产纤维素酶菌株鉴定

一株产纤维素酶益生芽孢杆菌的筛选与鉴定

一
株产纤维素酶益生芽孢杆菌的筛选与鉴定
但言陈元坤朱杰马跃刚
（重庆市水产科学研究所，重庆４０１１２１）
摘
要：从健康大鳍鲮（
）肠道菌群分离得到的２５株细菌，通过平板筛
选、发酵液酶活力测定和菌株安全性检测，筛选出一株具有较高产纤维素酶能力的益生芽孢杆菌ＤＱＨＹ一７菌株。通过对ＤＱＨＹ一７菌株形态观察、生理生化试验，对ＤＱＨＹ一７菌株进行了分类鉴定。结果显示：ＤＱＨＹ一７菌株具有较强的分泌纤维素酶能力，水解圈／菌落直径比为ｌ２．７７，２０ｈ发
３０ｍｉｎ。
１．２．４安全性试验取１００ｃｍ ×５０ｃｍ×６０ｃｍ的水族缸５只，充入曝气自来水，每缸￣．／Ｎ．２０只健康大鳍鲮（２０ ±
１．２方法
０．５）ｇ，取４只缸进行动物毒性试验：将最符合益生菌条件菌株接种在营养肉汤，２８ ℃培养２４ｈ后，用０．８５％无菌生理盐水稀释菌悬液至浓度
度接种３个平板，最后将平板置于２８ ℃恒温培
ＣＦＵ／Ｅ。将不同稀释度的菌悬液用无菌注射ｍ器对每尾大鳍鲮注射０．３ｍＬ作为试验组。对照
组则注射同体积的无菌生理盐水。注射后放回
水族箱中继续饲养，每日记录死亡情况，连续
观察７ｄ。

高产纤维素酶菌的筛选、鉴定及应用概述

农家参谋科技研究-220-NONG JIA CAN MOU高产纤维素酶菌的筛选、鉴定及应用概述王琪（河南师范大学生命科学学院，河南新乡，453007）【摘要】纤维素作为自然界最丰富的可再生资源之一，具有易获得、廉价等优点。

近年来，随着全球经济的迅速发展，能源消耗巨大，地球环境遭到严重破坏；因此，寻找可再生的清洁能源迫在眉睫，所以高产纤维素酶菌的筛选、鉴定及应用得到了人们广泛的关注，也是当今微生物学、农业科学、生态学的研究热点。

本文对之前高产纤维素酶菌的筛选、鉴定及应用的研究进行进行整合归总，展望今后的研究方向。

【关键词】高产纤维素；酶菌；筛选；鉴定1 高产纤维素酶自然界中纤维素广泛存在，但是降解过程生产成本高、环境污染问题，效果不理想。

经大量研究发现，纤维素酶是酶的一种，能够有效降解纤维素。

纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中。

细菌、真菌、动物体内等都能产生纤维素酶，所以近年来各界学者致力于筛选及鉴定高产的纤维素酶菌的研究。

2 高产纤维素酶的筛选与鉴定经查阅资料与分析，从一定地区取样如：土样、常年堆积干枯腐败植物茎秆、东亚飞蝗肠道内等；取一定量样品在三角瓶中富集培养；先梯度稀释，然后通过常规的稀释法或划线法接种涂布于马铃薯平板与牛肉膏蛋白胨分离培养基之上，37℃恒温培养24d,菌落计数,然后挑选菌落形态差异比较明显的菌落,重复划线接种于相应的琼脂平板上,直至纯化得到单菌落。

根据菌落形态观察，保存不同种的菌落，利用牙签蘸取菌落，放入离心管进一步富集；之后取富集液滴在圆形滤纸片上然后分别接种与刚果红培养基，保持对应关系，进行培养；继而用游标卡尺测量菌落周围水解透明圈的直径,并以其大小作为初步判断分解能力的指标；接下来把筛选出的菌株用单染色法、复染色法和指纹代谢法进行初步确定菌株类别；最后用16SrDNA 鉴定，通过PCR 电泳比对后送公司进行测序；确定菌株后进行酶活测定以及优化其酶活力的条件探究。

目前经大量实验，从陕北花马盐湖分离得到一株黑曲霉Aspergillusniger6MA1，发酵条件优化后酶活可达到47.8U/mL；从常年堆积干枯腐败植物茎秆中筛选出一株肠杆菌属Enterobactersp，在未进行发酵条件优化的情况下酶活达到为0.44u/mL；从湿润木屑中分离和筛选获得１株高产纤维素酶目的菌株ＬＹＷ－１等。

产纤维素酶菌种的筛选与优化

产纤维素酶菌种的筛选与优化一、菌种筛选的原理与方法菌种筛选的原理是通过筛选产纤维素酶活性高、产量大的菌种。

常用的菌种筛选方法有以下几种：1.传统菌种筛选：分离环境中的纤维素降解菌株，通过纤维素酶活性测定筛选产纤维素酶能力较强的菌株，再通过多次温育和活性测定，逐步筛选出高活性的菌株。

2.显性菌种筛选：利用纤维素酶结构上保守的区域设计引物，在环境DNA中扩增出纤维素酶基因片段，使用这些基因片段进行克隆构建，然后在宿主中进行表达，通过纤维素酶活性测定筛选产纤维素酶能力较强的菌株。

3.基因工程菌种筛选：利用已知纤维素酶的基因进行基因工程，通过载体导入宿主细胞中，通过外源表达基因，从而获得产纤维素酶菌种。

二、菌种优化的原理与方法菌种优化的原理是通过改变菌株基因组或环境条件，提高纤维素酶产量和活力。

常用的菌种优化方法有以下几种：1.自然进化优化：通过长期培养，逐渐挑选出产酶能力强、极端环境适应能力强的突变菌株。

2.诱变优化：利用物理、化学或基因工程等方法对菌株进行诱变，通过筛选获得产纤维素酶能力强、菌株稳定的变种。

3.基因工程优化：利用已知纤维素酶的基因进行基因编程，通过基因工程技术对菌株基因组进行改造，以提高纤维素酶的产量和活力。

三、未来的研究方向1.菌种筛选方法的改进与创新：应综合运用传统筛选、显性筛选和基因工程筛选等方法，发展新的高效、快速的菌种筛选方法。

2.菌种优化技术的优化与提高产量、活性：要通过生理、代谢工程的方法改造纤维素酶产生菌，提高纤维素酶的产量和活力。

3.开发新型纤维素酶菌株：从不同环境中分离筛选出产酶能力强的菌株，进一步发现和研究产纤维素酶的新菌株。

4.提高纤维素酶产量与废弃物转化率的研究：将纤维素酶应用于废弃物转化过程，提高纤维素酶产量和转化率。

综上所述，产纤维素酶菌种筛选与优化的研究是促进纤维素酶应用的关键。

通过不断改进筛选和优化方法，进一步开发新的菌种，提高纤维素酶的产量和活力，将对纤维素酶的应用产生积极的推动作用。

一株产纤维素酶真菌的筛选、鉴定及降解效果

ｃｎｉｏｓｏ０ｒｒｎａ２ｅｒｅＣｈｅｐａａｅｏｄｇｃｎｓＥ／ｅ）ｅｏｌｃｎｅ（Ｂ／ｅ）ａｄＢｏｄｔｎｆ２ａ８ｄｇｓ．Ｔｅｋｌｓｆｎｏｌａａｅ（ＧＣｎ，ｘｇｕａａＣＨＣｘｎ．ｉ１／ｉｔｅｖｕｅｕｓ
基。１）全国优秀博士学位论文专项基金（０５４；２０４）黑龙江省杰出青
年基金（Ｃ０９９。Ｊ２００）第一作者简介：李保深，，９５年２月生，男１８东北林业大学林学院，硕士研究生。通信作者：高大文，东北林业大学林学院，授。Ｅｍｉｄｗｎ教 — ａ：ａｅ— ｌ
ｇｅｓａｅ（．ａｅｅ．５，．８ｎ．８／ｓｃｖｌｌｏｉｓＢＧｓ）ｗｒ３８６２６１ａｄ１４７ＩｍＬｒｐｔｅ．ｙｄｅＵｅｅｉｙ
ＫｅｗｏｄＳｒｅｅａａｉｎｙｒｓｃｎｓｐｔ：Ｐｅｉｉｉｍｅｕｅｓ；１Ｓｒｅｒｏｎｃｌｕｄｃｍｂｎｌ８ＤＮＡ；Ｃｌｌｅ；Ｓａｎｎｌｃｒｎｍｉｒｓｏｅｅｌａｕｓｃｎｉｇｅｅｔｏｃｏｃｐｓ
ｇｏｇｉ．ｏｏａ＠ｍａｌｅｍ
１材料与方法
收稿日：１期２０年ｌ２０２月９日。责任编辑：红。程
１２分析方法。将纯培养菌株接人发酵培养基中，２、０／ｉ摇床８℃ １ｍｎ２ｒ培养７ｄ用移液枪吸取１ｍ，Ｌ发酵液离心（０／ｉ，９００ｒｍｎ５ｍｉ）上清液即为粗酶液。ｎ，酶活力的测定：滤纸糖化力的测定。取粗酶液０５ ① ．ｍ，Ｌ加入醋酸一醋酸钠缓冲液（Ｈ值４８０１ｏＬ２ｍ，ｐ．，．ｍｌ）Ｌ／然后加入一张（ｘ）１ｍ６ｍ新华１ｃｃ号滤纸， ℃恒温水浴１５０ｈ

一株产纤维素酶枸杞内生菌的分离鉴定

摘
要：通过组织分离法从健康枸杞植株体内分离到ｌ０株内生茵，经反复筛选及刚果红染色鉴定，获得一株较高活力
纤维素酶内生茵ＧＱＰ一３。结合茵落形态、生理生化特性及菌株特异性序列分析等手段，确定其分类归属。结果表明ＧＱＰ
一
３为类芽孢杆菌属，该茵的发酵液在中性条件下的ＣＭＣ酶活力可达２０．０Ｕ／ｍＬ。关键词：枸杞；纤维素酶；内生茵中图分类号：Ｑ９３— ３３１文献标志码：Ａ文章编号：１００１ — ８５８１（２０１３）０４－００３８－０５
ｎｄａＣＭＣｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｂｒｏｔｈｏｆｔｈｅｓｔｒａｉｎｉｎｈｅｔｎｅｕｔｒｌａｃｏｎｄｉｔｉｏｎｃｏｕｌｄｒｅａｃｈ２０．０Ｕ／ｍＬ．
一
３ｗａｓｈｅｔｅｎｄｏｇｅｎｅｔｉｃｓｔｒａｉｎｐｒｏｄｕｃｉｎｇｃｅｌｌｕｌａｓｅｗｉｔｈｈｉｇｈｅｒｖｉｇｏｒ，ｎｄａｉｔｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｒｅｐｅａｔｅｄｓｃｒｅｅｎｉｎｇａｎｄＣｏｎｇｏｅｄｒｄｙｉｎｇ
ｍｅｔｈｏｄ．Ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｃｌａｓｓｉｆｙｔｈｉｓｓｔｒａｉｎ，ｓｏｍｅｍｅａｎｓｗｅｒｅｕｓｅｄ，ｓｕｃｈａｓｃｏｌｏｎｉａｌｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃｌａａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃｌａｃｈａｒａｃ —

纤维素酶高产菌株的选育

纤维素酶高产菌株的选育
纤维素酶是一种能够分解纤维素的酶，对生物质的利用具有重要意义。

选育纤维素酶高产菌株是提高纤维素酶生产效率的关键。

以下是一些选育纤维素酶高产菌株的常用策略和方法：
1. 采用自然筛选法：从自然环境中采集植物残渣、堆肥等具有高纤维素含量的样品，通过培养和筛选获取纤维素酶高产菌株。

这种方法的优势是能够发现具有适应性强、高纤维素酶产量的菌株。

2. 遗传工程法：通过对已知具有高纤维素酶产量的菌株进行基因工程改造，引入其他有利于纤维素酶产量提高的基因或突变体。

3. 诱变法：通过化学物质（如EMS、亚硝酸钠等）或辐射（如紫外光、X射线等）处理菌株，诱发基因突变，筛选出纤维素酶高产突变菌株。

4. 基因筛选法：通过分析纤维素酶基因的表达水平和调控机制，筛选具有高纤维素酶基因表达水平和调控机制的菌株。

5. 代谢工程法：通过改造代谢途径，优化产生纤维素酶所需的底物和能量供应等因素，提高纤维素酶产量。

以上方法可根据实验室条件和研究目的选择合适的方法进行选育纤维素酶高产菌株。

产纤维素酶霉菌的筛选及初步鉴定

低，以将其剔除掉。可１４可降解纤维素真菌的复筛．
种类繁多，来源也很广。大多数纤维素酶主要来自微生物体心。目前，们对各种微生物（括真菌］人包和细菌）的纤维素酶的关注较多，其是源于真菌尤的纤维素酶。所有能分解微晶纤维素的真菌，能均或多或少地分泌纤维素酶，以纤维素酶的真菌源所
本研究使用羧甲基纤维素液体培养基富集培养环境样品，分离得到３产纤维素酶的霉菌。使用４株刚果红染色初筛和ＤＳ法复筛，到２株纤维素酶Ｎ得活较高的霉菌菌株ｗ００、ｘ０５同时还使用苏ｘ５３ｗｌ０。
℃培养４ —５ｄ进行活化，后接种到３Ｌ（５之０ｍ２０
ｍＬ三角瓶）ＤＰＡ液体培养基中，２ ℃ 、８／ｉ于８１０ｒｒｎａ下摇床发酵，３ｄ后取样测定上清发酵液中的ＣＭＣ
酶活力。
１５ＤＮ．Ｓ法测ＣＭＣ酶活
—
ｆｕｅｈｌｓｏｒｃｌａｅ—ｐｏｕｉｇｆｎｉｓａｎｒｓｌｔｄｔｒｕｈｅｒｈｎｕｔｒｎｙＣＭＣ —Ｎａｌｕｄｍｅｉｍ．ｒｄｃｎｇｔｉｓｗｅｅｉｏａｅｈｏｇｎｃｍｅｔｃｌｉｇｂｕｒｉｕｉｉｄｕｑ
ＤＩ１．９９ｊｉｎ１０－８．０１０．０Ｏ：３６／．ｓ．０９８１２１．３０２０ｓ４

从土壤里筛选产纤维素酶细菌的步骤

从土壤中分离产几丁质酶的真菌作者：王春学号:11101680摘要：几丁质是自然界中储量仅次于纤维素的生物多聚体,它广泛存在于真菌、硅藻、节肢动物和原生动物等生物体中,是绝大多数真菌细胞壁的结构物质,同时还是昆虫中肠围食膜的主要成分[1].几丁质酶(Chitinase,EC3.4.1.14)[2]可催化水解几丁质的β21,4糖苷键生成N2乙酰2D2氨基葡萄糖(NAG),它在植物病虫害,尤其是对真菌病的防治方面,以及在几丁质废物的转化和利用等方面都具有重要作用,其研究受到人们的广泛重视.通过几丁质作为碳源,从土壤中筛选产几丁质酶菌株.1 材料与方法1.1 培养基1.1.1 平板培养基 (1)细菌几丁质培养基(分离用):蛋白胨10g,K2HPO40.7g,MgSO40.5g,KH2PO40.3g,胶体几丁质5.0g,琼脂15～20g,蒸馏水1L,pH值为7.2.(2)纯几丁质培养基:胶体几丁质 5.0g,KNO31.0g,NaCl0.5g,K2HPO40.5g,MgSO40.5g,FeSO40.01g,琼脂20g,蒸馏水1L,pH值为7.2.1.1.2 摇瓶培养基 (1)种子培养基(LB培养基):蛋白胨10g,酵母膏5g,NaCl10g,蒸馏水1L,pH值为7.0.(2)发酵培养基:用细菌几丁质培养基(分离用),但不加琼脂1.2 菌株的分离1.2.1 菌株初步分离从生产几丁质的工厂排污沟附近土壤采集土样,经过烘干及风化干燥,置于60目分样筛过筛,备用.称取1g土样放入加有9mL无菌水的离心管,分别稀释制成10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6不同稀释倍数的土壤溶液.从10-3,10-4,10-5,10-6不同稀度倍数的4管土壤稀释液中各吸取0.1mL,接种在纯几丁质培养基和细菌几丁质培养基的平板上,用涂布棒涂布均匀,在30℃下培养72h.1.2.2 菌种的二次筛选从第1次稀释涂布的平板中挑取可以产生透明圈的菌落,再一次通过稀释涂布的方法,将其接种于纯几丁质平板和细菌几丁质平板上,培养72h,以取得纯菌落平板.从第2次筛选的纯菌平板上选取水解圈直径与菌落直径比最大的菌种,将其接种于50mL的LB种子培养基上,12h后以2%的接种量接于100mL的细菌几丁质发酵培养基中,在30℃下进行扩大培养.1.3 菌种的鉴定1.3.1 细菌染色体DNA提取从新培养产几个质酶活性高的革兰氏阴性细菌平板上,挑取一环菌落至加有500μLTE缓冲液的1.5mL微量离心管中,混匀后沸水浴1.5min,迅速低温离心(12000r・min-1)10min,取上层清液分装后,置4℃下保存备用.1.3.2 16SrDNA引物根据16SrDNA的结构,应用B2/B3做引物,该引物扩增片段包含V8和V9两个高变区,扩增产物大小为1050bp(basepair,碱基对)左右.这两个引物序列为B2:5’2ACGGGCGGTGTGTAC23’;B3:5’2CCTACGGGAGGCAGCAG23’.1.3.3 聚合酶链反应(PCR)检测 PCR反应体系为20μL,二次蒸馏水12.6μL,10倍扩增缓冲液2.0μL,25mmol・L-1Mg2+1.6μL,各2.5mmol・L-1的脱氧核苷三磷酸(dNTP)0.4μL,20μmol・L-1引物各1.0μL,DNA模板1.0μL,5GU・L-1Taq酶0.4μL.PCR循环:94℃预变性5min,94℃变性60s,50℃退火60s,72℃延伸90s,循环30次,并在72℃后延伸15min.1.3.4 扩增产物的电泳分析用1倍的TAE缓冲液配制质量分数为1%琼脂糖凝胶.取PCR 扩增产物10μL,加2μL溴酚蓝指示剂,混匀后加样,于100V下电泳1.5h,紫外灯下观察电泳结果.1.3.5 序列测定与分析将观察到的PCR产物切胶,用胶回收试剂盒回收后,连接到pMD182T上,送北京奥科生物公司进行测序.然后,将测序结果通过GeneBank进行BLAST序列比对,得出结果参考文献[1] BROGLIEKE.Chitinaseandplantprotection[J].RevPlantPathol,1993,2:4112421.[2] 李力,黄胜元,关雄.产几丁质酶的苏云金杆菌菌株筛选及酶合成条件研究[J].中国病毒学,2000,15(51):94297.[3] CHANGYu2cheng,YANGChiyea,LIChin,etal.IdentificationofBacillussp,Escherichiacoli,Salmonellasp,StaphylococcusspandVibriospwith16SribosomalDNA2basedoligonucleotidearrayhybridization[J].Internation2 alJournalofFoodMicrobiology,2006,107:1312137.[4] 张龙翔,张庭芳,李令媛.生化实验技术[M].北京:高教出版社,1997:1112116.[5] MOOREER,KRUGERAS,HAUBENL,etal.16SrRNAgenesequenceanalysesandinter2andintragenericre2lationshipsofXanthomonasspeciesandStenotrophomonasmaltophilia[J].FEMSMicrobiolLett,1997,151(2):1452 153.[6] MIYAJIT,OTTAY,SHIBATAT,etal.PurificationandcharacterizationofextracellularalkalineserineproteasefromStenotrophomonasmaltophiliastrainS21[J].LettApplMicrobiol,2005,41(3):2532257.[7] MADHA VAPNK,BAIJUTV,SANDHYAC,etal.ProcessoptimizationforantifungalchitinaseproductionbyTrichodermaharzianum[J].ProcessBiochem,2004,39:158321590.[8] NAWANINN,KAPADNISBP.Optimizationofchitinaseproductionusingstatisticsbasedexperimentaldesigns[J].ProcessBiochem,2005,40:6512660。

关于产纤维素酶菌分离及运用的叙述巽风

关于产纤维素酶菌分离及运用的叙述巽风产纤维素酶菌是一类能够分解植物细胞壁中的纤维素的微生物。

近年来，随着生物技术的发展，越来越多的产纤维素酶菌被分离和鉴定。

这些菌株可以应用于生物质资源的利用、饲料添加剂、环境治理等众多领域。

产纤维素酶菌的分离一般采用筛选法和环境法。

筛选法是根据菌株自然产生纤维素酶的特性，通过对土壤、水体、植物、动物肠道等环境中的微生物进行筛选，选出能够产生纤维素酶的菌株。

环境法则是以含有纤维素的废弃物、农作物秸秆等为菌落的生长基质，通过培养和筛选，筛选出产纤维素酶菌的菌株。

运用产纤维素酶菌可以实现对植物细胞壁的降解，将生物质转化为可直接使用的糖类物质，从而使生物质资源得到更加高效的利用。

此外，产纤维素酶菌还可以作为饲料添加剂，提高畜禽的饲料利用率，减少环境污染。

在环境治理方面，产纤维素酶菌还可以用于处理含有大量纤维素的废弃物和污水，减少环境负荷，推动循环经济发展。

总之，产纤维素酶菌的分离和运用有着广阔的应用前景，对于推进生物质资源的高效利用和环境保护具有重要意义。

- 1 -。

(整理)产纤维素酶菌种的筛选与优化.

目录实验一产纤维素酶菌种的分离与初筛实验二产纤维素酶菌种的复筛与保藏实验三酶活测定与传代保藏实验四产纤维素酶菌种的紫外诱变育种实验五产纤维素酶菌种的产酶条件优化实验六产纤维素酶菌种的产酶条件优化的结果分析实验一产纤维素酶菌种的分离与初步鉴定一、实验目的1．了解产纤维素酶微生物分离的基本原理；2．掌握产纤维素酶微生物分离的操作方法。

二、实验原理自然界中存在大量的纤维素类物质，同时存在着很多能分解纤维素类物质的生物，小到细菌、放线菌、真菌，大到一些食草类昆虫与动物。

这些生物与绿色植物一起构成了这个世界的碳循环。

在发酵堆肥中，存在着大量的，耐高温的纤维素分解菌株，但多半都为混合分解，菌种需要：1.内切型葡萄糖苷酶（endo-1,4-β-D-glucanase,EC3.3.1.4,简称EBG），也称Cx酶、CMC酶、EG。

这类酶作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机识别并水解β-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量非还原性末端的小分子纤维素；2.外切型葡萄糖苷酶（exo-1,4-β-D-glucanase,EC3.2.1.91），也称C1酶、微晶纤维素酶、纤维二糖水解酶（Cellobiohydrolase,简称CBH）,这类酶从纤维素长链的非还原性末端水解β-1,4-糖苷键，每次切下纤维二糖分子；3.Β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，EC3.2.21，简称BG）又称纤维二糖酶，它能水解纤维二糖以及短链的纤维寡糖生产葡萄糖，对纤维二糖和纤维三糖的水解很快。

随着葡萄糖聚合酶的增加水解速度下降，这种酶的专一性比较差。

只有三种酶的协同作用，才能较好的分解纤维素。

就单菌落而言，霉菌如木霉、曲霉和青霉的总体酶活性较高，产量大，故在畜牧业和饲料工业中的应用的纤维素酶主要是真菌纤维素酶。

本实验以羟甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基作为筛选培养基，只有能够水解纤维素成单糖并加以利用的微生物才能在筛选培养基上生长，利用筛选培养基分离产纤维素酶的微生物。

纤维素酶产生菌的筛选-鉴定和产酶条件优化

纤维素酶产生菌的筛选\鉴定和产酶条件优化摘要:采用稀释平板法分离马铃薯瓢虫肠道菌,利用刚果红平板法对产纤维素酶菌株进行初筛,选取透明圈较大的菌株进行摇瓶发酵复筛,根据菌株形态､生理生化特征对菌株进行初步鉴定,通过正交法优化产酶条件｡结果表明,经初筛和复筛得到1株酶活相对较高的菌株B-12,经初步鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)｡1.25%麦芽浸粉为碳源､1.5%KNO3为氮源､0.2%的NaCl､0.1%的CMC-Na､接种量6%､培养时间44 h为B-12产酶的适宜条件｡优化后发酵液中的内切葡聚糖酶活(CMCA)为111.710 U/mL,较培养44 h后的酶活提高了8.78%;滤纸酶活(FPA)为35.017 U/mL,提高了387.23%;β-葡萄糖苷酶酶活(BGL)为116.799 U/mL,提高了700.38%｡关键词:马铃薯瓢虫;肠道菌;纤维素酶;优化Screening,Identification and Cultural Condition Optimization of Cellulase-producing Strains from the Intestine of Henosepilachna vigintioctomaculata Abstract: The bacteria from the intestine of Henosepilachna vigintioctomaculata were isolated through the pour plate method. They were preliminarily screened using Congo red medium plate method, and then screened according to their cellulase activities by flask shaking fermentation method. The strain was identified based on morphological and physiological characters. In addition, the culture substrates and fermentation conditions were optimized by orthogonal experiment method. A high cellulase-producing strain B-12 was screened from the intestine of H. vigintioctomaculata and it was identified as Bacillus sp.. The best culture conditions were as follows: substrate were 1.25% malt meal, 1.5% KNO3, 0.2% NaCl, and 0.1% CMC-Na, inoculation quantity was 6%, culture time was 44 h. In this condition, the enzyme activity of CMCase, filter paper enzyme (FPA), and β-glucosidase (BGL) were 111.710, 35.017, and 116.799 U/mL respectively, which were 8.78%, 387.23% and 700.38% higher than those of the initial strain respectively.Key words: Henosepilachna vigintioctomaculata; intestinal bacteria; cellulase; optimization地球上的生物资源主要来自光合生物,其中90%以上为木质纤维素类物质,它们代表了生态系统中营养金字塔最庞大的基层[1]｡天然的木质纤维素材料含有纤维素､半纤维素和木质素等｡其中纤维素是地球上最丰富的多糖物质,这类物质是植物细胞壁的主要成分,也是地球上最廉价的可再生资源｡另外,人类活动产生的废弃物中也含有大量的纤维素[2]｡目前,人们对纤维素的降解和利用主要通过纤维素酶的分解来实现｡纤维素酶在再生能源利用方面具有广阔的应用前景,可应用于农业､酿造工业､发酵工业､食品工业以及其他领域[3-9]｡因此研究纤维素酶有着十分重要的意义｡昆虫肠道菌是指能定植于昆虫肠道的微生物,包括土著的昆虫肠道菌和能定植于昆虫肠道环境的微生物[10]｡研究表明一些昆虫肠道菌能帮助昆虫消化食物[10]｡对喜食含纤维素食物的昆虫,我们推测其消化纤维素可能与其肠道菌分泌纤维素酶有关｡马铃薯瓢虫主要为害茄科植物,喜食茄科植物叶片,它消化叶片中的纤维素可能与其肠道菌有关｡本试验从马铃薯瓢虫肠道中分离筛选产纤维素酶菌株并对其产酶条件进行优化,旨在为发现新的纤维素酶高产菌株奠定基础｡1材料与方法1.1材料1.1.1菌株采自浙江省金华市婺城区高村附近马铃薯田地的马铃薯瓢虫肠道中的菌株｡1.1.2培养基①菌种保藏培养基:牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏0.30%,蛋白胨1.00%,NaCl 0.50%,琼脂 1.50%~2.00%,pH值7.4~7.6)｡②初筛培养基:米糠2.00%,NaCl 0.10%,K2HPO4 0.50%,MgSO4·7H2O 0.02%,(NH4)2SO4 0.06%,琼脂1.50%~2.00%,pH值7.0~7.2｡③刚果红纤维素鉴定培养基:羧甲基纤维素钠(CMC-Na)0.30%,NaCl 0.50%,牛肉浸膏0.15%,蛋白胨0.50%,琼脂1.50%~2.00%,pH值7.0~7.2｡④种子培养液:酵母膏 1.00%,蛋白胨 1.00%,NaCl0.50%,CMC-Na 0.50%,pH值7.0~7.2｡⑤液体产酶发酵培养液:配方同种子培养液｡⑥鉴定用培养基:糖发酵试验培养基､葡萄糖蛋白胨水培养基､蛋白胨水解培养基､Simons氏柠檬酸盐培养基､明胶水解试验培养基等｡1.1.3主要试剂葡萄糖､pH值4.6的醋酸缓冲液､DNS､2% CMC-Na底物溶液､0.05%水杨苷的醋酸缓冲液､蛋白胨､牛肉膏等｡1.1.4主要仪器立式电热压力蒸汽灭菌锅,上海中安医疗器械厂生产;LRH-250生化培养箱,上海一恒科技有限公司生产;D-78532台式冷冻离心机,德国Hettich 公司生产;UV-7504紫外可见分光光度计,上海欣茂仪器有限公司生产;SW-CJ-1B 型单人单面净化工作台,苏州净化设备有限公司生产;电子天平,赛多利斯科学仪器(北京)有限公司生产;HH-4数显恒温水浴锅,山东鄞城科源仪器设备厂生产;远红外快速恒温干燥箱,上海跃进医疗器械厂生产｡1.2方法1.2.1纤维素酶产生菌的分离､纯化和初筛马铃薯瓢虫饥饿24 h后,无菌条件下在75%酒精中表面消毒2 min,去离子水漂洗3次,采用稀释平板法分离肠道菌｡待菌长出后用无菌牙签挑选单菌落于刚果红纤维素鉴定培养基上影印2~3皿,37℃下培养2~3 d｡取其中1皿采用刚果红染色法鉴定其产酶能力[11]｡对产生透明圈的菌株进行测量并记录D/d值(D为透明圈直径,d为菌落直径,下同),挑选D/d值大于1的菌株作为初筛菌种,通过连续划线法,分离纯化｡得到的初筛菌株转接到保藏斜面,4℃条件下保藏备用｡1.2.2纤维素酶产生菌的复筛将初筛到的菌株活化后接种于30/250 mL(250 mL 三角瓶装30 mL培养液,下同)种子培养基中,37℃､180 r/min摇床培养过夜｡以2%接种量转接于30/250 mL产酶培养基中,37℃､180r/min培养2~3 d,10 000 r/min冷冻离心10 min,取上清液测定酶活,筛选产纤维素酶最高的菌株｡1.2.3酶活力测定测定方法参照文献[12-16]修正得到｡1)标准曲线绘制｡反应的总体系为3.5 mL,1 mg/mL葡萄糖溶液和去离子水共2 mL,DNS试剂1.5 mL｡取10支试管编号分别为1~10｡分别吸取0､0.2､0.4､0.6､0.8､1.0､1.2､1.4､1.6､1.8 mL葡萄糖溶液至1~10号试管中;然后分别吸取2.0､1.8､1.6､1.4､1.2､1.0､0.8､0.6､0.4､0.2 mL去离子水至相应的1~10号试管中｡向1~10号试管中分别加入1.5 mL DNS试剂｡将上述试管一同沸水浴5 min,冷却后稀释至10 mL,在540 nm下用分光光度计测吸光值,绘制葡萄糖标准曲线｡2)内切葡聚糖酶活力(CMCase activity,CMCA)测定｡取4支干净试管,编号(分别为1~4)后加入1.5 mL底物溶液,并向1号试管中加入1.5 mL DNS溶液以钝化其中的纤维素酶,作为空白对照,比色调零｡4支试管置于50℃水浴中预热5 min,再加入0.5 mL酶液(液体发酵液的离心上清液),50℃水浴30 min后立即向2､3､4号试管加入1.5 mL DNS溶液以终止酶反应｡充分摇匀后沸水浴5 min,取出冷却后,加入去离子水定容至10 mL,充分混匀｡以1号试管为空白对照,540 nm测吸光值,2､3､4号3支试管数值取平均值｡3)滤纸酶活力(FPA)测定｡方法同上,将底物溶液换成1 mL缓冲液和50 mg滤纸,加入的酶液量为1 mL,反应时间为1 h｡4)β-葡萄糖苷酶活力(BGL)的测定｡方法同上,将底物溶液换成1.5 mL含0.05%水杨苷的醋酸缓冲液,反应时间为1 h｡5)酶活定义｡在上述条件下,1 mL粗酶液所产生的1 μg葡萄糖定义为一个酶活力单位(U)｡以上的测定中均已扣除了粗酶液中所含有的还原糖量｡1.2.4产纤维素酶菌株的鉴定①菌株的形态特征:菌株平板培养2~3 d,观察菌落形态特征,菌体形态经染色(革兰氏染色､鞭毛染色､芽孢染色等)后,于显微镜的100倍油镜下观察并照像｡②菌株的生理生化特性:生理生化试验包括糖发酵试验､V. P试验､甲基红试验､吲哚试验､柠檬酸盐利用试验､淀粉水解试验､明胶水解试验等｡1.2.5产酶条件的优化对复筛得到的菌株进行产酶条件的优化试验｡1)摇瓶生长曲线的测定｡在基础培养基的基础上,对复筛得到的菌株测定其在摇瓶培养中的生长曲线和产酶曲线,考察菌体生长状况与菌株产酶能力在时间上的相关性｡2)接种量的确定｡将培养12 h的种子液分别以1%､2%､3%､4%､5%､6%､7%､8%､9%､10%､11%､12%､13%､14%､15%､16%的接种量转接入30/250 mL产酶培养基中,置于37℃,180 r/min摇床培养,测定酶活,考察不同接种量对菌株产酶的影响｡3)培养基成分的优化｡①碳源种类对菌株产酶的影响:分别以1%的CMC-Na､葡萄糖､蔗糖､乳糖､酵母膏､牛肉膏､酵母粉､麦芽浸粉､秸秆汁､米糠作为碳源,摇瓶培养后测定酶活,考察碳源种类对菌株产酶的影响｡②氮源种类对菌株产酶的影响:分别以1%的(NH4)2SO4､NH4NO3､KNO3､蛋白胨､尿素､酵母膏､酪蛋白胨作为氮源,以1%葡萄糖作为碳源,摇瓶培养后测定酶活,考察氮源种类对菌株产酶的影响｡③NaCl浓度水平对菌株产酶的影响:在原始液体产酶培养基的基础上分别加入0.1%､0.2%､0.3%､0.4%､0.5%､0.6%､0.7%､0.8%､0.9%､1.0%的NaCl,摇瓶培养后测定酶活,考察NaCl浓度水平对菌株产酶的影响｡④底物(CMC-Na)浓度水平对菌株产酶的影响:在原始液体产酶培养基的基础上分别加入0.1%､0.2%､0.3%､0.4%､0.5%､0.6%､0.7%､0.8%､0.9%､1.0%的CMC-Na,摇瓶培养后测定酶活,考察底物浓度水平对菌株产酶的影响｡⑤根据上述试验得到的最适培养基组成,选取L9(34)型正交表设计正交试验,试验因素和水平见表1,以上清液酶活大小为指标,选择最优培养基组成｡2结果与分析2.1纤维素酶产生菌的初筛采用刚果红染色法从瓢虫肠道中分离纯化得到16株透明圈较大的细菌,细菌编号及其D/d值分别为:B-1,6.167;B-35,5.667;B-11,5.000;B-19,4.750;B-9,4.000;B-26,3.750;B-37,3.000;B -27,1.833;B-53,3.000;B-47,2.714;B-36,2.667;B-42,2.571;B-32,2.500;B-46,2.429;B-1 2,2.083;B-10,1.420｡2.2纤维素酶产生菌的复筛对初筛得到的16株菌株进行摇瓶复筛,以CMCA为指标,筛选出B-12､B-10､B-53､B-11等4株产纤维素酶活力较高的菌株,CMCA(3次测定的平均值)分别为76.85､68.85､53.94､71.27 U/mL｡菌株B-12的CMCA最高,该菌株用以后续的试验｡2.3DNS法葡萄糖标准曲线葡萄糖标准曲线如图1所示,得到方程y=0.916 9x-0.110 4,r2=0.991 4｡2.4菌株B-12的初步鉴定2.4.1形态特征菌株B-12在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上菌落较大､圆形､边缘整齐､不透明､乳白色､微隆起､湿润､生长较快｡显微镜观察细胞呈杆状,两头稍平;周生鞭毛,革兰氏染色呈阳性;芽孢椭圆形或柱状,中生或偏端生,芽孢囊不膨大｡2.4.2生理生化特征V.P反应为阴性,吲哚反应､甲基红反应为阳性｡该菌株可利用葡萄糖产酸,能水解淀粉,分解明胶,不能利用柠檬酸盐｡结合形态特征和生理生化特征,参考《伯杰细菌鉴定手册》第八版,将菌株B-12鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)｡2.5产酶条件的优化2.5.1摇瓶生长曲线的确定在原始培养基基础上从发酵开始至72 h,连续取样,在600 nm下测定生物量,离心后取上清液测定酶活,得到与时间相关的该菌株的生长曲线以及产酶曲线(图2､图3)｡由图2､图3可知,在3 h左右菌株进入对数生长期,16 h左右菌株生长开始进入稳定期,44 h以后开始进入衰亡期｡CMCA､FPA､BGL开始时增长较为缓慢,CMCA､BGL在44 h时达到最大值,FPA在47 h时达到最大,综合考虑将最佳培养时间定为44 h｡总体趋势表明菌株B-12的产酶能力与菌体生长状况有耦连相关性｡在44 h时CMCA为102.694 U/mL,FPA为7.187 U/mL,BGL为14.593 U/mL｡2.5.2不同接种量对菌株酶活力的影响不同接种量对菌株酶活力的影响结果见图4｡综合考虑,在接种量为6%时3个酶活指标均较高,CMCA为73.901 U/mL,FPA 为8.232 U/mL,BGL为7.140 U/mL｡因此最佳接种量选择6%｡2.5.3不同碳源对菌株B-12酶活力的影响碳源对微生物生长代谢的作用主要是提供细胞碳架､细胞生命活动所需的能量以及合成产物的碳架｡根据微生物所能产生的酶系不同,不同的微生物可利用的碳源不同｡在产酶培养基的基础上改变不同的碳源检测菌株B-12的产酶情况｡由图5可知,不同种类的碳源对菌株产纤维素酶影响不同,其中麦芽浸粉作为碳源时3个酶活指标均较高,CMCA为74.592 U/mL,FPA为6.778 U/mL,BGL为7.667 U/mL｡因此确定麦芽浸粉作为菌株B-12的产酶培养基的适宜碳源｡2.5.4不同氮源对菌株酶活力的影响氮源是合成菌体蛋白质､核酸及其他含氮化合物的重要组成成分｡不同种类的氮源对菌株的产酶影响结果见图6｡当KNO3作为氮源时,3个酶活指标均较高,CMCA为230.080 U/mL,FPA为101.636 U/mL,BGL 为93.009 U/mL｡因此确定该菌株的产酶培养基的适宜氮源为KNO3(图6)｡2.5.5NaCl浓度对菌株酶活力的影响试验设置了0.1%､0.2%､0.3%､0.4%､0.5%､0.6%､0.7%､0.8%､0.9%､1.0%等10个NaCl浓度梯度,在不同NaCl浓度下测定纤维素酶的3个酶活指标｡由图7可知,当NaCl浓度为0.2%时,CMCA活性最高,为75.137 U/mL,FPA和BGL活性相对较高,分别为5.533 U/mL和7.485 U/mL｡因此,NaCl浓度为0.2%时菌株B-12的酶活较大｡2.5.6底物(CMC-Na)含量对菌株酶活力的影响试验测定CMC-Na不同添加量(0.1%､0.2%､0.3%､0.4%､0.5%､0.6%､0.7%､0.8%､0.9%､1.0%)时菌株B-12的产酶水平｡由图8可知,当CMC-Na浓度达到0.2%时,CMCA活性最高,为90.043 U/mL,FPA和BGL活性相对较高,分别为7.287 U/mL和7.213 U/mL;表明菌株B-12适宜底物(CMC-Na)浓度为0.2%｡2.5.7最适培养基组成确定选取L9(34)型正交表设计正交试验,以上清液酶活大小为指标,选择最优培养基组成｡对正交试验结果进行极差分析(表2)可以发现对于CMCA酶活而言,主要因素的影响顺序为:麦芽浸粉>NaCl>KNO3>CMC-Na,最佳组合为:1.25%麦芽浸粉､1.0% KNO3､0.1% NaCl､0.2% CMC-Na｡对于FPA酶活,主要因素的影响顺序为:CMC-Na>NaCl>KNO3>麦芽浸粉,最佳组合为:1.25%麦芽浸粉､1.5% KNO3､0.2% NaCl､0.1% CMC-Na｡对于BGL酶活,主要因素的影响顺序为:KNO3>CMC-Na>麦芽浸粉>NaCl,最佳组合为:1.25%麦芽浸粉､1.5% KNO3､0.2% NaCl､0.1% CMC-Na｡综合考虑,最终确定最佳培养基配方为:1.25%麦芽浸粉,1.5%KNO3,0.2%NaCl,0.1% CMC-Na｡此时,CMCA､FPA和BGL分别为111.710 U/mL､35.017 U/mL和116.799 U/mL,较菌株培养44 h时的酶活分别提高了8.78%､387.23%和700.38%｡3讨论利用刚果红平板法初筛得到的透明圈比值大的菌株,其酶活并不一定高｡试验中我们发现菌株B-1的透明圈比值高达 6.167,而菌株B-12的透明圈比值仅为2.083,但从摇瓶发酵复筛结果看,菌株B-12的酶活要高于B-1的｡因此,在筛选纤维素酶高产菌株时,摇瓶发酵复筛是必要的｡我们首次从马铃薯瓢虫肠道中分离得到多株产纤维素酶肠道菌并筛选到1株酶活性较高的菌株B-12,产酶条件经优化后,其CMCA为111.710 U/mL,FPA为35.017 U/mL,BGL为116.799 U/mL｡而采用同样的酶活测试方法,林祥木等[17]从土壤中分离得到的最好的菌株其CMCA为36 U/mL,FPA为31 U/mL,BGL不足41 U/mL｡昆虫是地球生物圈中已知种类最多的一群生物[18,19],昆虫种类､数量及分布范围的多样性意味着昆虫肠道菌的多样性[20]｡研究表明昆虫肠道菌是微生物新种的潜在资源[21,22]｡因此,昆虫肠道菌可能是新高产纤维素酶的广泛来源,而从昆虫肠道菌分离产纤维素酶菌还鲜有报道,亟待研究开发｡参考文献:[1] TOMME P, WARREN R A J, GILKES N R. 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产纤维素酶菌株Pantoea ananatis P5的筛选鉴定和活性研究

１）筛选到的一株纤维素酶产生菌，在中国普通微生物保藏管理中心进行了专利菌种保藏，其保藏号为：
ＣＧＭＣＣＮＯ．５３５６．
２）所述纤维素酶产生菌Ｐ５的制备方法，其特征在于：
从腐烂植物枝叶表面及附近的土壤中分离样品，样品加入５ｏｍＬＬＢ培养基中，在２５０ｍＬ锥形瓶中，以１６０ｒ／ｍｉｎ转速于３７℃培养２４ｈ涂布于ＬＢ固体平板上，获得菌株；所述ＬＢ液体培养基组分为：每升蒸馏
第２８卷第４期
Ｖｏ１．２８Ｎｏ．４
徐州工程学院学报（自然科学版）
ＪｏｕｒｎａｌｏｆＸｕｚｈｏｕＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓＥｄｉｔｉｏｎ）
２０１３年１２月
Ｄｅｃ．２Ｏ１３
产纤维素酶菌株ＰａｎｔｏｅａａｎａｎａｔｉｓＰ５的筛选鉴定和活性研究
侯进慧，刘彤，李同祥
（徐州工程学院，江苏｛余州２２１１ｌ１）
发展，国内外均尝试应用基因工程技术来筛选、改造和构建高效纤维素降解菌株、开发新型高效的纤维素酶．
因此，需要通过生物技术方法加大对细菌纤维素酶的研究，以开发出型的纤维素酶］．本文采用产纤维素酶菌株筛选培养基，获得一株纤维素酶产生菌Ｐ５，对菌株进行了鉴定，并对该菌株纤维素酶特性进行了

产纤维素酶细菌的筛选及培养

产纤维素酶细菌的筛选及培养一、筛选步骤1、菌种的采集采集山上距湿润的表层10cm处的土壤样本40g左右，用研钵研成粉末称取1g样本加入灭菌的250mL锥形瓶中，加入99mL无菌水摇匀静置。

2、菌种初筛（1）按照配方配制200mL CMC培养基，取1 X 250mL空锥形瓶和6 X 15mL试管，塞上棉塞并用报纸、棉线包扎，用报纸、棉线将试管包扎成一捆；取12套培养皿码齐包扎。

将上述器材与培养基、无菌水121℃高压蒸汽灭菌20min。

（2）于无菌台上倒9个CMC培养基备用。

（3）另取6支15mL经灭菌的试管，用移液枪吸取土壤溶液（上清液）1.000mL加入1号试管，加无菌水9.000mL。

混匀后吸取1.000mL 加入2号试管，重复上述操作，进行6次梯度稀释。

（4）待CMC培养基冷却后，在超净工作台分别吸取104、105、106倍稀释液0.100mL于CMC培养基上稀释涂布，每种稀释液涂布三份。

（5）将上述培养基置于37℃培养箱中培养24小时，标记菌落并记录各菌落形态（菌落高度、质地、颜色、气味、着生状态、边缘及表面纹理等）。

（6）配制200mL刚果红家别培养基，与三套培养皿一起121℃灭菌20min。

（7）在无菌操作台上倒3个鉴别培养基备用。

（8）将各菌落用牙签接种到冷却了的刚果红鉴别培养基上，37℃培养24h，挑选5株透明圈直径与菌落直径比最大的菌株进行摇瓶复筛。

3、菌种复筛（1）配制500mL基础发酵培养基，分装到5只250mL的锥形瓶中，121℃高压蒸汽灭菌20min。

（2）将初筛得到的菌株用接种环接种于液体培养基上（2环），37℃、150r/min下培养2—3天，转入4℃冰箱保藏。

二、培养方法1清洗实验器具2灭菌3配培养基（纤维素作唯一能量源的培养基）4倒平板 +选择培养原菌（可能会用摇床）5稀释菌样6涂布平板或平板划线7放入恒温箱（调制均适宜的温度）12-24h ，之后就可以收获细菌了8观察记录（数量、分布等）三、培养基种类及其组成1、初筛CMC培养基：CMC 5g、蛋白胨1 g、FeSO4·7H2O 0.005 g、NaCl 0.25g、琼脂粉10g 于1000mL锥形瓶中加蒸馏水至500mL、调节pH 7．2～7．6，加棉塞121℃灭菌20min。

产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定

本科开放项目题目：产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定学生姓名：指导教师：学院：专业班级：2016年3月产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定摘要纤维素作为植物光合作用的主要多糖类产物，是高等植物细胞壁的主要成分，是公认的自然界数量最丰富、最廉价的可再生有机物质资源。

据估计，纤维素生成量每年高达1000亿吨。

我国每年农作物秸秆总产量为7亿吨左右，仅农业生产中形成的农作物残渣（如稻草、玉米秸、麦秸等），每年就有5亿吨之多。

纤维素的降解是自然界碳素循环的中心环节。

但由于纤维素的结构特点，对纤维素的利用仍然非常有限。

目前仅有20%的纤维素物质被开发利用，大量的纤维素物质因无法分解利用而废弃，不仅造成资源浪费，而且污染环境。

随着人口数量的不断增长和人民生活水平的不断提高，能源危机、食物短缺、环境污染等问题日益严重，寻找利用可再生资源、节省粮食、减少环境污染的有效途径显得日趋重要。

采用微生物技术处理秸秆是当前研究最多的一种秸秆处理方法,纤维素酶能将天然纤维素降解,生成纤维素分子链、纤维二糖和葡萄糖,然而目前制约纤维素材料转化为乙醇并实现产业化的关键因素之一是纤维素酶效率低下,从而造成生产成本过高。

因此,筛选具有高活性纤维素酶的秸秆降解微生物菌株以及相关研究是当前研究的热点和难点。

关键词：纤维素降解高活性纤维素酶微生物菌株目录第1章绪论 (1)1.1 实验原理 (1)1.2 实验仪器及试剂 (2)1.2.1 实验材料 (2)1.2.2 实验仪器 (2)1.2.3 培养基 (2)第2章实验步骤 (3)2.1 采样培养 (3)2.2 初筛 (4)2.3 复筛 (4)2.4 酶活的测定 (4)2.4.1原理 (4)2.4.2溶液配制 (4)2.4.3实验步骤 (5)第3章实验结果 (7)3.1 标准曲线的绘制 (7)3.2 菌株复筛结果 (8)3.3 测定纤维素酶活力结果 (9)结束语 (10)参考文献 (11)第1章绪论1.1 实验原理自然界中存在大量的纤维素类物质，同时存在着很多能分解纤维素类物质的生物，小到细菌、放线菌、真菌，大到一些食草类昆虫与动物。

一株土壤源高产纤维素酶芽孢杆菌的分离与鉴定

一株土壤源高产纤维素酶芽孢杆菌的分离与鉴定2董鹤娟1’2，丁轲蚍～，恒子钤2，彭春平2，罗伟光hf1．河南省动物疫病与公共安全院士工作站，河南，洛阳471003；2．河南科技大学宏翔发酵饲料实验室，河南，洛阳471003)摘要：为了获得产纤维素酶的芽孢杆菌，从河南省不同地方采集玉米地、秸杆垛的土壤样品58份，利用刚果红平板法分离产纤维素酶的芽孢杆菌，采用3，5．二硝基水杨酸法测定纤维素酶活，结合菌落特征、显微形态、生理生化试验和16S rDNA序列进行鉴定。

结果表明：从分离出的42株产纤维素酶菌株中筛选出一株产纤维素酶较高的菌株B．LY02，纤维素酶活力可达0．5351 U／mL。

该菌株呈短杆状，革兰氏染色阳性，能形成芽孢。

基于16S rDNA序列同源性比较分析表明该菌株与Bacillus lic henifo rmis s tr ain CICCl0095的亲缘关系最近，基因序列的同源性为96．5％，因此鉴定该菌株为地衣芽孢杆菌。

关键词：纤维素酶；芽孢杆菌；分离；鉴定我国是粮食大国，纤维素资源极为丰富，每年仅农作物秸秆产量就高达7．0亿吨，约占世界的20 ％[1—2】。

但是秸杆的成分主要是较难降解的纤维素，所以目前秸杆仅有极少部分用于反刍动物饲料，绝大多数都被燃烧，不仅造成了资源的浪费，而且还会带来环境污染[3—4】。

另一方面，由于我国大规模发展畜牧业，人畜争粮的现象已很严重。

所以研究将秸杆中的纤维素降解成畜禽可利用的多糖、蛋白质或其他营养成分已成为当务之急。

目前最可能利用的手段就是筛选高效纤维素酶分解菌，我们认为秸杆纤维素的降解不是单一菌种能够解决的，因为秸杆的降解需要p．葡聚糖酶、内切p一葡聚糖酶和 p一葡萄糖苷酶等多种纤维素酶共同参与才能完成【4]。

已有的研究主要集中在真菌方面，如里氏木霉、绿色木霉、白腐菌、米曲霉等is一71，对细菌方面研究的较少。

而且真菌存在活性不稳定和生物安全隐患等问题，但是芽孢杆菌具有产酶能力强，耐高温、强酸，环境适应能力强等特点，所以很适宜作为秸杆发酵用菌种。

纤维素酶产生菌的鉴定与筛选

纤维素是高等植物细胞壁的主要成分, 也是地球上最丰富的资源。纤维素酶是一组分解植物纤维素的酶 , 主要有 1, 4 葡聚糖水解酶( Cx ) 酶和 1, 4 葡聚糖纤维二糖水解酶 ( C 1) 酶。它们能将植物纤维分解为葡萄糖, 能破坏植物细胞壁, 使其释放蛋白体、淀粉等营养成分, 能消除饲料中非淀粉多糖的抗营养作用, 提高饲料利用率和畜禽生产性能。饲用纤维素酶主要由霉菌产生, 因此, 筛选出高活性纤维素酶的菌株是开发利用纤维素资源和提高饲料营养价值的前提和关键。故进行了本试验, 以期为生产高活性饲用纤维素酶奠定基础 , 现报告如下。 1 材料与方法 1 1 待检样品的采集和处理从自然界中采集朽木、土壤、粪堆土、草底土、发霉秸秆和霉变玉米等样品, 分别放入三角瓶中, 加入适量的生理盐水 , 室温浸泡 6h( 每 2h 振荡一次 ) , 作为待检样品。 1 2 1 3 培养基 PDA 和 CCM , 按常规方法配制。霉菌的分离培养与鉴定用接种环将待检样品分别划线接种于 PDA 和 CCM 平坂上, 另外将数个 PDA 和 CCM 平板敞口于试验室内 2h, 进行空气接种 ; 将接种的平板置 28 恒温箱中培养 3~ 7 天。然后 , 采用挑取典型单个菌落法或稀释后涂抹平板法进行纯培养。分纯后的菌株接种于试管斜面保存菌种, 接种于平板观察培养性状及孢子和菌丝形态特征。 1 4 纤维素粗酶液的制备称取稻草粉 3g, 麦麸 2g , 于 250m L 三角瓶中, 加入 1% 硫酸铵溶液 ( 以自来水为溶剂配制) 10mL , 混匀后 121 3 灭菌 30min, 接种斜面霉菌孢子一环 , 充分摇匀后于 28 培养 72h 成曲 ( 脂 ( P DA) 板和察氏培养基 ( CCM ) , 从自然界和饲料中分离出 6 种 8 株霉菌 , 分别是产黄青霉 1 株 ( 9908) , 米根霉 1 株 ( 9917) , 米曲霉 1 株 ( 9935) , 高大毛霉 1 株 ( 9939) , 黑曲霉 2 株 ( 9930、 9934) , 绿色木霉 2 株( 9916、 9942) 。经滤纸崩溃法、 CMC 糖化力、棉花糖化力测定, 证明 8 株菌能产生纤维素酶。其中产 Cx 酶高的菌株是 9930、 9934, 产 C1 高的菌株是 9930、 9934、 9942。关键词霉菌 ; 纤维素酶 ; 鉴定; 筛选一次 ) , 加蒸馏水 100m L , 40 恒温水浴培养 1h( 每 15m in 摇动一次 ) , 用脱脂棉过滤, 滤液为粗酶液, 另设一瓶不接种的培养基滤液, 为对照溶液。 1 5 纤维素酶活力的测定 1 5 1 滤纸崩溃法( C 1 酶 ) 在 200mL 三角瓶中加 8m L 粗酶液, 2mL 0 2m ol/ L 、pH 4 6 醋酸缓冲液, 2 张 1 1cm 大小的新化滤纸 , 45 保温 , 反复振荡 ( 100 次 / 分) , 观察滤纸刘崩溃程度 , 记录滤纸完全消失所需要的时间。用对照溶液代替粗酶液作为对照颖组, 其余同试验。 1 5 2 羧甲基纤维素钠盐 ( CM C) 糖化力 ( Cx 酶) 取 0 5mL 适当稀释的粗酶液 , 加入 2mL 1% CM C 溶液 , 50 水浴中反邵红

高产纤维素酶菌株的筛选及产酶条件研究

高产纤维素酶菌株的筛选及产酶条件研究研究目标本研究旨在筛选高产纤维素酶的菌株，并优化其产酶条件，以提高纤维素降解效率和产酶量。

方法1. 菌种收集与筛选1.收集土壤、水源等环境样品，分离出潜在的纤维素酶产生菌株。

2.通过平板培养和传代培养，筛选出具有纤维素酶活性的菌株。

2. 纤维素酶活性测定1.利用Congo Red染色法测定菌株的纤维素酶活性。

2.选择具有较高纤维素酶活性的菌株作为后续研究对象。

3. 优化产酶条件1.确定最适pH：在不同初始pH值下培养菌株，测定产酶量和纤维素酶活性。

2.确定最适温度：在不同培养温度下培养菌株，测定产酶量和纤维素酶活性。

3.确定最适碳源：使用不同碳源（如纤维素、木质素等）培养菌株，测定产酶量和纤维素酶活性。

4.确定最适氮源：使用不同氮源（如蛋白质、尿素等）培养菌株，测定产酶量和纤维素酶活性。

4. 鉴定菌株1.利用生化和分子生物学方法对优选出的菌株进行鉴定，确定其属于哪个科、属、种。

2.利用16S rRNA基因序列分析确定菌株的系统发育关系。

5. 产酶机制研究1.利用电镜观察菌株在不同培养条件下的形态结构变化。

2.利用基因组学方法分析纤维素酶基因在不同条件下的表达情况。

发现1.从环境样品中筛选出了多个具有纤维素酶活性的菌株，其中某一菌株表现出较高的纤维素酶活性。

2.最适pH为7.0，最适温度为50℃，最适碳源为纤维素，最适氮源为蛋白质。

3.经鉴定，该菌株属于纤维素酶产生菌属，并命名为XX菌株。

4.电镜观察发现，在最适产酶条件下，XX菌株的纤维素酶形态结构清晰可见。

5.通过基因组学方法分析，发现XX菌株在最适产酶条件下纤维素酶基因的表达水平较高。

结论1.通过本研究筛选出了一株高产纤维素酶的菌株XX。

2.最适产酶条件为pH 7.0、温度50℃、碳源为纤维素、氮源为蛋白质。

3.该菌株具有潜力应用于纤维素降解和生物质转化领域。

4.通过深入研究其产酶机制，可以进一步优化该菌株的产酶性能和应用前景。

张弓老酒大曲中高产纤维素酶菌株的分离鉴定

研究报告Research Report张弓老酒大曲中高产纤维素酶菌株的分离鉴定刘延波1,2刘莹莹1,2赵志军1,2刘润雨1,2潘春梅1,2孙西玉1,2,3*1河南牧业经济学院食品与生物工程学院(酒业学院),郑州,450046;2河南牧业经济学院,河南省白酒风格工程技术研究中心,郑州,450046;3张弓老酒酒业有限公司,宁陵,476733*通信作者,******************摘要本研究以羧甲基纤维素钠为唯一碳源作初筛培养基，利用刚果红变色圈法从张弓老酒酒业有限公司大曲中分离得到一株高产的纤维素酶细菌D39。

经细菌形态学观察，生理生化实验，并结合16S rDNA 序列分析，初步鉴定其为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis )。

并通过单因素试验和响应面试验优化确定最佳产酶条件为：接种量4%，培养时间3d ，pH 值4。

优化后其酶活为1014U/mL ，与优化前相比产酶能力提高1.3倍。

本研究结果可为后续提高酿酒原料利用率，缩短发酵时间，以及控制大曲发酵培养工艺提供参考依据。

关键词大曲,纤维素酶,芽孢杆菌,分离鉴定,响应面优化Isolation and Identification of High-yield Cellulase Strains from ZhangGong-LaoJiu DaquLiu Yanbo 1,2Liu Yingying 1,2Zhao Zhijun 1,2Liu Runyu 1,2Pan Chunmei 1,2Sun Xiyu 1,2,3*1College of Food and Bioengineering (Liquor College),Henan University of Animal Husbandry and Economy,Zhengzhou,450046;2Henan Liquor Style Engineering Technology Research Center,Henan University of Animal Husbandry and Economy,Zhengzhou,450046;3ZhangGongLaoJiu Wine Co .Ltd.,Ningling,476733*Corresponding author,******************DOI:10.13417/j.gab.039.004031Abstract In this experiment,sodium carboxymethyl cellulose was used as the sole carbon source as the primary screening medium.A high-yield cellulase bacterium D39was isolated from the ZhangGongLaoJiu Daqu by Congo red color circle method.Through bacterial morphology,physiological and biochemical experiments,combined with 16S rDNA sequence analysis,D39was initially identified as Bacillus subtilis .The optimal fermentation conditions were determined by single factor and response surface test optimization:inoculation amount 4%,culture time 3d,pH =4.After optimization,the enzyme activity was 1014U/mL,which was 1.3times higher than that before optimization.The results of this study could provide references for further improving the utiliza-tion rate of brewing materials,shortening the fermentation time,and controlling the fermentation culture technol-ogy of Daqu.Keywords Daqu,Cellulase,Bacillus,Isolation and identification,Response surface optimization 基金项目：本研究由河南省重大科技专项(181100211400)、河南牧业经济学院博士科研启动资金项目、河南牧业经济学院青年科研创新基金项目(XKYCXJJ2017015)、河南省高等学校重点科研项目(17A180005)和河南牧业经济学院重点学科项目共同资助引用格式：Liu Y.B.,Liu Y.Y.,Zhao Z.J.,Liu R.Y.,Pan C.M.,and Sun X.Y.,2020,Isolation and identification of high-yield cellulase strains from ZhangGongLaoJiu Daqu,Jiyinzuxue Yu Yingyong Shengwuxue (Genomics and Applied Biology),39(9):4031-4040(刘延波,刘莹莹,赵志军,刘润雨,潘春梅,孙西玉,2020,张弓老酒大曲中高产纤维素酶菌株的分离鉴定,基因组学与应用生物学,39(9):4031-4040)中国白酒在世界上独树一帜，其中浓香型白酒占有举足轻重的地位(王明跃和张文学,2014;于学建等,2019)。

实验一产纤维素酶菌种的分离与初步鉴定

实验一产纤维素酶菌种的分离与初步鉴定一、实验目的1．了解产纤维素酶微生物分离的基本原理；2．掌握产纤维素酶微生物分离的操作方法。