-内酰胺酶来源分析

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超广谱β-内酰胺酶的监测及临床应用

目前临床上ＥＳＢＬａ主要由肠杆菌科细菌产生，尤以肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌为代表１７１，但近年来阴沟肠杆菌、铜绿假单胞菌所占比例也有所增加。为了解西安地区某医院产ＥＳＢＬｓ菌
的发生率和耐药情况，控制ＥＳＢＬｓ院内的交叉感染，笔者对２００７年１月至２００８年１２月该院临床标本中２２０６株革兰阴性杆菌中所分离出来的３４３株产ＥＳＢＬｓ菌进行回顾性分析，以期更好地了解该院ＥＳＢＬｓ产生菌株的流行状况及耐药情况，指导临床合理用药。１材料与方法１．１材料１．１．１菌株来源所有检测菌株均来源于２００７年１月至２００８年１２月西安地区某医院住院及门诊患者送检的痰、咽拭子、血液、尿液及分泌物等标本中分离出来的２２０６株革兰阴性杆菌。共分离到产ＥＳＢＬｓ菌３４３株。
的菌苔，充分混匀，将此菌液分装于已灭菌的螺旋小瓶中，或用胶塞密封，贴上标签，置于４℃的冰箱中保存。此法制作简单，不需要特殊设备，且不需要经常移种，而且可以保存数年，但要注意保存的时候需要将其直立放置。所以此方法适合实验室菌种的长期保存。
Ｖｏ１．２７２Ｏ０９Ｎ０．２０
超广谱ｐ一内酰胺酶的监测及临床应用
冯秋菊，李秋玲－，殷彦２
（１．西安市卫生学校，陕西西安７１００５４；２．西安铁路职工中等专业学校，陕西西安７ａ茵株的现状，以期指导临床合理用药。方法对西安地区某医院２００７年１月至２００８年１２片啦
床标本中２２０６株革兰阴性杆菌中分离出来的３４３株产ＥＳＢＬａ茵，采用纸片扩散法、筛选法、确定法及双纸片协同法进行

产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌的耐药分析

产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌的耐药分析黎新桂;李时照;何艳红【摘要】目的了解本院产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)大肠埃希菌的发生比例及其对临床上常用的20种抗菌药物耐药变化.方法收集2008～2009年本院各类临床标本中分离的大肠埃希菌,用ATB Expression微生物鉴定系统进行鉴定及药敏试验.结果 2008～2009年产ESBLs的大肠埃希菌分离率分别为 45.51%(71/156)、55.93 %(99/177)(P<0.05).2年来ESBLs阳性的大肠埃希菌对临床常用的20种抗菌药物药敏表现出较高耐药性,耐药率上升差异有统计学意义(P<0.05),非产ESBLs 的大肠埃希菌对大多数抗菌药物仍保持较高的敏感率.结论应加强对大肠埃希菌ESBLs的监测,合理使用抗菌药物,对于有效控制产ESBLs大肠埃希菌的播散和流行是一项重要措施.【期刊名称】《检验医学与临床》【年(卷),期】2010(007)017【总页数】3页(P1853-1855)【关键词】大肠埃希菌;超广谱β-内酰胺酶;耐药【作者】黎新桂;李时照;何艳红【作者单位】广西梧州市人民医院检验科,543000【正文语种】中文【中图分类】R446.5大肠埃希菌是临床上常见的产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)耐药菌之一[1],也是医院获得性感染的常见致病菌[2],随着广谱抗菌药物的广泛应用,其耐药性不断变迁,了解大肠埃希菌对临床常用抗菌药物的敏感性对有效治疗大肠埃希菌感染有重要意义。

本研究对本院2008～2009年各类临床标本分离的大肠埃希菌产ESBLs情况及耐药进行测定,并分析2年来对常用抗菌药物的耐药性变化。

1 材料与方法1.1 菌株来源收集2008年1月至2009年12月本院临床所送检的各类标本中所确认的大肠埃希菌。

1.2 细菌鉴定及药敏试验应用法国生物梅里埃公司ATB Expression微生物鉴定系统进行鉴定及药敏试验.参照美国临床实验标准化委员会(CLSI)标准判断药敏结果和ESBLs表型确证实验。

金属β-内酰胺酶综述

金属类β-内酰胺酶β-内酰胺酶是革兰阴性杆菌对内酰胺类抗生素耐药的主要机制，细菌产生的β-内酰胺酶大部分系活性部位带丝氨酸残基的酶类，也有一小部分是活性部位为金属离子的酶类，称为金属β-内酰胺酶（metallo-β-lactamase,MBL），简称为金属酶。

金属β-内酰胺酶，属Bush分类3群，Ambler分类B类，该群酶最大特点是可以水解碳青霉烯类等抗生素，而对哌拉西林和氨曲南影响较小。

酶活性中心需金属锌离子的参与而发挥催化活性，故称为金属β-内酰胺酶。

底物为包括碳青霉烯类在内的一大类β-内酰胺抗生素，其活性不被常见的β-内酰胺酶酶抑制剂如克拉维酸等所抑制，但可被离子鳌合剂乙二胺四乙酸（EDTA）、菲咯啉或硫基化合物抑制所抑制。

金属β-内酰胺酶可由染色体和质粒介导，可在铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、粘质沙雷菌、肠杆菌属菌、肺炎克雷伯菌、嗜水气单胞菌和不动杆菌、脆弱类杆菌属、等细菌中检出此类酶。

一、发现和分布第一个报道的金属酶是从蜡样芽孢杆菌( Bacill us cereus) 中发现的，该酶为锌依赖酶。

20 世纪80 年代初期日本从嗜麦芽窄食单胞菌中鉴定出第二种锌依赖青霉素酶L1 型酶，随后又从嗜水气单胞菌和脆弱拟杆菌中鉴定出多种能水解亚胺培南的金属酶。

这些酶都由染色体基因编码。

该类金属酶分布在蜡样芽孢杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、脆弱拟杆菌、气单胞菌属和戈氏军团菌中，除嗜麦芽窄食单胞菌外,在临床上都极为罕见,而且都是单株散发的。

1991年日本学者在铜绿假单胞菌中发现了第一种质粒介导的金属酶( IMP21) ，不久又从脆弱拟杆菌中发现了一种可转移金属酶，这两个酶的发现意味着金属酶已经从单株散发向随机分布过渡。

现在已报道了10多种可转移金属酶: IMP21～8 和VIM21～3，分布在铜绿假单胞菌、不动杆菌和肠杆菌科细菌中，地域分布上已经不再局限于日本，现已分布至亚洲、欧洲和美洲的多个国家（见表1）。

大肠埃希菌产超广谱β-内酰胺酶的耐药性分析

.论著.大肠埃希菌产超广谱内酰胺酶的耐药性分析郭琼杰，杨柳，杨晨，王娜，王珊珊［摘要］目的分析大肠埃希菌(Escherichia coli,E.coli)产超广谱B-内酰胺酶(extended spectrum B-lactamases, ESBLs)的耐药性。

方法选取2017年6月〜2019年6月秦皇岛市第一医院收治的非重复大肠埃希菌感染80例患者作为研究对象，分别对其感染标本中的细菌进行检验、分离培养，运用常规鉴定技术鉴定细菌并进行药敏试验，使用纸片扩散法(K-B paper diffusion method,K-B法)检测E.coli,使用K-B法和国家临床实验室标准委员会(national committee for clinical laboratory standards,NCCLS)建议的双纸片协同试验进行ESBLs检测，统计E.coli ESBLs阳性株数并分析其耐药性。

结果非重复大肠埃希菌感染病例80例患者中E.coli ESBLs阳性株23株，占比28.75%,阴性株57例，占比71.25%。

E.coli ESBLs阳性株主要来源于尿液标本，之后依次为穿刺液、痰液、血液及引流液。

对E.coli ESBLs阳性株进行耐药性分析，结果显示亚胺培南的体外活性最好，耐药率最低为0.00%,其次为阿米卡星4.35%、头孢替坦4.35%、厄他培南4.35%、左氧氟沙星4.35%、头孢他啶4.35%、哌拉西林/他唑巴坦4.35%、妥布霉素4.35%；该试验中细菌对复方新诺明的耐药性最高为95.65%,其次为阿莫西林/克拉维酸91.30%、氨节西林91.30%、氨曲南86.96%、头孢曲松86.96%。

结论E.coli ESBLs对复方新诺明、阿莫西林/克拉维酸、氨节西林、氨曲南、头孢曲松有着较强的耐药性，对亚胺培南、阿米卡星、头孢替坦、厄他培南、左氧氟沙星、头孢他啶、哌拉西林/他唑巴坦、妥布霉素等药物较为敏感，临床治疗时应严格根据细菌分布特点结合其耐药情况进行合理给药。

β-内酰胺酶

TEM型酶分布很广，尤以TEMTEM型酶分布很广，尤以TEM-1型分布最广，出现频率最高，约占50%。染色体介导酶有K1型，现频率最高，约占50%。染色体介导酶有K1型， P99型及D31型，染色体基因决定细菌对抗生素 P99型及D31型，染色体基因决定细菌对抗生素固有耐药性，近代研究证明在院内感染病人中产生质粒介导酶的耐药菌，其产生耐药性大多是在接触抗生素后获得的，并通过耐药基因的转移而播散，也可由基因表达而传至下代。至今β-内酰播散，也可由基因表达而传至下代。至今β 胺酶的数量已超过200种，其中超广谱β 胺酶的数量已超过200种，其中超广谱β-内酰胺酶(extended spectrum β-lactamase,ESBL)已超 β-lactamase,ESBL)已超过50种。 50种。
2.2 B型β-内酰胺酶
B型β-内酰胺酶的活性依赖于2价过渡态金属内酰胺酶的活性依赖于2 离子，大多数情况下为Zn2+，此酶不被棒酸离子，大多数情况下为Zn2+，此酶不被棒酸抑制，但能被EDTA所抑制，按Bush分类属3 抑制，但能被EDTA所抑制，按Bush分类属3 群。按照核苷酸序列，此酶可分为2 群。按照核苷酸序列，此酶可分为2个亚型，一个亚型以L 酶为代表，另一亚型以A2酶和一个亚型以L-1酶为代表，另一亚型以A2酶和 CcrA酶为代表。L1酶和CcrA酶有相当广谱的 CcrA酶为代表。L1酶和CcrA酶有相当广谱的底物轮郭，能水解头孢西丁，也有报告可水解氨曲南。亚胺培南是A2酶的唯一底物，因解氨曲南。亚胺培南是A2酶的唯一底物，因此，A2酶也可称碳青霉烯酶。此，A2酶也可称碳青霉烯酶。
β-内酰胺酶
—细菌耐药性机制之一
柳州市中医院朱胜波
β-内酰胺类抗生素是目前临床抗感染治疗最普遍应用的一类抗生素，随着这类药物的广泛使用 (特别是滥用和误用)和致病菌的变迁，产生了病特别是滥用和误用) 原菌对药物的耐药性问题，而且耐药发生率相当高。细菌产生β 内酰胺酶(β-lactamase)是80%病高。细菌产生β-内酰胺酶(β-lactamase)是80%病原菌耐药的原因之一，另外约12%和8%病原菌原菌耐药的原因之一，另外约12%和8%病原菌 12% 的耐药分别与细菌细胞外膜通透性障碍和靶位的改变有关。本文对细菌产生β 改变有关。本文对细菌产生β-内酰胺酶所致的耐药性作一简要综述，以便采取相应对策以防止耐药性的蔓延。

金属β-内酰胺酶综述

金属β-内酰胺酶，属Bush分类3群，Ambler分类B类，该群酶最大特点是可以水解碳青霉烯类等抗生素，而对哌拉西林和氨曲南影响较小。

酶活性中心需金属锌离子的参与而发挥催化活性，故称为金属β-内酰胺酶。

一、发现和分布第一个报道的金属酶是从蜡样芽孢杆菌( Bacill us cereus) 中发现的，该酶为锌依赖酶。

这些酶都由染色体基因编码。

产超广谱β-内酰胺酶肠杆菌耐药性分析

耐药的一类酶，它主要由革兰阴性杆菌大肠埃希茵和肺炎克雷伯菌产生【。它能水解青霉素类、头孢菌素类和单酰胺类抗生素，而从
使之失效。随着ｐ内酰胺类抗菌药物的广泛应用，药菌株迅速增加，一耐尤其是超广谱口内酰胺酶（ＳＬ）细菌引起的耐药问题日一ＥＢｓ
医药与保健Ｍｅｉｎｎｅｌａｅ２１第１卷第３ｄｉｅｄＨａｔＣｒ００年ｃＡｈ８期
产超广谱ｌ３一内酰胺酶肠杆菌耐药性分析
郭绪平
【要】超广谱一内酰胺酶（ｘｅｄｄｓｅｔｍｂｔ —ｌｔｍｓＥＢｓ由质粒介导的能赋予细菌对多种Ｂ摘ｅｔｅｃｒｅａａａａｅｎｐｕｃｓ，ＳＬ）是一内酰胺类抗生素
趋严重，给临床治疗带来极大的困难。为了解ＥＢｓＳＬ菌株的流行情况，以及有效控制其传播和流行，拟对分离到的２５株大肠埃希２菌和９８株肺炎克雷伯茵进行了ＥＢｓＳＬ的检测，并进行药物敏感试验，现报告如下。
总阳性率ｌ．％（０３３。８５６／２）２２药敏试验结果．产ＥＢｓ阳性）不产ＥＢｓ的大肠埃ＳＬ（与ＳＬ
Ｍｕｌｒｉｔｎ琼脂购自重庆庞通生物技术开发公司。ｅｅ —Ｈｎｏｌ
１５ＥＢｓ检测：ＮＣＬ０４年推荐的纸片扩散法初筛．ＳＬ的按ＣＳ２０

儿童产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌感染的临床特征及药敏分析

ｉｈｌｒｎＭｅｈｄＴｈａａｏａｔｒａｃｌｕｅｉｐｔｍｒｍ０４ｗｅｅｃｌｃｅ．ｓｌＴｈｒｒ４（Ｂｎｃｉｅ．ｄｔｏｓｅｄｔｆｂｃｅｉｕｔｒｎｓｕｕｆｏ２０ｒｏｌｔｄＲｅｕｔｅｓｅｅａｅ４７ＥｃＥＳＬＳ＋）ｓｒｉｈｄｂｅｓｌｔｄｆｏ４９ｃｓｓ５．）ｉｈｓｙａ．ｌｆｔｅｃｓｓｗｅｅｕｄｒ３ｙａｓｏｄＴｈｒｒ７ｆｔｅｔａｎａｅｎｉｏａｅｒｍ２ａｅ（９８ｎｔｉｅｒＡｌｏｈａｅｒｎｅｅｒｌ．ｅｅａｅ２４ｏｈｍ（３９）ｗｅｅｕｄｒ１ｙａｓｏｄａｄ２４ｏｈｍｒｏｎｏｎｉｅｔｔｅａｈｇｎ．ｙｏｌｓ，ｌｍｙｉｎｅ６．ｒｎｅｅｒｌｎ４ｆｔｅｗｅｅｆｕｄｃｉｃｄｄｗｉｏｈｒｐｔｏｅｓＭｃｐａｍａＣｈａｄａａｄｒ — ｈｓｉａｏｙｓｎｙｉｌｉｕｒｈｈｅｏｎｔｇｐｔｏｅｓ５ｏｈｍ（６８）ｈｄｆｕｄｔｎｌｄｓａｅ．ｅｃｉｉａｐｒｔｒｙｃｔａｒｓｗｅｅｔｅｔｒｅｄｍｉａｉａｈｇｎ；１ｆｔｅ２．ｖｎ１ａｏｎａｉａｉｅｓｓＴｈｌｃｌｏｎ
Ｈａｅｇ，ｎｂｎｔ１丁ＰｈｌｒｎＳｓｉｌｆＷｕａＷｕａ３０６ｎｎＨｕＨｏｇｉｇｅａ．＾ｉｅ ’ Ｈｏｐｔｈｎ，ｈｎ４０１ＦＣｄａｏ［ｂｔｃ］ＯｊｃｉＴｖｓｉａｅｔｅｉｃｅｃｎｌｉｌｈｒｃｅｉｔｓｏｓｈｒｈａｃｉ（ｅＥＢｓｉｅｔｎＡｓａｔｒｂｅｔｅｏｉｅｔｔｉｎｅａｄｃｉｃａａｔｒｉｆｃｅｉｉｏｌｒ，ＳＬ＋）ｎｃｉｖｎｇｈｎｄｎａｃｓｃＥｃｆｏ

β-内酰胺酶的分类

β-内酰胺酶的分类
β-内酰胺酶可以分为四类：
1. 类A β-内酰胺酶：这是最常见的β-内酰胺酶，它能够降解广谱青霉素和第一代头孢菌素。

这些酶通常由革兰阴性菌产生。

2. 类B β-内酰胺酶：这些酶也称为金属β-内酰胺酶，因为它们需要金属离子（通常是锌）来发挥催化作用。

这些酶能够降解第二代头孢菌素和碳青霉烯类抗生素。

类B β-内酰胺酶主要由革兰阴性菌产生。

3. 类C β-内酰胺酶：这些酶主要由革兰阳性菌产生，能够降解广谱青霉素和第一代头孢菌素。

类C β-内酰胺酶通常不会降解第二代头孢菌素和第三代头孢菌素。

4. 类D β-内酰胺酶：这些酶由革兰阳性菌产生，能够降解广谱青霉素和第一代头孢菌素。

类D β-内酰胺酶通常不会降解第二代头孢菌素和第三代头孢菌素。

AmpC酶

AmpC酶AmpC 酶是AmpCβ内酰胺酶的简称。

是由肠杆菌科细菌或和绿脓假单胞菌的染色体或质粒介导产生的一类β内酰胺酶,属β内酰胺酶Ambler 分子结构分类法中的C 类和Bush Jacoby Medeiros 功能分类法中第一群,即作用于头孢菌素、且不被克拉维酸所抑制的β内酰胺酶。

故AmpC 酶又称作为头孢菌素酶。

AmpC 酶按其产生的方式分为3 类:诱导高产酶、持续高产酶和持续低产酶。

(1) 诱导高产酶:AmpC 酶的合成往往与β2内酰胺类抗生素的存在有关。

绝大部分肠杆菌科细菌和绿脓假单胞菌在正常条件下(即无β内酰胺类抗生素存在的条件下) 只产生少量的AmpC 酶。

而当有诱导作用的β内酰胺类抗生素存在的条件下,AmpC 酶的产量明显增加,增加的范围在100～1 000 倍之间。

(2) 持续高产酶:另有一部分产AmpC 酶的菌株不论在有无β内酰胺类抗生素存在的条件下均可持续高水平产生AmpC 酶,其原因为去阻遏突变,即调控基因之一的ampD 基因发生突变,产生的有缺陷的AmpD 蛋白,不能与另一种调控蛋白—AmpR 蛋白结合形成复合物,AmpR 蛋白即以激活子状态发挥激活作用,引起AmpC酶的大量表达。

质粒介导的AmpC 酶往往都属于此类AmpC 酶。

产生这种AmpC 酶的细菌对临床的危害最大,是临床微生物实验室检测的重点。

(3) 持续低产酶:还有极少部分产AmpC 酶的菌株,不论在有无β内酰胺类抗生素的存在的条件下均持续低水平的产生AmpC 酶,其原因可能是另一种调节基因—ampR 基因发生突变, 产生有缺陷的AmpR 蛋白,不能在无β内酰胺类抗生素存在的条件下起到抑制子的作用,也不能在有β内酰胺类抗生素存在的条件下起到激活子的作用,故AmpC 酶得以持续低水平地表达。

检测不同类型的AmpC 酶或检测产不同类型AmpC 酶的菌株,其方法也有所不同。

近年来,随着β内酰胺类抗生素、尤其是头孢菌素的广泛应用,产AmpC 酶的革兰阴性杆菌越来越多见,尤其是出现了(去阻遏) 持续高产AmpC 酶和质粒介导的AmpC 酶,导致耐药菌株广泛传播和临床对该类细菌感染的治疗困难,已引起临床的高度重视,故检测AmpC 酶具有非常重要的临床意义。

产超广谱β-内酰胺酶细菌的检测及耐药性分析

［３］郑于剑．我院胆道感染和术后腹腔感染的病原菌及
其药物敏感性［Ｄ］．广州：南方医科大学，２００９：４９．
［４］王雷．五倍子等１１味中药对产ＥＳＢＬｓ大肠埃希菌体
苷类、喹诺酮类、青霉素族、磺胺药的敏感率为７５％～９６％，抗
外抗菌效果研究［Ｄ］．西安：陕西中医学院，２００９：１－３４．
［６］李世文，康满珍．当代骨伤科妙方［Ｍ］．河南：河南科
学技术出版社，２０１７：２０９．
［７］李非，李丽，许强强．悬吊运动联合弹拨经筋治疗腰
可以促进和协调机体脏腑的功能活动。《素问·上古天真
背肌筋膜炎的临床观察［Ｊ］康复学报，２０１７，２７（３）：１８－２２．
蠹。”均强调运动的重要性。五禽戏属古代导引术之一，它要
伯菌和大肠埃希菌的耐药性［Ｊ］．中华检验医学杂志，２０００，
院分离的产ＥＳＢＬｓ细菌多重耐药现象比较严重，对庆大霉
阿米卡星耐药较高；对呋喃妥因耐药性较低；对亚胺培南全
部敏感如上表所示，２５株产ＥＳＢＬｓ细菌药敏结果。本组资
料中未测出伊米配能耐药株，但目前临床使用伊米配能较为
广泛，应继续雅尼检测，警惕伊米配能耐药株的出现。
捷、准确地检测出产ＥＳＢＬｓ菌，有助于控制其播散与暴发
［５］戴玮，罗鹏，张莉萍．７２６株肺炎克雷伯菌的分布特征
尕藏加，青海省果洛州玛沁县拉加镇中心卫生院主管检
四、结语
综上所述，产ＥＳＢＬｓ的细菌具有较高的交叉耐药性和多
（上接第７４页）
效明显高于对照组，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５），见表１。
ＥＳＢＬｓ菌株，探讨其耐药性是非常重要的。为了对防止产超

产新德里金属β-内酰胺酶大肠埃希菌耐碳青霉烯类药物相关机制研究和分子分型

㊀２０２１,３７(１)中国人兽共患病学报C h i n e s e J o u r n a l o f Z o o n o s e sD O I :１０．３９６９/j．i s s n ．１００２－２６９４．２０２０．００．１７９实验研究产新德里金属βＧ内酰胺酶大肠埃希菌耐碳青霉烯类药物相关机制研究和分子分型傅芬蕊１,２,张㊀娅１,３,潘玉红１,４,曹颖平１,４,郑培烝１,４福建省自然科学基金(N o ．２０１６J ０１４６６)通讯作者:郑培烝,E m a i l :z h e n g p e i z h e n g ＠a l i y u n ．c o m ;O R C I D :００００Ｇ０００２Ｇ６３４２Ｇ０７４５作者单位:１．福建医科大学附属协和医院,福州㊀３５０００１;２．宁德市医院,宁德㊀３５２０００;３．九江学院附属医院,九江㊀３３２０００;４．福建医科大学医学技术与工程学院,福州㊀３５０００４摘㊀要:目的㊀研究某三甲医院临床分离的产新德里金属βＧ内酰胺酶(N D M )大肠埃希菌的耐药机制和分子流行病学特征.方法㊀在某三甲医院收集的耐碳青霉烯类大肠埃希菌中利用聚合酶链反应(P C R )筛查是否携带N DM 基因,通过测序确定N DM 型别并进一步检测其它碳青霉烯酶相关基因和广谱βＧ内酰胺酶类耐药基因.通过载体构建和表达研究N D M Ｇ１㊁N D M Ｇ６及N D M Ｇ９对亚胺培南的水解能力.采用多位点序列分型(M L S T )对产N D M 大肠埃希菌进行分子分型.结果㊀共筛选出８株携带N D M 大肠埃希菌,其中２株为N D M Ｇ９型,６株为N D M Ｇ６型.４株大肠埃希菌同时携带N DM Ｇ６㊁T E M 和C T X ＧM Ｇ１基因,１株同时携带N DM Ｇ６㊁T E M 和C T X ＧM Ｇ９基因.携带N DM Ｇ１㊁N DM Ｇ６与N DM Ｇ９重组菌对亚胺培南均耐药,最小抑菌浓度(M I C )分别为３２μg /m L ㊁１２８μg /m L 和６４μg /m L .产N D M 大肠埃希菌M L S T 分型结果为S T ２２６㊁S T ６４８和S T １２８４型各１株,S T １０１型５株,此５株均来源于神经内科.结论㊀首次发现同时携带N DM Ｇ６㊁T E M 和C T X ＧM Ｇ１基因和携带N DM Ｇ６㊁T E M 和C T X ＧM Ｇ９基因的大肠埃希菌,N D M Ｇ６㊁N D M Ｇ９对亚胺培南的耐药性比N D M Ｇ１强,应引起重视.M L S T 分型结果提示某三甲医院可能存在耐碳青霉烯类大肠埃希菌的院内局部传播.关键词:大肠埃希菌;耐药;新德里金属βＧ内酰胺酶;多位点序列分型中图分类号:R ３７８．２㊀㊀㊀文献标识码:A ㊀㊀㊀文章编号:１００２－２６９４(２０２１)０１－００５３－０７C a r b a p e n e m Ｇr e s i s t a n c em e c h a n i s m s a n dm o l e c u l a r t y p i n g of E s c h e r i c h i a c o l i p r o d u c i ng N e wD e lh im e t a l βＧl a c t a m a s e F U F e n Ｇr u i １,２,Z H A N G Y a １,３,P A N Y u Ｇh o n g １,４,C A O Y i n g Ｇp i n g １,４,Z H E N GP e i Ｇz h e n g１,４(１．F u j i a n M e d i c a lU n i v e r s i t y U n i o n H o s p i t a l ,F u z h o u ３５０００１,C h i n a ;２．N i n g d eM u n i c i p a lH o s p i t a l ,N i n gd e ３５２０００,C h i n a ;３．J i u j i a n g U n i v e r s i t y A f f i l i a t e d H o s p i t a l ,J i u j i a n g ３３２０００,C h i n a ;４．S c h o o l o f M e d i c a lT e c h n o l o g y a n dE n g i n e e r i n g ,F u j i a n M e d i c a lU n i v e r s i t y ,F u z h o u ３５０００４,C h i n a )A b s t r a c t :T h e a i m o f t h i ss t u d y w a s t o i n v e s t i g a t e t h er e s i s t a n c e m e c h a n i s m sa n d m o l e c u l a re p i d e m i o l o gi c a l f e a t u r e so f E s c h e r i c h i ac o l i s t r a i n s p r o d u c i n g N e wD e l h im e t a l βＧl a c t a m a s e (N D M )c o l l e c t e d i n a t h i r d c l a s sAh o s p i t a l ．N DM g e n e sw e r e s c r e e n e dw i t hP C R i n c a r b a p e n e m Ｇr e s i s t a n t E s c h e r i c h i a c o l i s t r a i n s ．T y p e s o f N DM g e n e sw e r e i d e n t i f i e db y s e q u e n c i n g ．O t h e r c a r b a p e n e m Ｇr e s i s t a n c e r e l a t e d g e n e sa n de x t e n d e d Ｇs p e c t r u m ＧβＧl a c t a m a s e g e n e sw e r ed e t e c t e db y P C Rf o r N DM g e n e p o s i t i v e s t r a i n s ．A n e x p r e s s i o n s y s t e m w a s u s e d t o e v a l u a t e t h e i m i p e n e m Ｇh y d r o l y s i s a b i l i t y o fN D M Ｇ１,N D M Ｇ６a n dN D M Ｇ９．M o l e c u l a r t y p i n g o f E s c h e r i c h i a c o l i p r o d u c i n g N D M w a s p e r f o r m e dw i t h t h em u l t i l o c u s s e q u e n c e t y p i n g (M L S T )m e t h o d ．E i g h t s t r a i n s o f E s c h e r i c h i a c o l i p r o d u c i n g N D M w e r e i d e n t i f i e d ,a m o n g wh i c hs i xw e r eN D M Ｇ６s t r a i n s ,a n dt h er e m a i n d e rw e r eN D M Ｇ９s t r a i n s ．F o u r s t r a i n so f E s c h e r i c h i ac o l i w e r ef o u n dt os i m u l t a n e o u s l y c a r r y N DM Ｇ６,T E M a n d C T X ＧM Ｇ１g e n e s ,a n do n e s t r a i nw a s f o u n d t o s i m u l t a n e o u s l y c a r r y N DM Ｇ６,T E M a n d C T X ＧM Ｇ９g e n e s ．R e c o m b i n a n t E s c h e r i c h i a c o l i s t r a i n s e x p r e s s i n gN DM Ｇ１,N DM Ｇ６a n d N DM Ｇ９g e n e sw e r e r e s i s t a n t t o i m i pe n e m ,w i t h m i n i m u mi n h i b i t o r y c o n c e n t r a t i o n so f３２μg /m L ,１２８μg/m La n d６４μg /m L ,r e s p e c t i v e l y．M L S Tr e v e a l e d f o u r d i s t i n c t s e Ｇq u e n c e t y p e s (S T s ),a m o n g wh i c h f i v e s t r a i n s o f S T １０１w e r e c o l Ｇl e c t e d f r o mt h en e u r o l o g i c a l u n i t ,a n d t h e r e m a i n i n g t h r e e s t r a i n s w e r eS T ２２６,S T ６４８a n dS T １２８４,r e s p e c t i v e l y ．T h i s s t u d y r e po r t s t h e f i r s t i d e n t i f i c a t i o no f E s c h e r i c h i ac o l i s i m u l t a n e o u s l y c a r r y i n g N DM Ｇ６,T E M a n d C T X ＧM Ｇ１g e n e s ,o r N DM Ｇ６,T E M a n d ３５C T XＧMＧ９g e n e s．N o t a b l y,ND MＧ６w a s a s s o c i a t e dw i t h t h eh i g h e s t i m i p e n e mh y d r o l y s i s a b i l i t y,a n dw a s f o l l o w e db y N D MＧ９a n dN D MＧ１．T h eM L S Tr e s u l t s i n d i c a t e d t h a t an o s o c o m i a l i n f e c t i o no f c a r b a p e n e mＧr e s i s t a n tE s c h e r i c h i a c o l i o c c u r r e d l o c a l l y i na t h i r d c l a s sAh o s p i t a l．K e y w o r d s:E s c h e r i c h i a c o l i;r e s i s t a n c e;N e w D e l h im e t a l l oＧβＧl a c t a m a s e;m u l t i l o c u s s e q u e n c e t y p i n gS u p p o r t e db y t h eN a t u r a l S c i e n c eF o u n d a t i o no fF u j i a nP r o v i n c e(N o．２０１６J０１４６６)C o r r e s p o n d i n g a u t h o r:Z h e n g P e iＧz h e n g,E m a i l:z h e n g p e i z h e n g＠a l i y u n．c o m㊀㊀大肠埃希菌是引起人类各种感染如泌尿道㊁呼吸道㊁创面伤口的感染以及菌血症常见的病原体之一.近年来,由于抗菌药物使用不规范,大肠埃希菌对抗菌药物的耐药性明显增强,出现耐碳青霉烯类药物的大肠埃希菌.根据全国耐药性监测网２０１８年的数据,大肠埃希菌对碳青霉烯类药物全国平均耐药率为１．５％.碳青霉烯类药物是目前临床上控制革兰阴性菌感染最有效的抗生素之一,对大肠埃希菌具有强大抗菌活性,一旦出现耐药,将使得感染后的治疗变得十分困难.大肠埃希菌对碳青霉烯类药物最常见的耐药机制是产碳青霉烯酶[１].碳青霉烯酶是指所有能水解碳青霉烯类的βＧ内酰胺酶,依据A m b l e r分子分类将碳青霉烯酶分为A类碳青霉烯酶㊁B类金属βＧ内酰胺酶(M e t a l l oＧβＧl a c t a m a s e,M B L)和D类苯唑西林酶(O x a c i l l i n a s e,O X A).自２００９年在印度分离的大肠埃希菌中发现新德里金属βＧ内酰胺酶１(N e w D e l h im e t a l l oＧβＧl a c t a m a s eＧ１,N D MＧ１)以来,产N D M型酶的大肠埃希菌在世界范围内被广泛报道,而亚洲大陆被认为是主要的流行区域,特别是中国和印度[２],目前已发现２０多种型别的N D M.本文收集来自住院患者的耐碳青霉烯类药物大肠埃希菌８株,对其耐药机制和分子分型进行研究,结果报道如下.１㊀材料和方法１．１㊀菌株来源㊀从住院患者临床标本中分离的８株对亚胺培南耐药的大肠埃希菌.１．２㊀仪器与试剂㊀V I T E KＧ２c o m p a c t全自动微生物分析仪㊁革兰阴性细菌鉴定卡(G N)㊁药敏卡片(A S TＧG N１６)㊁亚胺培南E t e s t试纸条(法国生物梅里埃公司)㊁P C R扩增仪(美国A p p l i e dB i o s y s t e m s 公司)㊁凝胶成像分析系统(美国B I OＧR A D公司)㊁T a q D N A聚合酶(２．５U/μL)㊁d N T P(２．５mm o l/L)㊁D N A纯化回收试剂盒㊁质粒小提试剂盒及T O P１０感受态细胞(北京天根生化科技有限公司)㊁p C R２．１载体(２５n g/μL)(美国I n v i t r o g e n生命技术公司)㊁MＧH琼脂(英国O x o i d公司)㊁引物的合成及P C R产物测序(上海博尚生物技术有限公司).１．３㊀方㊀法１．３．１㊀菌株鉴定与药敏㊀使用V I T E KＧ２c o m p a c t 全自动微生物分析仪进行菌株鉴定和药敏.采用亚胺培南E t e s t试纸条对亚胺培南耐药性进行验证.药敏结果根据２０１９年C L S I的抗菌药物敏感性试验标准进行判断.以大肠埃希菌A T C C２５９２２为质控菌株.１．３．２㊀碳青霉烯酶基因检测及测序㊀煮沸法提取细菌D N A模板,采用P C R法扩增常见的A类碳青霉烯酶基因(K P C㊁G E S㊁S M E㊁I M I/NM C)㊁B类金属酶基因(N DMＧl i k e㊁I MPＧl i k e㊁V I MＧl i k e㊁S I MＧ１㊁G I MＧ１和S P M)㊁D类苯唑西林酶基因(O X AＧ２３Ｇl i k e㊁O X AＧ２４Ｇl i k e㊁O X AＧ５８Ｇl i k e和O X AＧ１４３Ｇl i k e)和广谱βＧ内酰胺酶类耐药基因(S HV㊁T E M㊁C T XＧMＧ１群㊁C T XＧMＧ２群㊁C T XＧMＧ８群㊁C T XＧMＧ９群和C T XＧMＧ２５群).P C R的扩增体系均为２５μL:上下游引物各０．５μL(１０μmm o l/L),１μL模版D N A,２．５μL１０ˑT a q B u f fＧe r,２μLd N T P,０．５μLT a q聚合酶(２．５U/μL),用灭菌水补足至２５μL.反应参数为:９４ħ预变性５m i n;９４ħ３０s,５５ħ３０s,７２ħ１m i n,循环３０次;７２ħ延伸１０m i n.扩增产物用１％琼脂糖凝胶进行电泳,凝胶成像分析系统进行结果观察.电泳阳性产物送测序公司纯化并双向测序,所得测序结果使用B L A S T与G e n B a n k中的序列进行比对. N DMＧl i k e基因阳性的标本再用N DMＧf u l l引物扩增N DM型基因全长,经测序确定具体的N DM基因型别.引物名称㊁引物序列及预计产物长度见表１.４５中国人兽共患病学报２０２１,３７(１)表１㊀扩增耐药基因相关引物信息T a b ．１㊀P r i m e r i n f o r m a t i o n f o r r e s i s t a n c e g e n e a m pl i f i c a t i o n 引物名称引物序列(５ᶄＧ３ᶄ)扩增产物长度/b p参考文献K P C 上游:C G G T G T G T A C G C G A T G G A T A ５７４本文下游:T C C G G T T T T G T C T C C G A C T G G E S 上游:C G G T T T C T A G C A T C G G G A C A ３２１本文下游:C G T T T G G T T T C C G A T C A G C C S M E 上游:A T A G C G A C A A T G G G G C A A C A ３００本文下游:C A G C A G G A A C A C T A G C A C G AI M I /NM C上游:A T C G G T G G T C C T G A G G G T A T ３０１本文下游:C G T A T G C T C C G C A A C T A C C AO X A Ｇ２３Ｇl i k e 上游:G A T C G G A T T G G A G A A C C A G A ５０１[３]下游:A T T T C T G A C C G C A T T T C C A T O X A Ｇ２４Ｇl i k e 上游:G G T T A G T T G G C C C C C T T A A A２４６[３]下游:A G T T G A G C G A A A A G G G G A T T O X A Ｇ５１Ｇl i k e 上游:T A A T G C T T T G A T C G G C C T T G ３５３[４]下游:T G G A T T G C A C T T C A T C T T G G O X A Ｇ５８Ｇl i k e 上游:A A G T A T T G G G G C T T G T G C T G ５９９[３]下游:C C C C T C T G C G C T C T A C A T A CO X A Ｇ１４３Ｇl i k e 上游:T G G C A C T T T C A G C A G T T C C T１４９[５]下游:T A A T C T T G A G G G G G C C A A C CI M P Ｇl i k e 上游:G A A T A G (A /G )(A /G )T G G C T T A A (C /T )T C T C １８８[６]下游:C C A A A C (C /T )A C T A (G /C )G T T A T C V I M Ｇl i k e 上游:G T T T G G T C G C A T A T C G C A A C ３８２[６]下游:A A T G C G C A G C A C C A G G A T A G S I M Ｇ１上游:G T A C A A G G G A T T C G G C A T C G ５６９[６]下游:T G G C C T G T T C C C A T G T G A GG I M Ｇ１上游:T C A A T T A G C T C T T G G G C T G A C ７２[６]下游:C G G A A C G A C C A T T T G A A T G G S P M 上游:C T A A A T C G A G A G C C C T G C T T G ７９８[６]下游:C C T T T T C C G C G A C C T T G A T C N DM Ｇl i k e 上游:T C C T C A A C T G G A T C A A G C A G G ２４９本文下游:A A A A T A C C T T G A G C G G G C C A N DM Ｇf u l l 上游:A T G G A A T T G C C C A A T A T T A T G C A C ８１３[７]下游:T C A G C G C A G C T T G T C G G CP r e ＧN DM Ｇf u l l 上游:C A C C T C A T G T T T G A A T T C G C C ９８４[８]下游:C T C T G T C A C A T C G A A A T C G C S H V 上游:A G G A T T G A C T G C C T T T T T G ３９３[９]下游:A T T T G C T G A T T T C G C T C GT E M 上游:A T G A G T A T T C A A C A T T T C C G８５８[１０]下游:C C A A T G C T T A A T C A G T G A G G C T X ＧM Ｇ１群上游:G G T T T A A A A A A T C A C T G C G T C８３３[１１]下游:T T G G T G A C G A T T T T A G C C G C５５１期傅芬蕊,等:产新德里金属βＧ内酰胺酶大肠埃希菌耐碳青霉烯类药物相关机制研究和分子分型表１(续)引物名称引物序列(５ᶄＧ３ᶄ)扩增产物长度/b p参考文献C T X ＧM Ｇ２群上游:A T G A T G A C T C A G A G C A T T C G ８６５[１２]下游:T G G G T T A C G A T T T T C G C C G C C T X ＧM Ｇ８群上游:A T G A T A G A G A C A T C G C G T T A A G ８６０[１３]下游:C G G T G A C G A T T T T C G C G G C A G C T X ＧM Ｇ９群上游:A T G G T G A C A A A G A G A G T G C A ８６３[１２]下游:C C C T T C G G C G A T G A T T C T C C T X ＧM Ｇ２５群上游:C A C A C G A A T T G A A T G T T C A G９２３[１４]下游:T C A C T C C A C A T G G T G A G T １．３．３㊀N D M Ｇ１㊁N D M Ｇ６与N D M Ｇ９酶水解亚胺培南能力的比较㊀实验分为８组,见表２.分别扩增含与不含启动子序列的N DM Ｇ１㊁N DM Ｇ６及N DM Ｇ９型基因全长(携带N DM Ｇ１型基因的菌株来源于本实验室保存的菌株),引物分别为P r e ＧN DM Ｇfu l l 与N DM Ｇf u l l ,引物序列见表１,反应体系及条件同上.按D N A 纯化回收试剂盒方法对上述基因全长进行纯化,根据p C R２．１载体试剂说明书进行转化.根据抗性筛选与蓝白筛选挑选转化成功的重组T O P １０感受态细胞,进行P C R 检测耐药基因,测序证实转化是否成功和N D M 型别是否正确,琼脂稀释法测亚胺培南M I C 值.表２㊀N D M Ｇ１㊁N D M Ｇ６及N D M Ｇ９水解亚胺培南能力试验分组情况T a b ．２㊀G r o u p e d e v a l u a t i o no f t h e i m i p e n e m Ｇh y d r o l ys i s a b i l i t y o fN D M Ｇ１,N D M Ｇ６a n dN D M Ｇ９菌株解释㊀T O P １０T O P １０感受态细胞T O P １０＋p C R２．１含空载体的重组菌T O P １０＋p C R２．１＋N DM Ｇ１含N DM Ｇ１全长基因的重组菌T O P １０＋p C R２．１＋N DM Ｇ６含N DM Ｇ６全长基因的重组菌T O P １０＋p C R２．１＋N DM Ｇ９含N DM Ｇ９全长基因的重组菌T O P １０＋p C R ２．１＋P r e ＧN DM Ｇ１含启动子和N DM Ｇ１全长基因的重组菌T O P １０＋p C R ２．１＋P r e ＧN DM Ｇ６含启动子和N DM Ｇ６全长基因的重组菌T O P １０＋p C R ２．１＋P r e ＧN DM Ｇ９含启动子和N DM Ｇ９全长基因的重组菌１．３．４㊀多位点序列分型(M L S T )㊀对携带有N DM 基因的８株大肠埃希菌进行分型,P C R 扩增７个管家基因,即a d k ㊁f u m C ㊁g y r B ㊁i c d ㊁m d h ㊁pu r A 和r e c A ,所用引物序列及预计产物长度参考网站(h t Ｇt ps ://e n t e r o b a s e ．r e a d t h e d o c s ．i o /e n /l a t e s t /m l s t /m l s t Ｇl e g a c yＧi n f o Ｇe c o l i ．h t m l ).P C R 的扩增体系及扩增参数同上.扩增的P C R 产物的测序结果提交到p u b M L S T 数据库进行在线序列比对获得序列型.２㊀结㊀果２．１㊀菌株鉴定与表型筛查结果㊀本次收集的８株大肠埃希菌,经鉴定均为对亚胺培南不敏感的大肠埃希菌.经亚胺培南E t e s t 试纸法验证所有菌株均对亚胺培南不敏感.见表３.２．２㊀碳青霉烯酶基因筛查与测序结果㊀８株对亚胺培南不敏感大肠埃希菌所测A 类和D 类碳青霉烯酶基因均为阴性,B 类碳青霉烯酶基因中除N DM Ｇl i k e 基因为阳性外,其余均为阴性;广谱βＧ内酰胺酶基因中７株T E M 基因阳性,４株C T X ＧM Ｇ１基因阳性,１株C T X ＧM Ｇ９基因阳性,具体见表３.扩增８株N DM 基因全长,电泳结果与预计条带大小(８１３b p )相近,如图１所示.将P C R 产物进行双向测序,序列经比对分析,６株为携带N DM Ｇ６基因,２株为携带N DM Ｇ９基因,见表３.２．３㊀N D M Ｇ１㊁N D M Ｇ６和N D M Ｇ９水解亚胺培南能力结果㊀以T O P １０感受态细胞和含有空载体的重组菌作为阴性对照,仅含有N DM Ｇ１Ｇfu l l 基因㊁N DM Ｇ６Ｇf u l l 基因和N DM Ｇ９Ｇf u l l 基因的重组菌,因不含启动子,N DM 型基因无法表达,故表现为对亚胺培南敏感,与阴性对照组结果相同,M I C 值均为０．２５μg /m L .而含有P r e ＧN DM Ｇ１Ｇfu l l 基因㊁６５中国人兽共患病学报２０２１,３７(１)表３㊀８株产新德里金属βＧ内酰胺酶大肠杆菌临床相关信息㊁耐药基因检测及分子分型结果T a b ．３㊀R e l a t e d c l i n i c a l i n f o r m a t i o n ,r e s i s t a n c e g e n e d e t e c t i o na n dm o l e c u l a r t y p i n g o f e i gh t s t r a i n s o f E s c h e r i c h i a c o l i p r o d u c i n g N e wD e l h im e t a l βＧl a c t a m a s e 科室年龄(岁)标本类型亚胺培南E t e s t 试纸法碳青霉烯酶基因广谱βＧ内酰胺酶基因M L S T分型结果康复科５３中段尿＞３２(R )N DM Ｇ６T E M S T １０１神经内科８６中段尿８(R )N DM Ｇ６T E M ,C T X ＧM Ｇ１S T １０１神经内科８１中段尿４(R )N DM Ｇ６T E M ,C T X ＧM Ｇ１S T １０１神经内科８４中段尿＞３２(R )N DM Ｇ６T E M ,C T X ＧM Ｇ１S T １０１神经内科６７中段尿＞３２(R )N DM Ｇ６T E M ,C T X ＧM Ｇ１S T １０１血液科６０分泌物３(I )N DM Ｇ６T E M ,C T X ＧM Ｇ９S T ６４８呼吸内科６４痰２(I)N DM Ｇ９－S T １２８４小儿外科１７分泌物１２(R )N DM Ｇ９T E MS T ２２６１Ｇ８分别为８株待检菌株;M 为D N A m a r k e r;阴性为阴性对照图１㊀N D M 基因扩增产物电泳图F i g ．１㊀E l e c t r o ph o r e s i s o fP C R p r o d u c t s o f t h e N D M g e n e P r e ＧN DM Ｇ６Ｇf u l l 基因及P r e ＧN DM Ｇ９Ｇf u l l 型基因的重组菌对亚胺培南均耐药,对亚胺培南的M I C 值分别为３２μg /m L ㊁１２８μg /m L 和６４μg/m L .２．４㊀M L S T 结果㊀对该８株耐药大肠埃希菌进行分子分型,S T １０１型有５株㊁S T ２２６㊁S T ６４８和S T １２８４型各１株.见表３.３㊀讨㊀论自２００９年首次发现产N D M Ｇ１酶的菌株以来,产N D M 型酶的菌株迅速向其他国家播散,在世界各地均有发现并报道.我国及世界上流行的分离菌中检出率较高的N D M 型酶基因主要为N DM Ｇ１和N DM Ｇ５[１５].本次实验在８株大肠埃希菌中均检测出N DM 基因,其中６株携带N DM Ｇ６基因,２株携带N DM Ｇ９基因.而N DM Ｇ６基因在２０１２年第一次从新西兰病人携带的大肠杆菌中鉴定出来以来[１６],国内外关于N DM Ｇ６基因报道均较少见.N DM Ｇ９基因是我国学者２０１４年在肺炎克雷伯菌中首次报道发现[１７],目前已在韩国㊁我国大陆及台湾地区等地均发现了携带N DM Ｇ９基因的大肠杆菌㊁肺炎克雷伯菌等细菌[１８].为了进一步分析菌株耐药基因的携带情况,还筛查８株耐药菌的广谱βＧ内酰胺酶基因,发现大肠埃希菌中存在多种耐药基因共存现象,几乎所有的耐药菌株均携带有T E M 基因,４株耐药菌同时携带有N DM Ｇ６㊁T E M 和C T X ＧM Ｇ１基因,１株同时携带N DM Ｇ６㊁T E M 和C T X ＧM Ｇ９基因,目前国内外均未见此类报道.本文结果显示N D M Ｇ１㊁N D M Ｇ６和N D M Ｇ９水解亚胺培南能力从强到弱依次为N D M Ｇ６㊁N D M Ｇ９和N D M Ｇ１,文献中未见同时比较以上３种型别N D M 水解亚胺培南能力的报道.对于N DM 型基因,目前已发现了２０多个型别,而它们之间大多只有几个碱基的不同.N DM Ｇ６基因㊁N DM Ｇ９基因与N DM Ｇ１基因的区别是分别在基因６９８位置(CңT )和４５４位置(GңA )上存在有一个碱基的改变,从而导致氨基酸分别由丙氨酸转变为缬氨酸㊁谷氨酸转变为赖氨酸.氨基酸的改变会影响N D M 蛋白的二级结构,可能改变N D M 蛋白的空间结构,从而改变N D M 与底物即碳青霉烯类药物的结合特性,表现出不同的水解能力.不同类型的N D M 水解碳青霉烯类药物的具体机制有待进一步研究.本次研究还采用M L S T 法对８株耐药大肠埃希菌进行分型,结果为:５株携带N DM Ｇ６基因大肠埃希菌为S T １０１型,１株携带N DM Ｇ６基因大肠埃７５１期傅芬蕊,等:产新德里金属βＧ内酰胺酶大肠埃希菌耐碳青霉烯类药物相关机制研究和分子分型希菌为S T６４８型,有２株携带N DMＧ９基因大肠埃希菌分别为S T２２６型和S T１２８４型.在２０１２年首次报道产N DMＧ６基因的大肠埃希菌,其分型结果也为S T１０１型,而在国外报道,产N DM型基因的大肠埃希菌中,也有发现其M L S T分型结果为S T１０１型[１９],提示大肠埃希菌S T１０１型与N D M型碳青霉烯酶基因关系密切.S T６４８型大肠埃希菌常在产超广谱βＧ内酰胺酶的大肠埃希菌中发现[２０],在英国㊁日本分别首次报道产N DMＧ５和N DMＧ７基因的大肠埃希菌,其分型结果均为S T６４８型[２１],国内学者也有在S T６４８型大肠埃希菌中发现N DMＧ５基因,但并未检测出携带有N DMＧ６基因,国际上也并未发现携带有N DMＧ６基因的S T６４８型.产N DM基因的S T１２８４型大肠埃希菌在国内外鲜有报道发现,第一次在S T１２８４型大肠埃希菌中检出N DMＧ５基因是在２０１５年,而后虽有再次检出N DMＧ５基因,但到目前为止未检出携带有包括N DMＧ９基因在内其它N DM型基因.国内外均未在S T２２６型大肠埃希菌中发现N DM型基因.本次分离的８株耐药大肠埃希菌有５株M L S T 分型结果一致,均为S T１０１型,且均检出N DMＧ６基因.其中４株来自神经内科患者,１株来自康复科患者.通过查阅临床相关资料发现,这位康复科患者是在神经内科治疗一段时间后转入康复科的,且与２号患者曾在同一个病房治疗.２号患者长期卧床治疗,在其住院期间,３号㊁４号和５号患者也在神经内科治疗,而且３号和４号患者前后入住同一张病床.以上患者多为免疫力低下㊁有留置导尿管史和长期卧床的老年人.综合以上因素提示这些病人极有可能是在医院内发生了交叉感染.对此,临床上应尽量缩短留置导尿管的时间㊁合理使用抗菌药物㊁规范医护人员的操作和加强对各种医疗器械的消毒措施,同时应重视并加强院感监控力度,避免耐药菌株的传播和医院内感染的发生.利益冲突:无引用本文格式:傅芬蕊,张娅,潘玉红,等．产新德里金属βＧ内酰胺酶大肠埃希菌耐碳青霉烯类药物相关机制研究和分子分型[J]．中国人兽共患病学报,２０２１,３７(１):５３Ｇ５９．D O I:１０．３９６９/j．i s s n．１００２Ｇ２６９４．２０２０．００．１７９参考文献:[１]T a nK,N g u y e n J,N g u y e nK,e t a l．P r e v a l e n c e o f t h e c a r b a p e nＧe mＧh e t e r o r e s i s t a n t p h e n o t y p e a m o n g E S B LＧp r o d u c i n g E s c h eＧr i c h i a c o l i a n dK l e b s i e l l a p n e u m o n i a e c l i n i c a l i s o l a t e s[J]．JA n t iＧm i c r o bC h e m o t h e r,２０２０,７５(６):１５０６Ｇ１５１２．D O I:１０．１０９３/j a c/ d k a a０４８[２]L i J,Y uT,T a oX Y,e t a l．E m e r g e n c e o f a nN D MＧ５Ｇp r o d u c i n g E s c h e r i c h i a c o l i s e q u e n c e t y p e４１０c l o n e i n i n f a n t s i n a c h i l d r e n s h o s p i t a l i n C h i n a[J]．I n f e c t D r u g R e s i s t,２０２０,１３:７０３Ｇ７１０．D O I:１０．２１４７/I D R．S２４４８７４[３]W o o d f o r dN,E l l i n g t o n M J,C o e l h oJ M,e t a l．M u l t i p l e xP C R f o r g e n e se n c o d i n gp r e v a l e n tO X Ac a r b a p e n e m a s e s i n A c i n e t oＧb a c t e r s p p[J]．I n t JA n t i m i c r o bA g e n t s,２００６,２７(４):３５１Ｇ３５３．D O I:１０．１０１６/j．i j a n t i m i c a g．２００６．０１．００４[４]B r o w nS,Y o u n g H K,A m y e s S G．C h a r a c t e r i s a t i o n o fO X AＧ５１, an o v e lc l a s s D c a r b a p e n e m a s ef o u n di n g e n e t i c a l l y u n r e l a t e d c l i n i c a l s t r a i n so f A c i n e t o b a c t e rb a u m a n n i i f r o m A r g e n t i n a[J]．C l i n M i c r o b i o l I n f e c t,２００５,１１(１):１５Ｇ２３．D O I:１０．１１１１/j．１４６９Ｇ０６９１．２００４．０１０１６．x[５]H i g g i n sP G,L e h m a n n M,S e i f e r t H．I n c l u s i o no f O X AＧ１４３p r i m e r si na m u l t i p l e x p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n(P C R)f o r g e n e s e n c o d i n gp r e v a l e n tO X Ac a r b a p e n e m a s e s i n A c i n e t o b a c t e r s p p[J]．I n tJA n t i m i c r o b A g e n t s,２０１０,３５(３):３０５．D O I:１０．１０１６/j．i j a n t i m i c a g．２００９．１０．０１４[６]M e n d e sR E,K i y o t aK A,M o n t e i r o J,e t a l．R a p i dd e t e c t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o no fm e t a l l oＧb e t aＧl a c t a m a s eＧe n c o d i n g g e n e s b y m u l t iＧp l e x r e a lＧt i m eP C Ra s s a y a n dm e l t c u r v e a n a l y s i s[J]．JC l i n M iＧc r o b i o l,２００７,４５(２):５４４Ｇ５４７．D O I:１０．１１２８/J C M．０１７２８Ｇ０６[７]H o r n s e y M,P h e eL,W a r e h a m D W．An o v e l v a r i a n t,N D MＧ５, o ft h e N e w D e l h im e t a l l oＧβＧl a c t a m a s ei na m u l t i d r u gＧr e s i s t a n t E s c h e r i c h i a c o l i S T６４８i s o l a t e r e c o v e r e d f r o ma p a t i e n t i n t h eUＧn i t e dK i n g d o m[J]．A n t i m i c r o b A g e n t s C h e m o t h e r,２０１１,５５(１２):５９５２Ｇ５９５４．D O I:１０．１１２８/A A C．０５１０８Ｇ１１[８]K a a s eM,N o r d m a n nP,W i c h e l h a u sT A,e t a l．N D MＧ２c a r b a pＧe n e m a s e i n A c i n e t o b a c t e r b a u m a n n i i f r o m E g y p t[J]．JA n t i m iＧc r o bC h e m o t h e r,２０１１,６６(６):１２６０Ｇ１２６２．D O I:１０．１０９３/j a c/d k r１３５[９]B h a t t a c h a r j e eA,S e n M R,P r a k a s hP,e t a l．R o l e o f b e t aＧl a c t aＧm a s e i n h i b i t o r s i ne n t e r o b a c t e r i a l i s o l a t e s p r o d u c i n g e x t e n d e dＧs p e c t r u mb e t aＧl a c t a m a s e s[J]．JA n t i m i c r o bC h e m o t h e r,２００８,６１(２):３０９Ｇ３１４．D O I:１０．１０９３/j a c/d k m４９４[１０]T o n k iM,M o h a rB,Šišk oＧK r a l j e v iK,e t a l．H i g h p r e v a l e n c e a n d m o l e c u l a rc h a r a c t e r i z a t i o n o fe x t e n d e dＧs p e c t r u mβＧl a c t aＧm a s eＧp r o d u c i n g P r o t e u s m i r a b i l i s s t r a i n s i ns o u t h e r nC r o a t i a [J]．J M e d M i c r o b i o l,２０１０,５９(P t１０):１１８５Ｇ１１９０．D O I:１０．１０９９/j mm．０．０１６９６４Ｇ０[１１]P a r kY J,L e eS,K i m Y R,e t a l．O c c u r r e n c e o f e x t e n d e dＧs p e cＧt r u m(b e t a)Ｇl a c t a m a s e sa n d p l a s m i dＧm e d i a t e d A m p C(b e t a)Ｇl a c t a m a s e s a m o n g K o r e a ni s o l a t e so f P r o t e u s m i r a b i l i s[J]．JA n t i m i c r o bC h e m o t h e r,２００６,５７(１):１５６Ｇ１５８．D O I:１０．１０９３/ j a c/d k i４０８[１２]G a r r e cH,D r i e u xＧR o u z e t L,G o l m a r d J L,e t a l．C o m p a r i s o n o f n i n e p h e n o t y p i c m e t h o d sf o rd e t e c t i o n o fe x t e n d e dＧs p e c t r u mb e t aＧl ac t a m a s e p r od u c t i o nb y E n te r o b a c t e r i a c e a e[J]．JC l i nM iＧc r o b i o l,２０１１,４９(３):１０４８Ｇ１０５７．D O I:１０．１１２８/J C M．０２１３０Ｇ１０[１３]N a v o nＧV e n e z i a S,C h m e l n i t s k y I,L e a v i t tA,e t a l．D i s s e m i n aＧt i o no f t h e C T XＧMＧ２５f a m i l y b e t aＧl a c t a m a s e s a m o n g K l e b s i e l l a８５中国人兽共患病学报２０２１,３７(１)p n e u m o n i a e,E s c h e r i c h i a c o l i a n d E n t e r o b a c t e rc l o a c a e a n d iＧd e n t i f i c a t i o no f t h en o v e l e n z y m eC T XＧMＧ４１i n P r o t e u sm i r aＧb i l i s i n I s r a e l[J]．JA n t i m i c r o bC h e m o t h e r,２００８,６２(２):２８９Ｇ２９５．D O I:１０．１０９３/j a c/d k n１８２[１４]G o r e nM G,N a v o nＧV e n e z i a S,C h m e l n i t s k y I,e t a l．C a r b a p e nＧe mＧr e s i s t a n tK P CＧ２Ｇp r o d u c i n g E s c h e r i c h i ac o l i i na T e lA v i vM e d i c a lC e n t e r,２００５t o２００８[J]．A n t i m i c r o b A g e n t s C h eＧm o t h e r,２０１０,５４(６):２６８７Ｇ２６９１．D O I:１０．１１２８/A A C．０１３５９Ｇ０９[１５]Z o u H,J i aX,L i u H,e t a l．E m e r g e n c eo fN D MＧ５Ｇp r o d u c i n g E s c h e r i c h i ac o l i i nat e a c h i n g h o s p i t a l i nC h o n g q i n g,C h i n a: I n c FＧt y p e p l a s m i d s m a y c o n t r i b u t e t o t h e p r e v a l e n c e o f b l a N D MＧ５[J]．F r o n tM i c r o b i o l,２０２０,１１:３３４．D O I:１０．３３８９/ f m i c b．２０２０．００３３４[１６]W i l l i a m s o nD A,S i d j a b a tH E,F r e e m a nJ T,e ta l．I d e n t i f i c aＧt i o na n dm o l e c u l a r c h a r a c t e r i s a t i o no fN e wD e l h im e t a l l oＧβＧl a cＧt a m a s eＧ１(N D MＧ１)Ｇa n d N D MＧ６Ｇp r o d u c i n g E n t e r o b a c t e r i a c e a e f r o m N e w Z e a l a n d h o s p i t a l s[J]．I n tJ A n t i m i c r o b A g e n t s,２０１２,３９(６):５２９Ｇ５３３．D O I:１０．１０１６/j．i j a n t i m i c a g．２０１２．０２．０１７[１７]W a n g X,L iH,Z h a oC,e t a l．N o v e lN D MＧ９m e t a l l oＧβＧl a c t aＧm a s e i d e n t i f i e d f r o maS T１０７K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e s t r a i n iＧs o l a t e d i nC h i n a[J]．I n t JA n t i m i c r o bA g e n t s,２０１４,４４:９０Ｇ９１．D O I:１０．１０１６/j．i j a n t i m i c a g．２０１４．０４．０１０[１８]L i nY C,K u r o d a M,S u z u k i S,e t a l．E m e r g e n c eo f a n E s c h eＧr i c h i a c o l i s t r a i n c oＧh a r b o u r i n g m c rＧ１a n db l a N D MＧ９f r o ma uＧr i n a r y t r a c t i n f e c t i o n i nT a i w a n[J]．JG l o bA n t i m i c r o bR e s i s t,２０１９,１６:２８６Ｇ２９０．D O I:１０．１０１６/j．j g a r．２０１８．１０．００３[１９]Q a m a rMU,W a l s hT R,T o l e m a nMA,e t a l．D i s s e m i n a t i o n o f g e n e t i c a l l y d i v e r s e N D MＧ１,Ｇ５,Ｇ７p r o d u c i n gＧG r a mＧn e g a t i v e p a t h o g e n s i s o l a t e d f r o m p e d i a t r i c p a t i e n t s i nP a k i s t a n[J]．F uＧt u r eM i c r o b i o l,２０１９,１４(１):６９１Ｇ７０４．D O I:１０．２２１７/f m bＧ２０１９Ｇ００１２[２０]P e i r a n oG,P i t o u t J D D．E x t e n d e dＧS p e c t r u mβＧL a c t a m a s eＧP r oＧd u c i n g E n t e r o b a c t e r i a c e a e:u p d a t eo n m o l e c u l a re p i d e m i o l o g y a n dt r e a t m e n to p t i o n s[J]．D r u g s,２０１９,７９(１４):１５２９Ｇ１５４１．D O I:１０．１００７/s４０２６５Ｇ０１９Ｇ０１１８０Ｇ３[２１]M i z u n oY,Y a m a g u c h iT,M a t s u m o t oT．Af i r s t c a s eo fN e wD e l h im e t a l l oＧβＧl a c t a m a s eＧ７i na nE s c h e r i c h i ac o l i S T６４８i s oＧl a t e i nJ a p a n[J]．J I n f e c tC h e m o t h e r,２０１４,２０(１２):８１４Ｇ８１６．D O I:１０．１０１６/j．j i a c．２０１４．０８．００９收稿日期:２０２０Ｇ０５Ｇ２２㊀编辑:张智芳(上接第５２页)[２９]S c h e y K L,W a n g Z,W e n k e J L,e t a l．A q u a p o r i n s i n t h e e y e: e x p r e s s i o n,f u n c t i o n,a n dr o l e s i no c u l a rd i s e a s e[J]．B i o c h i mB i o p h y sA c t a,２０１４,１８４０(５):１５１３Ｇ１５２３．D O I:１０．１０１６/j．b b a g e n．２０１３．１０．０３７[３０]H i b u s eT,M a e d aN,N a g a s a w aA,e t a l．A q u a p o r i n s a n d g l y cＧe r o lm e t a b o l i s m[J]．B i o c h i m B i o p h y sA c t a,２００６,１７５８(８):１００４Ｇ１０１１．D O I:１０．１０１６/j．b b a m e m．２００６．０１．００８[３１]A l v a r a d oM E,R u b i a n oC,Sán c h e zW,e t a l．C a l c i u mＧb i n d i n g p r o t e i n s t h a t a r e t y p e Bᵡr e g u l a t o r y s u b u n i t s o f p h o s p h a t a s e２A i n G i a r d i ai n t e s t i n a l i s[J]．P a r a s i t o lR e s,２０１８,１１７(１０):３２０５Ｇ３２１４．D O I:１０．１００７/s００４３６Ｇ０１８Ｇ６０１９Ｇz[３２]P r a s a dR,A t u l,S o n iA,e t a l．E x p r e s s i o n,c h a r a c t e r i z a t i o n, a n dc e l l u l a r l o c a l i z a t i o n o f k n o w p a i n s,p a p a i nＧl i k e c y s t e i n e p r oＧt e a s e s o f t h e P l a s m o d i u mk n o w l e s i m a l a r i a p a r a s i t e[J]．P L o S O n e,２０１２,７(１２):e５１６１９．D O I:１０．１３７１/j o u r n a l．p o n e．００５１６１９[３３]张佳凤,郝文波,肖斌,等．抗弓形虫水通道蛋白多肽抗体的制备及鉴定[J]．中国人兽共患病学报,２０１５,３１(１０):９０３Ｇ９０７．D O I:１０．３９６９/j．i s s n．１００２Ｇ２６９４．２０１５．１０．００２[３４]钟亮尹,刘思敏,曾智华,等．弓形虫C D P K５基因多克隆抗血清的制备及功能鉴定[J]．重庆医学,２０１６,４５(１６):２１８２Ｇ２１８５．D O I:１０．３９６９/j．i s s n．１６７１Ｇ８３４８．２０１６．１６．００８[３５]冯宪敏,张宏梅,李瑶,等．蓝氏贾第鞭毛虫P P D K多肽抗体制备与定位研究[J]．中国病原生物学杂志,２０１５,１０(２):１４４Ｇ１４７．D O I:１０．１３３５０/j．c j p b．１５０２１０[３６]肖斌,陈瑜,李林海,等．兔抗弓形虫C o r A家族M g２＋转运蛋白多肽抗体的制备及鉴定[J]．生物技术通讯,２０１６,２７(６):７７８Ｇ７８２．D O I:１０．３９６９/j．i s s n．１００９Ｇ０００２．２０１６．０６．００６[３７]C a o i l i S E．B e n c h m a r k i n g BＧc e l l e p i t o p e p r e d i c t i o nw i t h q u a n t iＧt a t i v ed o s eＧr e s p o n s ed a t ao na n t i p e p t i d ea n t i b o d i e s:t o w a r d s n o v e l p h a r m a c e u t i c a l p r o d u c td e v e l o p m e n t[J]．B i o m e d R e s I n t,２０１４,２０１４:８６７９０５．D O I:１０．１１５５/２０１４/８６７９０５[３８]W a n g F,Y eB．B i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i sa n dc o n s t r u c t i o no f p h y l o g e n e t i c t r e e o fA q u a p o r i n s f r o m E c h i n o c o c c u s g r a n u l o s u s [J]．P a r a s i t o lR e s,２０１６,１１５(９):３４９９Ｇ３５１１．D O I:１０．１００７/ s００４３６Ｇ０１６Ｇ５１１４Ｇ２收稿日期:２０２０Ｇ０４Ｇ２４㊀编辑:张智芳９５１期傅芬蕊,等:产新德里金属βＧ内酰胺酶大肠埃希菌耐碳青霉烯类药物相关机制研究和分子分型。

β-内酰胺酶研究进展

β-内酰胺酶研究进展摘要：青霉素于40年代初首次用于临床，几年后就从链球菌中分离到了青霉素酶，以后随着β-内酰胺类抗生素的不断开发和广泛应用，特别是近几十年来超广谱新品种的大量应用，β-内酰胺酶的种类、底物谱和耐药程度均以惊人的速度在发展，不能不引起格外的重视。

关键词：细菌，β-内酰胺酶，耐药任何生物都试图适应周围环境并生存下去，细菌个体小，易变异,拥有耐药能力，这是自然界的法则。

科学界有一种理论叫“中性突变漂变学说”，以“中性突变”为基础的分子进化学已逐渐形成。

这个学说认为，在分子水平上看，大部分基因突变对于生命体的生存既不产生有利效应，也不酿成不利后果，因此，这类突变在自然选择中是“中性”的。

在亿万年中，生物体内的基因不断产生中性突变，他们不受自然选择的支配，而是通过随机的偶然过程（即遗传漂变）在群体中固定下来或是被淘汰，结果就造成了基因和蛋白质分子的多样性，实现了分子的进化。

在药物选择性压力下，产β-内酰胺酶的细菌被筛选出来，得以泛滥。

为了对β-内酰胺酶有一个教深入了解，现将β-内酰胺酶的研究综述如下。

1 β-内酰胺类药物作用机理肽聚糖合成的最后一步是被称为青霉素结合蛋白（penicillin binding proteins，即PBPs）的转肽酶形成的。

β内酰胺类抗生素与D-丙氨酰-D-丙氨酸结构上的相似使得它们与青霉素结合蛋白结合（图一）。

β-内酰胺核不可逆地与青霉素结合蛋白的Ser403单元结合，使其失活，从而抑制细菌细胞壁的形成。

此外这个结合可能还激活细胞壁中的自溶酶。

图1 青霉素与青霉素结合蛋白结合使酶失活2 β-内酰胺酶起源β-内酰胺酶是指能催化水解6-氨基青霉烷酸(6-APA)和7-氨基头孢烷酸(7-ACA)及其N-酰基衍生物分子中β-内酰胺环酰胺键的灭活酶。

β-内酰胺酶来源于细菌细胞壁合成酶(即PBPs)，是由于细菌合成PBPs的过程中的基因的变异而造成的（图2）。

β-内酰胺类药物在这类酶的作用下，使β-内酰胺环水解开环，而β-内酰胺环是与PBPs结合的活性功能部位，因此β-内酰胺环的破坏使其失去了干扰细菌细胞壁合成的功能。

β-药理学-内酰胺类抗生素-药理学

第三十五章
β-内酰胺类抗生素
最新课件
1
第一节 β-内酰胺类作用机制及耐药性
1.β-内酰胺类作用机制
1）抑制转肽酶活性：β-内酰胺类抗生素是通过干扰细菌细胞壁肽聚糖的合成而显杀菌作用。β-内酰胺类抗生素和 PBPs活性位点通过共价键结合，抑制转肽酶活性，从而阻止了肽聚糖的合成，导致细胞壁缺损，引起细菌细胞死亡。PBPs是β-内酰胺类抗生素的作用靶位，是存在于细菌细胞膜上的蛋白，按分子量的不同可分为若干亚型。 PBPs数目、种类、分子大小及与抗生素的亲和力均因细菌菌种的不同而有较大的差异。β-内酰胺类抗生素通过与不同的PBPs结合阻碍其活性而表现出抗菌活性的差异。
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45
第五节 β-内酰胺酶抑制剂
克拉维酸(clavulanic acid) 舒巴坦(sulbactam) 三唑巴坦(tazobactam)
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46
特点：
1. 本身没有或只有很弱的抗菌活性 2. 抑制β-内酰胺酶 3. 对不产酶的细菌无增强效果 4. 增强β-内酰胺类抗生素的抗菌作用
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定
5. 对铜绿假单胞菌和厌氧菌无效
6. 肾毒性最新课件
38
二、第二代头孢菌素
1. 注射头孢呋辛 2.口服头孢克洛
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【抗菌作用特点】
1. 对G+ 菌抗菌作用次于第一代, 强于第三代 2. 对G-菌的作用强于第一代, 次于第三代 3. 对G- 杆菌产生的β-内酰胺酶高度稳定 4. 对铜绿假单胞菌无效 5. 对厌氧菌有一定作用 6. 肾毒性低
最新课件
2
2）增加细菌细胞壁自溶酶活性：β-内酰胺类抗生素使细菌裂解死亡最终是由于细胞壁自溶酶的活性增加，产生自溶或胞壁质水解。有证据表明 β-内酰胺类抗生素可阻滞自溶酶抑制物的作用。

谈关于流感嗜血杆菌的分离培养实验分析

谈关于流感嗜血杆菌的分离培养实验分析发表时间：2008-11-05T10:37:42.607Z 来源：《中小企业管理与科技》供稿作者：王连厚[导读] 摘要：目的：探讨耐氨苄西林的流感嗜血杆菌产生β-内酰胺酶的机制。

方法：对临床分离的112株流感嗜血杆菌耐药菌用纸片法作β-内酰胺酶测定，用PCR法检测产酶流感嗜血杆菌中的β-内酰胺酶基因的存在。

摘要：目的：探讨耐氨苄西林的流感嗜血杆菌产生β-内酰胺酶的机制。

方法：对临床分离的112株流感嗜血杆菌耐药菌用纸片法作β-内酰胺酶测定，用PCR法检测产酶流感嗜血杆菌中的β-内酰胺酶基因的存在。

结果：纸片法测得产酶菌株32株，产酶率28.6％(32/112)；32株产酶菌中PCR法测β-内酰胺酶基因阳性菌株29株，阳性率为90.6%(29/32)，其中质粒DNA模板组阳性为25株，基因组DNA模板组阳性为4例。

结论：(1)流感嗜血杆菌耐氨苄西林主要由质粒介导产生β-内酰胺酶所造成。

(2)PCR法是研究流感嗜血杆菌是否携带β-内酰胺酶基因及该基因所在位置的简便而有效的方法。

本实验室成功提高流感嗜血杆菌分离率的基础上，分离获得36株耐氨苄西林的流感嗜血杆菌，用纸片法测定它们产β-内酰胺酶的情况后，用PCR方法对产酶菌中β-内酰胺酶基因的存在与否进行检测，对耐氨苄西林的流感嗜血杆菌产生β-内酰胺酶机制作了初步分析。

一、实验采取的方法1、流感嗜血杆菌的分离培养收集痰或咽拭子标本，于1 h内接种于改良的哥伦比亚巧克力琼脂平板中，置5%CO2孵箱，37℃孵育18～24h,对疑似流感嗜血杆菌的菌落分别于血琼脂和营养琼脂平板上作卫星试验，仅在血琼脂平板上卫星试验阳性者为流感嗜血杆菌。

用常规的纸片法（K-B法）对每个菌株作体外药物敏感试验，根据美国NCCLS标准判读药敏结果。

从平板上挑取耐氨苄西林的单菌落接种于含3ml 液体HTM培养液的试管中，于5% CO2孵箱37℃孵育培养过夜，离心收集菌体用于质粒制备等后续实验。

内酰胺酶分类

内酰胺酶分类
内酰胺酶是一类广泛存在于细菌中的酶类，其作用为水解β-内
酰胺类抗生素，导致细菌的抗性降低。

内酰胺酶可根据其氨基酸序列和催化机制分为多个不同的分类。

第一类内酰胺酶是由单个酶基因编码的，其催化机制为酰基转移。

这一类酶包括TEM酶、SHV酶和CTX-M酶等。

它们可通过基因突变、基因水平的水平转移等方式在细菌中传播，导致多重耐药的出现。

第二类内酰胺酶是由两个酶基因编码的，其中一个基因编码β-
内酰胺酶，另一个基因编码抑制因子。

这一类酶包括AmpC酶和CMY
酶等。

它们的产生通常是由于某些基因突变或转座子的影响，导致抑制因子的失活或缺失，从而使酶的表达量上调。

第三类内酰胺酶是由多个酶基因编码的，其中包括不同的酶、抑制因子和调控基因。

这一类酶包括GES酶和NDM酶等。

它们的产生通常是由于多种基因变异的影响，导致酶的表达量上调和抑制因子的失活或缺失。

以上几类内酰胺酶在细菌中的广泛存在和其产生的多重耐药现
象已成为全球医疗卫生领域的一大难题。

因此，对内酰胺酶的分类和机制的深入研究具有重要意义，可以为制定有效的抗菌药物和治疗方案提供重要的理论依据。

- 1 -。

β-内酰胺酶的分类及检测

色谱法
高效液相色谱法
利用高效液相色谱技术分离和检测β内酰胺酶，通过检测色谱图中的峰形和峰高，确定β-内酰胺酶的浓度。
气相色谱法
利用气相色谱技术分离和检测β-内酰胺酶，通过检测色谱图中的峰形和峰高，确定β-内酰胺酶的浓度。
免疫学检测法
酶联免疫吸附试验
利用特异性抗体与β-内酰胺酶结合，通过酶标仪检测发光强度，从而确定β-内酰胺酶的浓度。
按照水解底物分类
TEM型
能水解青霉素类和头孢菌素类抗生素。
SHV型
主要水解头孢菌素类抗生素。
AmpC型
能水解所有β-内酰胺类抗生素。
OXA型
对所有β-内酰胺类抗生素的水解活性较低，但对碳青霉烯类抗生素的水解活性较高。
按照结构分类
Class A
Class B
属于丝氨酸酶，由一条多肽链组成，含有活性位点Ser-Thr-Gly。
放射免疫分析法
利用放射性同位素标记β-内酰胺酶，通过检测放射性强度，从而确定β-内酰胺酶的浓度。
03
β-内酰胺酶的检测标准
检测标准制定机构
美国临床和实验室标准协会（CLSI）
01
CLSI是全球知名的临床实验室标准制定机构，制定了一系列β-
内酰胺酶检测标准，为全球实验室提供指导和参考。
欧洲药典委员会（EDQM）
β-内酰胺酶的分类及检测
• β-内酰胺酶的分类 • β-内酰胺酶的检测方法 • β-内酰胺酶的检测标准 • β-内酰胺酶的检测现状与展望
01
β-内酰胺酶的分类
按照来源分类

微生物来源
由细菌、真菌等微生物产生的β-内酰胺酶。
动物来源
某些动物体内也存在的β-内酰胺酶，如某些鱼类。