇｒｓ ｔ ｓ ） ｍ ｈｄｕ ｉａ ｅ 性 ｅ ｓｎ 相关 蛋 白。Ｐｇ ． Ｐ是一 种 能量 依 赖性 膜 转运 蛋 白 ， 于 属 Ａ Ｐ 结 合 盒 式 膜 转 运 蛋 白 （ Ｔ —ｉｄｎ ａｓｔ Ｔ Ａ Ｐｂｎ ｉｇ ｃｓｅ ｅ ｔ ｔ ｎｐ ｒ ｒ， Ｂ ｒ ｓｏｔ ｓ Ａ Ｃ转 运蛋 白 ） ａ ｅ 家族 ， 由 Ａ Ｐ功能 将 细 可 Ｔ
ｍｅ ｒｎ ｓ Ｙ ０ Ｈｏｇｗ ｉＨＵ Ｎ ｅ ｂ ｉ Ｐ Ｎ Ｂｎ ＸＥ Ｑｎ －ｏｇ ｍｂａ ｅ Ａ ｎ－ｅ ， Ａ Ｇ Ｂ ｉ ｅ， Ａ ｉ， Ｉ ｉ ｄ ｎ． — ｇ
Ｈｏ ｐｉａ ，Ｓｏ ｔ ｅ ｎ Ｍ ｅ ｉａ ｖ ｒｉｙ，Ｇｕａ ｚ ｕ ５１ ５１ ｓ ｔｌ ｕ ｈ ｒ ｄｃ Ｕｎｉｅ ｓｔ ｌ ｎｇ ｈｏ ０ ５，Ｃｈ ｎ ｉａ
荧光分光光度法测定。结 果： 维拉 帕米具有增加 Ｒ１３经吸收方 向的透过性 ， ２ 并且减 少分 泌方向的渗透性 。但 实验 浓 度 的 维拉 帕 米 对 ｃ Ｆ的 肠 道 转 运 没 有 影 响 。 论 ： 结 维拉 帕 米 可 通 过 对 Ｐｇ 能 的抑 制 而 用 于 改善 受 Ｐｇ 导 药 —Ｐ功 ・ Ｐ介
ｉｉｎ ｌｍｅ ｒｎ ｓ Ｍ ｅｈ ｄ Ｔ ｅ ｅｆｃ ｆｖ ｒｐ ｒ ｌａ ｉｅｅ ｔｃ ｎ ｅ ｔ ｔ ｎ ｎ ｔｅ ｐ ｒ ａ ｉｔ ｆｒ ｏ ａ ｎ ｅｕ ａ ｍｂａ ｅ ． ｔｏｓ ｈ ｆ ｔｏ ｅａ ａｍｉ ｔｄｆ ｒｎ ｏ ｃ ｎｒ ｉ ｓ ｏ ｈ ｅｍｅ ｂｌ ｙ ｏ ｈ ｄ ｍｉｅ ｅ ｉ ａｏ ｉ
细胞裂解液中RH123的HPLC的检测方法及其在细胞摄取实验中的.
细胞裂解液中RH123的HPLC的检测方法及其在细胞摄取实验中的应用药学院陆渊指导老师郁韵秋摘要：本实验拟采用体外培养小鼠脑微血管内皮细胞（BCEC s）的方法，研究伊曲康唑对BCECs上P-gp功能的影响。
实验将主要包括建立细胞裂解液中罗丹明123的HPLC-FLD的检测方法，并进行方法验证；小鼠脑微血管内皮细胞的分离、纯化和培养；RH123细胞摄取实验以及数据的处理和分析。
通过本实验对伊曲康唑对P-糖蛋白功能的潜在影响进行探究。
建立一种细胞裂解液中罗丹明123的HPLC的检测方法，并将其应用于研究伊曲康唑对小鼠脑微血管内皮细胞上P-糖蛋白功能的影响。
关键词：罗丹明123、BCECs、P-糖蛋白、HPLC、伊曲康唑、细胞裂解液Abstract: The aim of this study is to figure out whether Itraconazole is an inhibitor of P-gp. To achieve this, we use brain capillary endothelial cells (BCECs) as a model and Rhodamine 123 as the substrate to evaluate the effect of Itraconzaole on P-gp. A sensitive and rapid high-performance liquid chromatography (HPLC) method with fluorometric detection after simple sample preparation procedure was developed for the determination of Rh123 in P-gp efflux studies. This method has been successfully applied to the qualification of Rhodamine123 in cell lysate obtained from P-gp efflux study conducted in brain capillary endothelial cells and can be employed for determination of the potential effect on P-gp.Keywords:Rhodamine 123, BCECs, P-gp, HPLC, Itraconazole, cell lysate前言伊曲康唑( Itraconazole，ITZ)是一种高效、广谱的口服三唑类抗真菌制剂，临床用于治疗浅部和深部的真菌感染，其对人体的毒副作用较小[1]。
甘草酸18位差向异构体不同配比和浓度对Caco-2细胞P-gp功能的影响
甘草酸18位差向异构体不同配比和浓度对Caco-2细胞P-gp功能的影响赵燕燕;孙东;刘丽艳;柳亚飞;王静【摘要】研究甘草酸18位差向异构体18α-甘草酸(18α-Gly)与18β-甘草酸(18β-Gly)不同配比和浓度对结肠癌(Caco-2)细胞P-糖蛋白(P-gp)功能的影响,选择最佳浓度比例.建立细胞模型,选择甘草酸总浓度为1∶ 10∶ 30∶ 60∶ 120∶240μmol/L,18α-Gly与18β-Gly物质的量比分别为10∶0、8 ∶ 2、6 ∶ 4、5 ∶ 5、4 ∶ 6、2∶8、0∶10,根据细胞存活率,选择合适浓度比例,利用流式细胞仪测定细胞内荧光强度,寻找荧光强度最大的浓度比,即对P-gp抑制作用最强,P-gp功能最弱.研究结果表明甘草酸总浓度为1μmol/L时,随着18α-Gly比例的减少,荧光强度逐渐减弱,P-gp诱导作用逐渐增加.甘草酸总浓度为10 μmol/L和60 μmol/L时,随着两者物质的量比的变化,荧光强度变化明显;当总浓度为10 μmol/L,n(18α-Gly)∶n(18β-Gly)=4∶6时,荧光强度较强,抑制作用明显;当总浓度为60 μmo l/L,两者物质的量比为5∶5时荧光强度最强,抑制作用最强.【期刊名称】《河北大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2016(036)003【总页数】8页(P249-256)【关键词】18α-甘草酸;18β-甘草酸;P-糖蛋白功能;Caco-2细胞;不同配比/浓度【作者】赵燕燕;孙东;刘丽艳;柳亚飞;王静【作者单位】河北大学化学与环境科学学院,河北保定 071002;河北大学药学院,河北保定 071002;河北大学化学与环境科学学院,河北保定 071002;河北大学医学实验中心,河北保定 071000;河北大学化学与环境科学学院,河北保定 071002;河北大学化学与环境科学学院,河北保定 071002【正文语种】中文【中图分类】R285.5甘草是一味重要的传统中草药，甘草酸是甘草中最主要的活性成分，具有解毒、消炎、抗病毒、抗癌、免疫调节、降血脂等多方面药理作用[1].18位H的立体构型不同，使甘草酸存在2种差向异构体，即18α-甘草酸(18α-glycyrrhizin，18α-Gly)和18β-甘草酸(18β-glycyrrhizin，18β-Gly).两者空间构型存在微小差异，但在药理学、药效学、药代动力学及不良反应等方面却有着显著不同[2].近年来，其在抗SARS病毒[3]和抗HIV病毒[4]活性方面的重要作用，使得18α-Gly和18β-Gly的比较研究越来越受到国内外研究者的关注[5-9].P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)是一种能量依赖性蛋白，通过转运作用降低细胞内化合物浓度，减轻了药物的不良反应，同时也降低了药物对细胞的作用，使药效降低，产生耐药现象[10]；同时，P-gp的表达水平的变化，可影响药物的吸收、分布、代谢、排泄和毒性[11].近年来研究表明，18α-Gly和18β-Gly在细胞膜上的转运表现出一定的立体选择性，对P-gp功能和表达的影响分别表现为抑制作用和诱导作用，2种异构体的影响截然相反.目前国内外在转录水平和细胞膜转运方面对甘草酸的研究，仅限于18α-Gly和18β-Gly单体分别对CYP3A表达或P-gp 功能和表达的影响[12-13]，尚未见不同比例的18α-Gly和18β-Gly混合物在此方面的研究.上市制剂众多，大部分制剂为18α-Gly和18β-Gly混合物，二者所占比例各不相同[5]，现有各国药典及其质量标准中尚没有对2种异构体的组成比例做出规定.本实验就2种甘草酸差向异构体不同配比和浓度对Caco-2细胞P-gp功能的影响进行了研究，为新制剂的研发，临床用药选择，以及相关药物的研究与开发提供依据和新的研究思路.1.1 仪器与试剂C6流式细胞仪(美国BD公司)；ELX800酶标仪(美国宝特公司)；CKX41型倒置相差显微镜(日本奥林巴斯有限公司)；BHC-1300ⅡA/B3超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；Allegar X-22R Centriguge低温高速离心机(美国BECKMAN)；MCO-18AIC恒温二氧化碳培养箱(日本三洋设备有限公司)；MLS-3780型高压灭菌锅(日本三洋设备有限公司)；WZD-160型微量振荡器(上海创发电子科技有限公司)；移液枪(美国GIBCO)；25 cm2培养瓶(美国Costar Corning)；75 cm2培养瓶(美国Costar Corning)；96孔细胞培养板(美国Corning Costar)；吸管. Caco-2细胞(30代，购自中国武汉大学典型培养物保藏中心)；胎牛血清(美国GIBCO，批号：141104)；100 U/mL青-链霉素双抗(碧云天生物技术研究所，批号：423A0522)；丙酮酸钠(美国MERCK，批号：HG3-1166-78)；Eagle’s minimum essential medium (MEM) 培养基(美国GIBCO，批号：1460618)；二甲基亚砜(DMSO)(美国Sigma-Aldrich，批号：0231)；噻唑蓝(MTT)(中国药品生物制品检定所，批号：0793)；罗丹明123(中国Solarbio，批号：1015A053)；Hepes盐(中国Solarbio，批号：710130411)；18α-Gly对照品(18α，20β-glycyrrhizic acid，ALPS制药，批号：10B001S)；18β-Gly对照品(18β，20β-glycyrrhizinic acid，ALPS制药，批号：05C11S).1.2 实验方法1.2.1 细胞培养MEM培养基制备：取1袋MEM培养基，称取HEPES 盐2.38 g和丙酮酸钠0.11 g，用800 mL去离子水溶解稀释，磁力搅拌3 h，加入Na2CO32.00 g，加入200 mL去离子水，磁力搅拌1 h，调pH为7.2～7.4，然后用0.22 μm微孔滤器过滤除菌，分装，4 ℃保存.胰蛋白酶制备：称取胰蛋白酶0.25 g，EDTA-Na 0.30 g，NaCl 0.8 g，KCl 0.04 g，葡萄糖0.1 g，苯酚红0.000 5 g，加入100 mL去离子水溶解，磁力搅拌2～3 h，调pH为7.8～8.0，用0.22 μm微孔滤器过滤除菌，分装，-20 ℃保存.冻存液制备：全培养基、胎牛血清、DMSO 3者体积比为7∶2∶1.用前配制.罗丹明123溶液配制：精确称取0.38 mg罗丹明123，用400 μL PBS溶解，备用.使用时用PBS稀释到500 μmol/L和0.550 0 μmol/L.MTT溶液制备：称取250 mg MTT，溶于50 mL PBS，磁力搅拌30 min，0.22 μm微孔滤器过滤除菌，分装至1.5 mL EP管，4 ℃避光保存，保质期为2周.细胞培养及形态学观察：Caco-2细胞以2×105/mL接种于25 cm2的细胞培养瓶中，加入体积分数10% FBS的MEM培养基6 mL和0.1 U/L青霉素-链霉素双抗.将细胞置于37 ℃、体积分数5%CO2的培养箱中培养2 d，细胞换液，在第4天，细胞长到80%～90%时，用质量分数0.1%的胰蛋白酶消化并传代，当细胞生长到30～50代时用于实验.1.2.2 18α-Gly和18β-Gly不同配比和浓度对Caco-2细胞毒性的考察将处于对数生长期的Caco-2细胞以2×104/mL的密度接种于96孔培养板，每孔终体积为200 μL，放入37 ℃、体积分数5%CO2的培养箱中培养24 h.18β-Gly用DMSO(终体积分数<1%)溶解，18α-Gly用MEM培养基溶解，并加入等量的DMSO，用MEM培养基稀释，使甘草酸最终总浓度均为1、10、30、60、120、240 μmol/mL，两者物质的量比为10∶0、8∶2、6∶4、5∶5、4∶6、2∶8、0∶10；将每孔培养24 h后细胞培养液吸尽，于阴性对照孔加入培养基和溶剂DMSO，实验孔加入不同配比和浓度的18α-Gly和18β-Gly混合液，每孔中DMSO含量相等；空白调零孔为不含细胞的完全培养基，放入37 ℃、体积分数5%CO2的培养箱中继续培养72 h.每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，放入37 ℃、体积分数5%CO2的培养箱中继续培养4 h，终止培养，小心吸弃上清液，每孔加入150 μL DMSO，震荡10 min，使结晶物溶解.以空白对照孔调零后，测量490 nm处的吸光度(A)(实验平行重复3次).计算细胞的存活率，观察各浓度细胞的存活状况.细胞存活率=(实验组平均吸光度值/阴性对照组平均吸光度值)×100%.选取细胞存活率≥90%的药物配比和浓度，进行下一步非细胞毒性实验.1.2.3 18α-Gly和18β-Gly不同配比和浓度对P-糖蛋白功能影响的考察依据“1.2.2”实验结果和文献[14-15]，选取18α-Gly 和18β-Gly总浓度为60、10、1 μmol/mL高中低3个浓度，在实验孔中分别加入以上3个浓度18α-Gly和18β-Gly不同配比(10∶0、8∶2、6∶4、5∶5、4∶6、2∶8、0∶10)的混合液.将处于对数生长期的Caco-2细胞用0.1 mol/L胰酶消化，用含体积分数10%胎牛血清的MEM培养基重悬为单细胞悬液，进行细胞计数，离心(4 ℃，1 500r/min，5 min)，弃上清液，用PBS分散成1×106/mL的细胞悬液，接种于2mL的EP管中.离心(4 ℃，1 500 r/min，5 min)，弃上清液，按实验分组分别在实验孔加入高中低浓度的不同配比的18α-Gly和18β-Gly混合液，将细胞置于37 ℃、体积分数5%CO2的培养箱中培养60 min.置冰上终止作用(约10 min)，离心(4 ℃，1 500 r/min，5 min)，弃上清液，用冰冷的PBS洗2次，离心(4 ℃，2 500 r/min，5 min)，弃上清液.按实验分组加入Rh-123或PBS，将细胞置于37 ℃、体积分数5% CO2的培养箱中培养60 min，置冰上终止作用(约10 min)，离心(4 ℃，2 500 r/min，5 min)，弃上清液，冰冷的PBS清洗2次，离心(4 ℃，1 500 r/min，5 min)，弃上清液，加0.5 mL PBS轻轻吹打，制成单细胞悬液.具体分组见表1.流式细胞仪选择F1通道，每次采集1万个细胞，检测细胞内Rh-123平均荧光强度，分析时设门以除去细胞碎片和细胞团对实验的干扰.1.2.4 统计学处理数据用±s表示，组间显著性差异用t检验，P<0.05差异具有统计学意义.2.1 细胞培养及形态学观察细胞传代于25 cm2培养瓶中，很快开始贴壁，48 h换液，再经48 h细胞贴壁80%～90%.在倒置相差显微镜下观察，Caco-2细胞成铺路石状镶嵌排列，形态正常，与文献报道[16]相似，见图1.2.2 18α-Gly和18β-Gly不同配比和浓度对Caco-2细胞毒性的考察实验分别考察了18α-Gly和18β-Gly不同配比和浓度对Caco-2细胞的毒性.结果表明，甘草酸总浓度一定时，18α-Gly和18β-Gly比例不同对细胞存活率影响不同.在7种不同配比的条件下，甘草酸总浓度在1～60 μmol/L，细胞存活率均大于90%，为非细胞毒性浓度.其中当甘草酸总浓度在1～30 μmol/L，n(18α-Gly)：n(18β-Gly)=8∶2时，以及总浓度为60 μmol/L，n(18α-Gly)∶n(18β-Gly)=4∶6时，细胞总体存活率表现较高(>110%)，见图2 a、b、c、d；总浓度在120～240 μmol/L内，18α-Gly和18β-Gly在7种不同配比的条件下，细胞存活率均小于90%，为细胞毒性浓度.随着浓度增加，毒性表现增强，见图2 e、f.因此选取甘草酸总浓度分别为1、10、60 μmol/L，18α-Gly和18β-Gly物质的量比分别为10∶0、8∶2、6∶4、5∶5、4∶6、2∶8、0∶10进行下一步研究.2.3 18α-Gly和18β-Gly不同配比和浓度对P-gp功能影响的考察实验分别考察了18α-Gly与18β-Gly总浓度(1、10、60 μmol/L)及不同配比(10∶0、8∶2、6∶4、5∶5、4∶6、2∶8、0∶10)混合液对Caco-2细胞内P-gp 转运Rh-123的影响，见表2.结果表明，18α-Gly单体浓度为10 μmol/L和60μmol/L时，细胞内Rh-123摄取量增多，与阴性对照相比荧光强度增强，对P-gp功能表现出抑制作用；18β-Gly单体浓度为1、10、60 μmo l/L时，细胞内Rh-123摄取量减少，与阴性对照相比荧光强度减弱，对P-gp功能表现出诱导作用，见图3.甘草酸总浓度为1 μmol/L时，随着18α-Gly与18β-Gly 2种异构体比例的减小，荧光强度逐渐减弱，诱导作用逐渐增强；在浓度为10 μmol/L，二者物质的量比为4∶6时，以及浓度为60 μmol/L，物质的量比为5∶5时，荧光较强，抑制作用明显，见图3.甘草酸由于C18位H构型不同，存在2种立体异构体，18α-Gly为反式构型，18β-Gly为顺式构型，根据位阻效应，前者大于后者，易于受体蛋白结合，导致两者比例不同时，甘草酸的药效不同.甘草酸2个差向异构体虽然在自然界、制剂中或在体内很难发生差向异构化，但在一定的化学条件下能发生构型的改变.本实验前期工作中已经研究了不同的炮制条件对甘草药材中主成分异构体的含量及比例的影响[17]，结果表明，生甘草中18α-Gly与18β-Gly的物质的量比始终为1∶7，未发现炮制条件的变化，对甘草酸2个差向异构体比例的影响.并对国内外上市的4代甘草酸制剂中主成分18α-甘草酸和18β-甘草酸进行了含量测定[5]，对同一代制剂不同剂型、不同代制剂同一剂型中两差向异构体的组成比例进行了分析.结果表明，甘草酸制剂不同，18α-Gly与18β-Gly所占比例各不相同，第1代与第2代、第3代与第4代甘草酸不同剂型制剂中，18α-Gly与18β-Gly的物质的量比分别为1∶20～1∶109、3∶1～500∶1.甘草酸上市制剂众多，各制剂选用的原料药不同以及采取的制剂工艺不同，都可能会导致甘草酸制剂中主成分差向异构体组成比例的不同.从天然产物中提取、精制18β-Gly比较简单，成本比较低，而直接合成18α-Gly成本高，多数厂家选用由前者转化的方式制造18α-Gly.目前市售的甘草酸制剂的主成分均以18α-Gly与18β-Gly混合物的形式存在，以α体占主体的第4代甘草酸制剂-异甘草酸镁，也含有少量的18β-Gly (n(18α-Gly)∶n(18β-Gly)=500∶1[5]).所以研究甘草酸18位差向异构体18α-甘草酸(18α-Gly)与18β-甘草酸(18β-Gly)不同配比和浓度对结肠癌(Caco-2)细胞P-糖蛋白(P-gp)功能的影响，对新制剂的研发和临床用药选择具有重要的意义.P-gp可以将细胞内的药物泵出细胞外，从而降低细胞内的药物浓度，减轻细胞的毒副作用，保护机体免受外源毒素作用，这也是导致肿瘤细胞出现耐药性的重要原因.Caco-2细胞来源于人类结肠癌及直肠癌，P-gp是其中的一种主要转运蛋白.Rh-123是P-gp的特异性底物，可以用来评价P-gp的功能活性，当P-gp功能受抑制时，Rh-123从Caco-2细胞的外排量将减少.18β-Gly甘草可以通过诱导P-gp功能以加速药物排出细胞外，起到解毒的作用，而18α-Gly对于P-gp的抑制作用，则可以减弱细胞外排，使药物在细胞内发挥最大药效.诱导和抑制作用，对于其他治疗药物的辅助作用非常大，可以使药物发挥最大药效同时，对机体的毒性降到最低，因此寻找合适的浓度比例非常重要.本实验首先培养Caco-2细胞模型，配制甘草酸总浓度为1、10、30、60、120、240 μmol/L 6个浓度系列，18α-Gly与18β-Gly比例分别为10∶0、8∶2、6∶4、5∶5、4∶6、2∶8、0∶10，通过毒性实验，选择了1，30，60 μmol/L作为低中高3个浓度系列，用流式细胞仪测定细胞内Rh-123荧光强度，判断P-gp的功能活性，从而推断甘草酸合适的浓度比，最终得出在总浓度为60 μmol/L，n(18α-Gly)∶n(18β-Gly)=5∶5时，荧光最强，细胞的外排作用最弱，细胞内药物最多，抗药性最弱.实验结果表明，甘草酸的作用强度及安全性与18α-Gly和18β-Gly的浓度和比例有关.通过甘草酸总浓度(1、10、60 μmol/L)及不同配比物质的量比(10∶0、8∶2、6∶4、5∶5、4∶6、2∶8、0∶10)的混合液对Caco-2细胞内P-gp转运Rh-123作用影响的比较研究，在浓度为60 μmol/L，n(18α-Gly)∶n(18β-Gly)=5∶5时，荧光强度最强，对Caco-2细胞内P-gp抑制作用最强，对于药物外排最弱，可减弱抗药性，可能是18α-GL和18β-Gly发挥最大协同作用的的最佳浓度配比.具体作用机制尚需进一步研究.【相关文献】[1] ABE M，AKBAR F，HASEBE A，et al.Glycyrrhizin enhances interleukin-10 production by liver dendritic cells in mice with hepatitis[J].J Gastroenterol，2003，38(10)：962-967.[2 ] 宋红波，刘茜，赵辉，等.甘草酸铵类制剂中甘草酸差向异构体的分析[J].药物分析杂志，2012，32(5)：883-886.SONG Hongbo，LIU Qian，ZHAO Hui，et al.Analysis of 2 epimers in ammonium glycyrrhizinate drugs[J].China J Pharm Anal，2012，32(5)：883-886.[3] CINML J，MORGENSTEM B，BAUER G，et al.Glycyrrhizin，all active component of liquorice roots，and replication of SARS-associated coronavirus[J].Lancet，2003，361(9374)：2045-2046 DOI：10.1016/S0140-6736(03)13615-X.[4] PLIASUNOVA OA，HONA，KISELEVA I，et al.The anti-HIV activity of glycyrrhizic acid penta-O-nicotinate[J].Vestn Ross Akad Med Nauk，2004(11)：42-46.[5] 赵燕燕，石敏健，刘丽艳，等.4代甘草酸制剂主成分异构体及杂质含量差异分析与变化趋势[J].药物分析杂志，2014，34(2)：247-254.ZHAO Yanyan，SHI Minjian，LIU Liyan，et al.Analysis of content differences and variation trends of the principal component isomers and related substances in the four generations of glycyrrhizin preparations[J].Chin J Pharm Anal，2014，34(2)：247-254.[6] ZOU Q G，WEI P，LI J，et al.Simultaneous determination of 18a-and18β-glycyrrhetic acid in human plasma by LC-ESI-MS and its application to pharmacokinetics[J].Biomed Chromatogr，2009，23：54-62.[7] 杨柏灿，潘颖宜.甘草“调和”的影响因素探析[J].中成药，2013，35(1)：155-156.YANG Bocan，PAN Yingyi.Influence factors analysis of licorice“reconciliation”[J].Chinese Traditional Patent Medicine，2013，35(1)：154-156.[8] 周倩，孙立立.蜜炙对甘草化学成分影响研究[J].中国药学杂志，2013，48(10)：768-772. ZHOU Qian，SUN Lili.Changes of chemical constituents in radix glycyrrhizae before and after honey processing[J].Chin Pham J，2013，48(10)：768-772.[9] 席先蓉，陈庆.正交设计研究甘草蜜制工艺[J].中国中药杂志，2001，26(7)：460-462.XI Xianrong，CHEN Qing.Research of licorice honey processing with Orthogonaldesign[J].China Journal of Chinese Materia Medica，2001，26(7)：460-462.[10] LAURETTA M S CHAN，SIMON LOWES，BARRY H HIRST.The ABCs of drug transport in intestine and liver：efflux proteins limiting drug absorption andbioavailability[J].Eur J Pharm Sci，2004，21(1)：25-51.DOI：10.1016/j.ejps.2003.07.003. [11] LIN J H.Drug-drug interaction mediated by inhibition and induction of P-glycoprotein[j].Adv Drug Dev，2003，55：1:53.[12] 王宇光，杨明会，马增春，等.18β-甘草酸和18α-甘草酸对大鼠原代肝细胞CYP3A酶表达的影响[J].中国中药杂志，2009，34(3)：307-311.WANG Yuguang，YANG Minghui，MA Zengchun，et al.Effects of 18β-glycyrrhizic acid and 18α-glycyrrhizic acid on mRNA and protein expression of cytochrome P450 3A in cultured rat primary hepatocyte[J].China Journal of Chinese Materia Medica，2009，34(3)：307-311.[13] 颜苗，李兰芳，李焕德，等.18α-甘草酸和18 β-甘草酸对Caco-2细胞P-gp功能和表达的影响[J].中国中药杂志，2012，37(1)：99-103.YAN Miao，LI Lanfang，LI Huande，et al.Effect of 18α-glycyrrhizic acid and 18β-glycyrrhizic acid on P-gp function and expression in Caco-2 cells[J].China Journal of Chinese Materia Medica，2012，37(1)：99-103.[14] SUN Li，SHEN Jingfang，PANG Xiaoyun，et al.Phase I safety and pharmacokinetic study of magnesium isoglycyrrhizinate after single and multiple intravenous doses in Chinese healthy volunteers[J].J Clin Pharmacol，2007,47(6)：767-773 DOI：10.1177/0091270007299757.[15] 张喜全，夏万光，万顺之.天晴甘美[J].中国新药杂志，2006，15(16)：1409-1410.[16] 孙敏捷，盛星，胡一桥.Caco-2细胞单层模型的建立与验证[J].中国药学杂志，2006，41(18)：1431-1434.[17] 赵燕燕，李杨，刘丽艳，等.甘草炮制条件对18α-Gly和18β-Gly含量及比例的影响[J]:河北大学学报(自然科学版)，2015，35(2):138-146.DOI：10.3969/j.issn.1000-1565.2015.02.006. ZHAO Yanyan，LI Yang，LIU Liyan，et al.Effects of licorice processing conditions on content and proportion of 18α-glycyrrhizic acid and 18β-glycyrrhizic acid[J].Journal of Hebei University(Naturnal Science Edition)，2015，35(2)：138-146.DOI：10.3969/j.issn.1000-1565.2015.02.006.。
实验六细胞核和线粒体的荧光观察
特性
嵌入核酸双链间,只能标记死细胞.用于 染色 体,细胞观察,分辨死活细胞和细胞周期研究
Ethidium bromide(EB)518/605 嵌入核酸双链间,只能标记死细胞.用于电泳
红色荧光
分析,染色体观察
DAPI 358/461 蓝色荧光
Hoechst33342 350/461 蓝色荧 光
实验六 细胞核和线粒体的荧光观察
一、实验目的
学习荧光显微镜的工作原理及使用方法 了解荧光探针Rhodamine 123 和Hoechst33342 与细 胞成分的结合特性和光谱特性
二、实验原理
1.荧光显微镜
常用荧光探针介绍
细胞参量
荧光探针 吸收/发射 nm
ห้องสมุดไป่ตู้
DNA和RNA Propidum iodide(PI)
用 PBS缓冲液轻轻漂洗2次，放在载玻片上制成 的小室上
利用荧光显微镜观察细胞核、线粒体
思考题
1. 荧光显微镜的工作原理，及使用时应注意 的问题。 2. 细胞核的形态的变化与功能的关系
溶酶体 线粒体
Neutral red 541/640 红色荧光
Rhodamine 123 507/529 黄绿色荧光
探针微偏碱性,可标记溶酶体等酸性细 胞器
可进入活细胞,阳离子性,摄入快,淬灭快, 无毒性
Hoechst33342和Rhodamine 123
Ho.33342是一种亲脂性物质，能与DNA特异性 结合的荧光探针，所以被大量用于活细胞的观察和定 量的研究。荧光激发和发射特性分别为350nm和 461nm。
试剂
PBS缓冲液pH7.4 Ho.33342储存液:1mg/mL(溶于PBS) 罗丹明123储存液: 1mg/mL(溶于甲醇)
碧云天线粒体膜电位检测试剂盒(Rhodamine 123)说明书
线粒体膜电位检测试剂盒(Rhodamine 123)产品简介：碧云天的线粒体膜电位检测试剂盒(Rhodamine 123) (Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit with Rhodamine 123)是一种以Rhodamine 123为荧光探针对线粒体进行染色并进行膜电位检测的试剂盒。
本试剂盒可用于活细胞线粒体膜电位的检测，也用于细胞凋亡的检测。
本试剂盒可使用荧光显微镜、流式细胞仪、荧光酶标仪等荧光检测设备进行检测。
Rhodamine 123也称2-(6-Amino-3-imino-3H-xanthen-9-yl)benzoic acid methyl ester ，中文名为罗丹明123，分子式为C 21H 17ClN 2O 3，分子量为380.82，CAS 号为62669-70-9。
Rhodamine 123是一种通透细胞膜的黄绿色阳离子荧光探针，最大激发光波长为507nm ，最大发射光波长为529nm 。
Rhodamine 123的化学结构式和激发、发射光谱图参考图1。
图1. Rhodamine 123的化学结构式和激发、发射光谱图。
本试剂盒检测线粒体膜电位的原理如下。
在正常细胞中，Rhodamine 123能够依赖线粒体跨膜电位(mitochondrial transmembrane potential, ΔΨm)选择性进入线粒体基质，可发出明亮的黄绿色荧光；当细胞发生凋亡或坏死时，线粒体膜电位丢失，线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore, MPTP)持续开放，引起线粒体跨膜电位(ΔΨm )的崩溃，Rhodamine 123从线粒体中释放出来，从而导致线粒体内黄绿色荧光强度的明显降低。
此外有报道，在个别特定情况下，Rhodamine 123探针在线粒体内过度聚集后可能会出现自发淬灭(self-quenching)现象，线粒体内黄绿色荧光强度降低，而在凋亡发生时，线粒体中黄绿色荧光增强。
荧光显微镜的基本原理及应用
减弱或消失，操作时注意及时用挡板阻挡激发光照射 标本。 3 汞灯关闭后需冷却30min后再重新启动（最好不要短 时间内反复开关，标本应集中观察。）
2.药物筛选
荧光探针分布是利用信号传 导中信号分子的迁移功能，将 一荧光蛋白与信号分子相偶联， 根据荧光蛋白的分布情况即可 推断信号分子的迁移状况，并 推断该分子在迁移中的功能。 由于GFP分子量小，在活细胞 内可溶且对细胞毒性较小，因 而常用作荧光探针
八、使用注意事项
1 暗室内进行，打开汞灯5-10min稳定后再观察。
A filter set consists of two barrier filters (1 and 3) and a dichroic mirror (beam-splitting 2)
三、荧光显微镜的操作
(1)安装紫外防护罩。 (2)打开高压汞灯的电源控制箱开关。 (3)插入挡光板，中断光路。 (4)预热5—10分钟。 (5)将载有样品的载玻片放到载物台上。
(9)通过粗、细螺旋调整焦距。
(10)打开与显微镜连接的计算机，点 击数码成像系统软件，采集数码图像。
四、荧光显微镜标本制作要求
（一）载玻片
载玻片厚度应在0.8～1.2mm之间，太厚 的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能 使激发光在标本上聚集。载玻片必须光洁， 厚度均匀，无明显自发荧光。有时需用石 英玻璃载玻片。
(6)选择接物镜(按照先低倍，后高倍需要 的分光镜组件：“O”为观察透射光时 用；“WU”为观察蓝色荧光时用(如 DAPl)；“WB”为观察绿色荧光时用(如 FITC)；“WG"为观察红色荧光时用(如 TRITC)。
(8)使用阻断滤片(目前多数阻断滤片内 置于荧光显微镜)。
MitoTracker Red CMXRos 线粒体红色荧光探针
MitoTracker®Red CMXRos线粒体红色荧光探针货号:M9940规格:50μg保存:-20℃避光干燥保存。
产品说明：MitoTracker®Red CMXRos是一种细胞渗透型的X-rosamine衍生物，包含标记线粒体的弱巯基反应性的氯甲基官能团。
本品是一种氧化型的红色荧光染料（Ex=579nm，Em=599nm），只需简单孵育细胞，即可被动运输穿过细胞膜并直接聚集在活性线粒体上。
一旦线粒体被染色后，还能根据后续实验的需求进行固定（醛类固定剂如甲醛）和透化（醛类去污剂如Triton X-100），探针依然维持在细胞内。
本品适合双标实验，因其红色荧光与其他的绿色荧光探针具有良好的分辨率。
虽然传统的线粒体荧光探针如TMR和罗丹明123，也能很容易的聚集在功能线粒体上，但是一旦线粒体膜电位丧失即会被洗掉，从而在一些需要细胞进行醛类固定或者包含线粒体能量状态影响因子的实验中，使其应用大受限制。
产品性质：CAS号（CAS NO.）：167095-09-2分子式（Formula）：C32H32Cl2N2O分子量（Molecular weight）：531.52外观（Appearance）:紫色固体激发波长（Ex）:579nm发射波长（Em）:599nm结构式（Structure）:使用方法1.储存液的配制本品是以粉末形式提供，使用前需将本品回温至室温。
之后使用细胞培养级别的无水DMSO将其充分溶解至终浓度1mM。
本品M.Wt.=531.52g/mol，换算下来，50μg粉末只需加入94μL DMSO即可得到1mM 储存液。
可根据单次的使用量将储存液分装后放到-20℃避光，避免反复冻融。
2.工作液的配制根据不同的实验目的使用不同的探针浓度，以下的起始操作条件仅作参考，可根据细胞类型和其他的相关因素如细胞或组织的透化等进行适当调整。
用适当的缓冲液或者细胞培养基稀释1mM储存液至工作液浓度。
颅脑损伤早期外周血中性粒细胞氧化爆发和吞噬功能的研究
华中科技大学硕士学位论文英文缩略词表英文缩写英文名称中文名称U Uninjured未损伤TC Traumatic control创伤控制TBI Traumatic Brain Injury颅脑损伤NF-kB the transcription factor:Nuclear Factor-κB;p65核转录因子gp91phox the catalytic subunit of nicotinamide adeninedinucleotide phosphate(NADPH)oxidase 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶的催化亚基COX-2Cyclooxygenase-2环氧酶-2iNOS Inducible nitric oxide synthase诱导型一氧化氮合酶PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳PVDF Polyvinylidene difluoride聚偏二氟乙烯ECL Electrochemiluminescence化学发光底物DAB3,3’-diaminobenzidine二氨基联苯胺HRP Horseradish peroxidase辣根过氧化物酶TBST Trisbuffered saline-Tween洗涤缓冲液MODS Multiple organ dysfunction syndrome多器官功能障碍综合征MOF Multiple organ failure多器官功能衰竭DHR123Dihydrodamine123双氢罗丹明123R123Rorhodamine123罗丹明123DCFH-DA2’-7’-dichlorofluorescein-diacetate2’-7’二氯荧光素乙酰乙酸盐DCF2’-7’-dichlorofluorescein2’-7’二氯荧光素GCS Glasgow Coma Scale格拉斯哥昏迷量表MTBI Moderate Traumatic Brain Injury重型颅脑损伤STBI Severe Traumatic Brain Injury轻中型颅脑损伤fMLP Chemotactic peptide,N-Formyl-L-methionyl-L-leucyl-L-phenylalanine;N-formyl-MLF白细胞趋化肽IL-6interleukin-6白细胞介素6TNF-αTumor Necrosis Factor-α肿瘤坏死因子αCRP C-Reactive protein C反应蛋白NO Nitrogen monoxide一氧化氮PG Prostaglandin前列腺素TXA2Thromboxane A2血栓素A2华中科技大学硕士学位论文颅脑损伤早期外周血中性粒细胞氧化爆发脑损伤早期外周血中性粒细胞氧化爆发和吞噬功能和吞噬功能和吞噬功能的研究的研究华中科技大学同济医学院附属同济医院创伤外科武汉430030硕士研究生：刘鹏导师：廖忆刘副教授中文摘要目的：研究颅脑损伤患者早期外周血中性粒细胞的氧化爆发及吞噬功能变化。
rho123荧光检测药物外排原理
rho123荧光检测药物外排原理荧光检测药物外排原理
荧光检测是一种常用的方法，用于研究药物在生物体内的外排过程。
rho123是
一种常用的荧光染料，可被应用于药物外排的研究。
荧光染料rho123的外排原理是基于细胞膜转运蛋白的活性。
这些转运蛋白可
将药物从细胞内部转运到细胞外。
rho123荧光染料能与这些转运蛋白相互作用，
并通过膜上的转运蛋白进行主动外排。
转运蛋白的活性主要通过ATP酶依赖的氧化磷酸化过程驱动，使药物从转运
蛋白的结合位点进入膜进行外排。
当rho123进入细胞后，它将与细胞内的转运蛋
白结合，并被转运蛋白驱动向细胞外被排出。
同时，rho123在外排过程中会发出
荧光信号。
利用荧光检测药物外排的原理，我们可以通过实验观察rho123荧光强度的变
化来评估药物外排过程的影响因素。
例如，我们可以使用不同浓度的药物处理细胞，并测量rho123的荧光强度。
这样可以确定药物外排的速率和效率。
荧光检测药物外排的优势在于其快速、灵敏和非侵入性。
这种方法非常适合用
于药物外排机制的研究，如药物的转运途径、转运蛋白的活性等方面的研究。
此外，荧光检测还可以与其他技术和方法相结合，以全面了解药物外排过程。
尼康TE2000-U倒置显微镜使用操作说明
荧光（ ） 荧光（E）显微术
适用于本身属于或被染色后形成荧光体的样品。 荧光体在一定波长光（紫外或可见）的激发下 发光（即荧光，波长长于激发光）。需配荧光 附件和滤光器等。前者主件为激发光源，一般 分汞灯系统和卤灯系统，汞灯既适用于紫外光 激发也适用于可见光激发，且能量较高；后者 只适用于可见光激发。（此处插入拍摄图片）
关键点：将有ph 标记的物镜与物镜相同 ph 标记的聚光器模块一起送入光路，在 进行显微术前，校正(对中)物镜里的相差 板及聚光器模块里的环形光阑。
1. 用明视场（BF）显微术对样品聚焦。 用明视场（ ）显微术对样品聚焦。 2. 相差观察时对显微镜的调整。 相差观察时对显微镜的调整。
1) 将ph 物镜转入光路。 2) 转动“聚光器转盘”，使其与在光路中 的物镜(步骤1中所安置的)具有相同的ph 标记。 3) 向右转动聚光器上的“孔径光阑调节 杆”，完全打开孔径光阑。
1. 复位 1） 逆时针转动，松开透射照明器中的 “聚光器再聚焦指紧螺钉”。 2） 把“目镜筒转盘”设置到＜O＞位。 3） 把显微镜右侧的“中间放大倍数刻度 盘”打到＜1X＞。 4） 逆时针转动，松开显微镜右侧粗⁄微调 旋钮后面的“物镜再聚焦定位环”
2. 打开透射照明器 1） 把电源后部的“外部开关”打到开的 位置； 2） 把电源“电源开关”打开。(把开关拨 至│)； 3） 按下显微镜左侧的“照明器开关”接 通灯泡。
5. 使用不同放大倍数的物镜进行观察
1) 把所需放大倍数的相差物镜移入光路。 2) 转动“聚光器转盘”，使其与在光路上 物镜（步骤1中所安置的）具有相同的ph 标记。 3) 调节放入光路中的环形光阑中心。(见程 序3)
6. 更换样品 利用使用显微镜主机上的“物镜再聚焦 定位环”，透射照明器上的“倾斜”装 置及“聚光器再聚焦指紧螺钉”，可容 易更换样品。 7. 显微镜操作结束后与明视场显微术步骤 相同。 相同。
dhr123检测超氧阴离子自由基的原理
dhr123检测超氧阴离子自由基的原理以dhr123检测超氧阴离子自由基的原理为标题超氧阴离子自由基是一种常见的氧化性物质，它在生物体内参与多种生理和病理过程。
因此，准确、灵敏地检测超氧阴离子自由基对于研究其生物学效应和相关疾病的发病机制具有重要意义。
dhr123（2',7'-二氯荧光素-二乙酸酯）是一种广泛应用于超氧阴离子自由基检测的荧光探针，其原理如下。
dhr123通过氧化反应而被超氧阴离子自由基还原，从而发生荧光增强。
该原理基于dhr123的化学结构特点，其分子结构中含有一个二氯荧光素基团和一个二乙酸酯基团。
当dhr123与超氧阴离子自由基反应时，超氧阴离子自由基将其还原为dhr123的二氯荧光素基团，使其从非荧光状态变为荧光状态。
因此，通过测量dhr123荧光强度的变化，可以间接反映超氧阴离子自由基的产生与活性。
在实验中，dhr123被用作荧光探针，其使用方法一般分为细胞实验和体外实验两种。
在细胞实验中，首先将dhr123加入细胞培养基中，使其进入细胞内。
超氧阴离子自由基与dhr123反应，产生荧光信号。
然后，通过荧光显微镜或流式细胞术等技术，观察并记录dhr123荧光强度的变化。
荧光强度的增加表示超氧阴离子自由基的生成增加，反之表示减少。
在体外实验中，常用的方法是将dhr123与待测样品一起反应，形成荧光产物。
然后，通过荧光光谱仪等设备测量并记录荧光强度的变化。
荧光强度的变化可以反映出样品中超氧阴离子自由基的含量和活性。
值得注意的是，在进行dhr123检测时，需注意以下几点：1. dhr123的浓度和反应时间需要根据具体实验条件进行优化，以保证荧光信号的稳定和可靠性。
2. dhr123的选择性较高，对其他氧化性物质的响应较弱，但在实验设计和数据解析时仍需注意与其他潜在干扰因素的区分。
3. 超氧阴离子自由基的产生和活性与生理、病理状态密切相关。
因此，在具体实验中，应根据不同的研究目的和条件，选择合适的样本来源和实验方案。
Fluorescentliposomes（荧光标记脂质体）的合成及介绍
Fluorescentliposomes（荧光标记脂质体）的合成及介绍Fluorescentliposomes（荧光标记脂质体）的合成及介绍荧光脂质体是一种新型的荧光标记物，通过包裹单层脂质体和表面固定荧光团来成像微加工结构中的流动剖面。
脂质体由磷脂和胆固醇通过聚碳酸酯膜挤压而成。
水核中的羧基荧光素和双分子层中荧光素标记的脂质赋予它们表面和体积荧光，以最大限度地提高其荧光强度。
选择脂质体的组成以使脂质体带净负电荷，以使自聚集和与带负电荷的通道玻璃表面的相互作用最小化。
这些脂质体是单分散的、中性浮力的和亲水的，并且在玻璃表面上没有表现出吸附。
随着脂质体修饰技术及荧光技术的发展，人们开始在制备脂质体的原料磷脂或胆固醇上修饰荧光染料，用它示踪脂质体的走向，并综合脂质体内所包染料的荧光情况来分析脂质体载药体系与细胞的相互作用情况，从而获取更多更全面的信息。
我们的荧光脂质体可用于研究压力驱动的流动并提供具有出色信噪比的图像。
荧光脂质体也可以针对各种应用进行定制，以提供广泛的表面和体积特性，例如电荷、大小和表面化学。
荧光标记的脂质体，包括常规荧光脂质体、生物素化的荧光脂质体以及Avdinized化的荧光脂质体，另外还提供定制的荧光脂质体（脂类及染料可选）。
用途分类及介绍1.荧光脂质体-用于追踪和检测含有亲脂示踪剂的脂质体含有亲脂示踪剂的负电荷荧光脂质体含有亲脂示踪剂的中性荧光脂质体用于追踪和检测的中性荧光脂质体含有亲脂示踪剂的带正电荷的荧光脂质体基于DOTAP的荧光脂质体用于跟踪和检测基于DOTAP的Fluoroliposome-DBCO用于跟踪和检测基于DOTAP的Fluoroliposome-Azide用于跟踪和检测基于PS的荧光脂质体用于跟踪和检测表面活性脂质体用于活性染料的共轭负电荷荧光脂质体用于活性染料的共轭中性荧光脂质体用于活性染料的共轭用于追踪和检测的中性荧光脂质体-叠氮化物中性Fluorolipos ome?-DBCO用于跟踪和检测带正电荷的荧光脂质体用于活性染料的共轭2.荧光脂质体-用于融合实验脂质体共包封NBD/罗丹明负电荷荧光脂质体共包封NBD/罗丹明DOPC：DOPG脂质体共包封NBD/罗丹明POPC：Chol：POPG脂质体共包封NBD /罗丹明POPE：POPG脂质体共包封NBD/罗丹明DOPC：DOPS 脂质体共包封NBD/罗丹明POPE：POPS：POPC脂质体共包封NBD/罗丹明中性荧光脂质体共包封NBD/罗丹明DOPC脂质体共包封NBD/罗丹明带正电荷的荧光脂质体共包封NB D/罗丹明DOTAP脂质体共包封NBD/罗丹明包封十八烷基罗丹明B的脂质体含有十八烷基罗丹明B的负电荷荧光脂质体POPC：Ch ol：含有十八烷基罗丹明B自猝灭浓度的POPG脂质体DOPC：含有十八烷基罗丹明B自猝灭浓度的DOPG脂质体POPE：含有十八烷基罗丹明B自猝灭浓度的POPG脂质体DOPC：含有十八烷基罗丹明B自猝灭浓度的DOPS脂质体POPE：POPS：含有十八烷基罗丹明B自猝灭浓度的POPC脂质体包封十八烷基罗丹明B的中性荧光脂质体含有十八烷基罗丹明B自猝灭浓度的DOPC脂质体包封十八烷基罗丹明B的带正电荷的荧光脂质体DOTAP脂质体含有十八烷基罗丹明B的自猝灭浓度3.荧光脂质体-用于孔形成实验含有各种大小的葡聚糖-FIT C染料的脂质体含有不同大小的葡聚糖-FITC染料的负电荷荧光脂质体POPE：含有葡聚糖-FITC染料的POPG脂质体POPC：Ch ol：含有葡聚糖-FITC染料的POPG脂质体DOPC：含有葡聚糖-FITC染料的DOPG脂质体POPE：POPS：含有葡聚糖-F ITC染料的POPC脂质体DOPC：含有葡聚糖-FITC染料的DOPS脂质体含有不同大小的葡聚糖-FITC染料的中性荧光脂质体含有葡聚糖-FITC染料的DOPC脂质体含有不同大小的葡聚糖-FITC的带正电荷的荧光脂质体含有葡聚糖-FITC染料的DOTAP脂质体4.荧光脂质体-用于巨噬细胞摄取标准荧光控制甘露糖化荧光控制5.?荧光脂质体-表面反应性脂质体胺反应性荧光脂质体生物素化的荧光脂质体羧酸反应荧光脂质体DBCO或叠氮化物反应荧光脂质体（点击化学）叶酸荧光脂质体巯基反应性荧光脂质体?。
质粒提取溶液123的作用
质粒提取溶液123的作用质粒提取溶液123是一种常用的实验试剂，广泛应用于分子生物学研究中。
它的主要作用是提取、纯化和扩增质粒DNA，为后续的实验操作提供高质量的DNA样品。
下面将从几个方面探讨质粒提取溶液123的作用。
质粒提取溶液123可以高效地提取质粒DNA。
在分子生物学实验中，研究人员常常需要从细菌中提取质粒DNA，以获得感兴趣的基因片段或进行基因工程实验。
质粒提取溶液123采用了特定的化学方法，可以迅速破坏细菌细胞壁，并释放出质粒DNA。
与传统的提取方法相比，质粒提取溶液123具有操作简单、提取效率高的优势，大大节省了实验时间。
质粒提取溶液123还可以纯化质粒DNA。
在提取质粒DNA的过程中，常常会伴随着细菌基因组DNA、RNA和蛋白质等杂质的存在。
这些杂质的存在会干扰后续实验的进行，因此需要进行纯化。
质粒提取溶液123中含有特定的缓冲剂和离心柱，可以有效地去除杂质，提高质粒DNA的纯度。
纯化后的质粒DNA可以更好地应用于酶切、连接、转染等实验操作，提高实验数据的可靠性。
质粒提取溶液123还可用于质粒DNA的扩增。
在某些实验中，研究人员需要大量的质粒DNA作为模板进行PCR扩增、测序等实验。
质粒提取溶液123中的特殊结构可以使质粒DNA更容易被PCR酶识别和扩增，提高扩增效率。
通过质粒提取溶液123的处理，可以快速获得大量的质粒DNA，满足实验需要。
质粒提取溶液123还可以应用于质粒DNA的测序。
随着高通量测序技术的发展，质粒DNA测序在基因组学研究中扮演着重要的角色。
质粒提取溶液123中的缓冲剂和清洁剂可以有效去除杂质和残余试剂，提供高质量的质粒DNA样品，为测序实验提供可靠的数据基础。
质粒提取溶液123在生物学实验中发挥着重要的作用。
它可以高效地提取、纯化和扩增质粒DNA，为后续实验操作提供高质量的DNA 样品。
质粒提取溶液123的应用不仅节省了实验时间，还提高了实验数据的可靠性，对于分子生物学研究具有重要的意义。
【手册】细胞凋亡实验手册
文档来源为:从网络收集整理.word版本可编辑.欢迎下载支持. 【关键字】手册细胞凋亡研究实验手册目录1 凋亡分析策略与产品的选择指南.2 常用凋亡检测产品和方法2.1 凋亡形态学检尝试剂盒系列（荧光/光学法）2.2 Annexin-V-FITC/EGFP检尝试剂盒.2.3 TUNEL 凋亡原位检尝试剂盒2.4 DNA LADDER 检尝试剂盒.2.5 细胞DNA含量检尝试剂盒（细胞周期）.2.6 Caspase 活性检尝试剂盒.2.7 线粒体膜电位检尝试剂盒（JC-1）2.8 端粒酶活性检尝试剂盒..2.9. 凋亡与氧化应激检测.2.10 凋亡相关蛋白检测（蛋白定量、蛋白抽提、WB ECL.产品简介）..2.11 凋亡相关基因检测（分子生物学产品产品简介）.附1：流式细胞仪和荧光显微镜的使用方法附2：常用凋亡诱导剂附3 不同荧光试剂检测波长表.附4 凋亡相关试剂盒选择参考文档来源为:从网络收集整理.word版本可编辑.欢迎下载支持.1 凋亡分析策略与产品的选择指南凋亡分析总体原则：1）因为凋亡是多因素、多通路参与的过程，不能根据单一指标来判断细胞凋亡；所以需进行多指标同时检测；2)由于凋亡细胞不同时间出现的凋亡事件不同；而每个指征维持有一个时间段，所以需要在不同的时间点进行采样，以保证检测结果的准确性；3）实验需要设定阳性和阴性对照，避免出现假阳性或者假阴性。
刚开始着手分析凋亡时，整体试验方案的设计至关重要，试验方案设计主要从以下几个方面考虑：一：总体方案设计研究目的检测指标凯基相关产品选择指南：2文档来源为:从网络收集整理.word版本可编辑.欢迎下载支持.二：按照凋亡发生的时间顺序检测附图2 凋亡不同时期发生的分子事件凯基相关产品：1 诱导凋亡：凯基凋亡诱导剂2 受体活化：凯基膜蛋白抽提试剂盒/WB相关产品3 细胞色素C检尝试剂盒4 线粒体膜电势降低：线粒体膜电位检尝试剂盒（JC-~1）5 Caspas的活性：Caspas 3 8 9 2 6等化学发光法检尝试剂盒6 细胞膜磷脂酰丝氨酸PS暴露：Annexin v —FITC/EGFP检尝试剂盒7 形态学改变：凯基凋亡形态学检尝试剂盒（光学或荧光用）8 DNA片断化：TUNEL和DNA Ladder检尝试剂盒四根椐实验材料类型选择检测方法和产品（详见附录5）三按照凋亡发生的细胞位点及信号通路检测附表3：Caspase 的靶分子Caspase 的靶分子大约有100多个底物，根椐其作用可分为四大类，多种作用导致凋亡发生。
HO-1在U2OS细胞DOX耐药中的作用及分子机制研究
HO-1在U2OS细胞DOX耐药中的作用及分子机制研究马陆达;魏鹤新【摘要】目的:探讨血红素氧合酶-1(HO-1)在骨肉瘤U2OS细胞多柔比星(DOX)耐药中的作用及相关分子机制.方法:体外培养U2OS细胞,建立U2OS-DOX耐药株,分为U2OS-WT组和U2OS-DOX组.采用siRNA HO-1转染U2OS-DOX细胞,CCK-8法检测细胞活性;RT-PCR法检测缺氧诱导因子1(HIF-1α)及HO-1的mRNA表达;WB法检测HIF-1α及HO-1的蛋白表达水平;流式细胞仪检测罗丹明Rh123在细胞内的蓄积.结果:DOX可降低U2OS细胞活性并随剂量的增加愈加明显,这种诱导作用可以被抗氧化剂(NAC)所逆转(P＜0.01).U2OS-DOX组HIF-1α及HO-1的mRNA和蛋白表达以及P糖蛋白(P-gp)表达水平均显著增加(p＜0.05).转染可恢复U2OS-DOX细胞对DOX化疗敏感性并增加其对Rh123的蓄积(P＜0.001).结论:HO-1可能通过抗氧化应激、增加化疗药物的蓄积等机制发挥U2OS细胞对DOX的耐药性.%Objective:Explore the role and the molecular mechanisms of HO-1 on U2OS cells resistance to DOXorubicin (DOX).Methods:U2OS cells were cultured in vitro and established theU2OS-DOX-resistant strains,experiment were divided into U2OS-WT group and U2OS-DOX group.The DOX-resistant cell line U2OS-DOX were transfected with specific small interfering RNAs (siRNA) of HO-1 gene.Cell viability of U2OS cell line was analyzed by Cell Counting Kit-8;Fluorescence quantitative real-time polymerase chain reaction was used to examine the mRNA expression levels of hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1 α) and heme oxygenase-1 (HO-1);Western blot was used to determine the protein expression levels of HIF-1 and HO-1;Rhodamine (Rh123) accumulation incells were analyzed by flow cytometry.Results:DOX can reduce U2OS cell activity in a dose dependent manner,this induction can be rescued by an antioxidant (NAC) (P ＜0.05).Compared with the control group,the mRNA and protein expression level of HIF-1α and HO-1 were significantly increased in U2OS-DOX group,as well as P-Glycoprotein (P-gp) expressing (P ＜ 0.05).siRNA HO-1 transfected cells restored U2OS-DOX chemosensitivity and increased accumulation of Rh123 (P ＜0.05).Conclusions:HO-1 may play an anti-oxidative stress role and increase the accumulation of chemotherapy drugs,this can recover the resistance of osteosarcoma U2OS cells to DOX chemotherapy.【期刊名称】《激光生物学报》【年(卷),期】2017(026)001【总页数】6页(P44-49)【关键词】骨肉瘤;多柔比星;血红素加氧酶-1;缺氧诱导因子1;抗药性【作者】马陆达;魏鹤新【作者单位】河北省廊坊市第四人民医院骨一科,河北廊坊,065700;河北省廊坊市第四人民医院骨一科,河北廊坊,065700【正文语种】中文【中图分类】R738.1骨肉瘤是一种好发于青少年和老年人的高度恶性骨肿瘤[1]。
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干预完成的细胞先用D-Hanks液将培养液冲洗干净，以免影响荧光亮度，再用Rhodamine123（R-123；Molecular Probes，溶于DMSO）孵浴，终浓度10μg/ml，避光，37℃，孵育30min；然后再用D-Hanks 液将未被细胞吸收的R-123冲洗净，就可以在激光共焦显微镜下检测R-123荧光。
R-123荧光用激光共焦显微镜（Leica SP-1 USA）在488nm时激发并且在530nm时检测。
一、检测原理：
罗丹明123（Rhodamine 123）是一种可透过细胞膜的阳离子荧光染料，是一种线粒体跨膜电位的指示剂。
其在正常细胞中能够依赖线粒体跨膜电位进入线粒体基质,
荧光强度减弱或消失。
而在凋亡发生时，线粒体膜完整性破坏，线粒体膜通透性转运孔开放，引起线粒体跨膜电位(ΔΨm) 的崩溃, Rh123 重新释放出线粒体, 从而发出强黄绿色荧光，可用荧光显微镜、荧光光度计或流式细胞仪检测，通过荧光信号的强弱来检测线粒体膜电位的变化和凋亡的发生，可用于培养的细胞或从组织中提取出的线粒体的膜电位检测。
二、使用方法：
1．细胞染色及分析
（1）培养细胞1×106/mL重悬于培养基中；
（2）加入罗丹明123染液0.1μg/mL～50 μg/mL （根椐细胞种类不同而浓度不同，一般3～10 μg/mL）；
（3）37℃，5% CO2细胞培养箱孵育1～30 min（根椐细胞种类不同而不同，一般10 min）；
（4）离心以培养基洗细胞两次；
（5）重悬细胞于培养基中，37℃，5% CO2培养60 min；
（6）流式细胞仪检测：激发波长488～505nm，发射波长515～575 nm （一般为530nm）；
荧光显微镜观察：滴加100 μL上述混合液于载玻片上，激发滤光片波长488nm，阻断滤光片波长515nm观察，拍照。
2．组织提取的线粒体染色及分析
（1）按常规方法提取的线粒体，用适量的1×Assays Buffer（将5×Assays Buffer 用水稀释5倍）重悬；
（2）常规方法进行蛋白含量测定后，用1×Assays Buffer调配成3mg/mL的线粒体溶液；
（3）取2mL 1×Assays Buffer和1mL线粒体溶液；
（4）加入适量待测化合物（同时设空白对照组），250C保温min；
（5）加入罗丹明123染液10 μL；
（6）荧光光度计检测：上述混合液全部加入石英比色皿中，置于250C下测定，激发波长488～505nm，发射波长530nm，连续记录从0 min～30 min内荧光强度的变化。
三、储存溶液置于－200C，可保存一年。
细胞凋亡后用罗丹明123染线粒体跨膜电位，荧光强度是降低的.罗丹明123是阳性染料，可以与具有高的负电性膜电位的线粒体所结合，当凋亡时，去极化膜电位降低，故结合减少，所检测到的荧光强度减弱
牛磺酸组线粒体膜电位均升高。