PCR及RT-PCR之基础问题解答
PCR技术之——常见问题解析及处理方法
PCR技术之——常见问题解析及处理方法我们进行核酸扩增时，往往会不定的出现一些异常问题，本期我给大家搜集了一些平时经常性遇到的一些问题，希望对大家有所帮助。
（一）相对特异性 PCR产物的特异性主要取决于引物链的特异性。
由于存在同源序列，随意设计的引物链，其PCR产物在电泳分析时可能出现多条链，因此在设计引物链时应考虑其绝对特异性和相对特异性。
前者指两条引物链的核苷酸序列只与靶DNA片段互补，后者是指两条引物链的核苷酸序列及两者之间的DNA长度对靶DNA片段是特异的，但亦可与其他区域的DNA片段互补，而其PCR产物的长度与靶DNA片段的扩增产物的长度明显不同，应根据两引物问的DNA片段长度，预计PCR产物的大小，并与电泳分析的DNA片段大小比较．或用寡聚核苷酸限制性内切酶片段分析，或用分子杂交、核苷酸序列分析来测定。
（二）标本中存在的有形成分对反应的抑制这一点主要是针对来自临床标本中的杂质加细菌蛋白质和Taq DNA聚合酶抑制因子，须注意避免污染和去除标本中的杂质；将标本加热煮沸使抑制因子与DNA分离。
对于来自标本中的细胞和细胞器的崩解、核酸酶的激活均可使待检的DNA降解，降解的DNA是Taq DNA聚合酶作用良好底物，能与靶DNA竞争，从而扩增大量的非特异性DNA，这种非特异性DNA会使背景干扰超过了前景信号影响PCR循环扩增效率，减少特异性DNA扩增产量。
（三）Taq DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶扩增的特异性受PCR循环次数及延伸时间与温度的影响循环次数太多使延伸时间延长和Taq DNA聚合酶单位用量增长可能导致非特异性扩增；循环次数太少，则不能得到充足的扩增产物，温度不适宜会影响扩增产物数量，延伸温度一般高于复性温度。
（四）复性温度与时间引物与变性DNA的复性温度对PCR 的特异性有影响，复性温度由引物的碱基成分决定。
在低温度（37℃）下复性可出现比扩增DNA长的非特异性扩增带；而在55～60℃复性的扩增带一般是特异的，复性时间过长或过短都会增加非特异性扩增。
RT-PCR反应过程问题处理
RT—PCR反应过程问题处置逆转录（reversetranscription）是以RNA为模板合成DNA的过程，即RNA引导下的DNA合成。
1.如何提高RT—PCR反应的灵敏度与特异性？①确定模板RNA完整性好，无DNA污染。
②RNA模板中不应含有扩增反应抑制剂。
③使用适量的模板RNA，模板量太多会降低特异性，太少会导致扩增不出条带或条带太弱。
④若模板中有二级结构，可通过提高逆转录反应温度来提高扩增效果。
2.RNA中含有逆转录抑制剂时，怎么处置？逆转录抑制剂包含：SDS、EDTA、甘油、焦磷酸钠、亚精胺和胍盐等等。
可将已确定的高质量RNA模板同样品混合，同高质量RNA 模板比较产量以检测RNA抑制剂；若高质量模板RNA与样品混合后产量降低，则说明样品中存在逆转录抑制剂，可用70%（v/v）乙醇对RNA沉淀进行清洗，以除去抑制剂。
3.逆转录后的qPCR试验Ct值偏大或者一般PCR产量低。
①RNA模板质量差，需要重新制备RNA模板，可通过琼脂糖凝胶电泳检测质量。
②逆转录后的cDNA中含有高浓度的模板RNA和逆转录试剂成分，可能会对后续的PCR产生抑制作用，所以可以适当梯度提高cDNA稀释比例（通常来说可将cDNA原液稀释5—10倍，其最佳模板加入量以扩增得到的Ct值在20—30个循环为好）。
③起始的RNA模板量低，需要削减稀释倍数或加添RNA模板量。
④基因自身原因（多而杂和长度），可以重新设计多而杂基因的引物，躲避多而杂结构。
或者用三步法程序或延长两步法程序的延长时间。
⑤逆转录或者定量产品性能差，可以通过做平行不用品牌产品对比试验，对比逆转录产品性能。
4.逆转录酶扩增效率评估，应当关注哪些指标？建议：qPCR—ct值，或者PCR产量假如想比较逆转录性能，最为直接的还是后续做qPCR或者PCR平行对比试验，这种方法相对较为精准。
不建议：cDNA中心产物浓度测定or其他方法。
逆转录完成后是不建议测定产物浓度的，由于逆转录后产生RNA—cDNA杂交链，溶液中的RNA和部分DNA会对吸光值产生影响，所以测定出来的产物浓度并不精准，即使利用同一批次RNA和不同品牌的试剂盒进行对比试验，由于不同品牌之间的逆转录体系具有或多或少的差异，其体系中的各种离子等都能对吸光度产生影响，所以测定的结果也没有可比性。
PCR常见问题解答
常见问题解答
1. 使用Pfu可以扩增多长的片段？
对于简单的模板，Pfu应该可以很好的扩增3kb以下的片段。
扩增更长片段时，能否成功扩增主要与模板和引物的设计有关。
2. 使用Pfu进行PCR扩增后的PCR产物能否进行TA克隆？
不能直接进行TA克隆。
首先要将PCR产物进行纯化，然后在dATP存在条件下用Taq酶72℃处理15分钟进行3'末端加A处理，再与TA载体连接。
3. 用同单位的Pfu和Taq扩增，为什么Pfu扩增效率比Taq酶低？
因为高保真性能的Pfu聚合酶具有3'到5'核酸外切酶的活性，扩增过程中如果产生了错配的碱基，它可以将其切掉，从而保证了扩增的准确性。
正是由于此酶具有核酸外切酶的功能，往往扩增效率比Taq要低，而且还容易降解引物，因而在设置PCR反应时，应最后加入Pfu酶为好。
RTPCR常见问题分析
严格控制实验操作过程
总结词
实验操作过程的准确性和规范性对RTPCR实验结果具有重要影响，严格控制实验操作 过程可以有效提高实验的准确性和可靠性。
详细描述
遵循标准的RTPCR实验操作流程，确保每一步操作的准确性和规范性。在实验过程中， 注意避免交叉污染和误差传递，使用一次性吸头和离心管，避免使用污染的工具和容器。
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RTPCR常见问题分析
目录
• RTPCR技术概述 • RTPCR实验过程常见问题 • RTPCR结果解读常见问题 • RTPCR技术改进和优化建议
01
RTPCR技术概述
RTPCR技术简介
实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative PCR），简称RTPCR， 是一种在PCR反应过程中实时监测荧 光信号的分子生物学技术。
同时，对实验操作人员进行培训和考核，确保其具备足够的技能和经验。
完善扩增产物检测方法
总结词
扩增产物检测是RTPCR实验的关键环节，完善扩增产物 检测方法可以有效提高实验的准确性和可靠性。
详细描述
选择灵敏度高、特异性好的检测方法，如荧光定量PCR 、熔解曲线分析等。同时，采用内参基因对实验结果进 行校正和标准化处理，以排除实验过程中可能存在的误 差和干扰因素。此外，应定期对检测方法进行验证和优 化，以确保其性能的可靠性和稳定性。
04
RTPCR技术改进和优化 建议
优化样本采集和保存方法
总结词
详细描述
样本质量是影响RTPCR实验结果的重要因素， 优化样本采集和保存方法可以有效提高实验 的准确性和可靠性。
在采集样本时，应选择适当的采集时间、部 位和数量，避免样本受到污染或降解。采集 后应尽快将样本保存于适当的介质中，并保 持低温，以维持样本的稳定性和活性。
PCR技术常见疑难问题3则
在细胞中只有RNA聚合酶可以从头合成RNA，合 成 的 RNA 与 模 板 链 结 合 ， 从 而 引 导 DNA 分 子 子 链的延伸。而DNA聚合酶由于它的保真系统决定 它 不 能 从 头 合 成 DNA 单 链 ， 所 以 DNA 复 制 时 先 由 RNA 聚 合 酶 合 成 一 段 RNA 链 ， 再 由 DNA 聚 合 酶起到DNA分子复制时的延伸功能，形成互补的 子链。
问题2 PCR技术中加入的“引物”是什么？有什么 作用？引物会在PCR仪中复制吗？
引 物 是 在 DNA 分 子 复 制 时 起 引 导 作 用 一 段 短 RNA 或 单 链 DNA 片 段 ， 可 结 合 在 脱 氧 核 苷 酸 链 上与之互补配对的区域，其功能是作为核苷酸聚 合作用的起始点，DNA聚合酶可由其3’端开始合 成新的核酸链。细胞内的引物是RNA链，由RNA 酶根据DNA链碱基序列自动合成。
问题3 为什么细胞内DNA复制的引物是RNA？ PCR的引物是DNA？
细胞内DNA分子复制过程可概括为：（1）双链 的解开；（2）RNA引物的合成；（3）DNA链 的延伸；（4）切除RNA引物，填补缺口并连接 相邻的DNA片段。
迄今为止，无论在原核生物还是在真核生物中所 发现的DNA聚合酶，都必合 成 新 的 DNA 链 （ 由 5’→3’方向延伸）。
在PCR仪中用的是DNA引物，是人工设计合成， 一般不用RNA作为引物，因为RNA引物需要被切 除，而PCR仪中没有这种酶，再说，若用的RNA 引物被切除后将使这个新合成的DNA的两端都出 现了一段单链而不稳定。
PCR、RT-PCR常见问题分析
Primer premier5.0使用简介
主要功能: 1、引物设计 2、限制性内切酶位点分析 3、DNA基元(motif)查找 4、同源性分析
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Primer premier5.0使用简介
引物设计最常用软件 引物序列自动搜索功能最强大 简单易用 可用于设计简并引物
Taq 、 Pfu 、 HotStart Taq 、 Taq plus 、 Long Taq 、 Taq Platinum dNTP 引物 SP6,Tn7,M13
PCR
DNA Marker：22
种不同大小的分子量标准
RT-PCR
TA 克隆系统：
pBS-T 载体、连接和克隆试剂盒 pGM-T 载体、连接和克隆试剂盒 pCF-T 、pCF-Blunt 载体、快速连接试剂盒 感受态细胞
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升博生物 专业服务
提高PCR特异性的 策略
四种策略
巢式PCR（Nest-PCR） 递减PCR（TouchDown PCR）
热启动PCR（HotStart PCR）
使用PCR增强剂
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无扩增产物之PCR条件原因
原 因
1. 2. 3.
退火温度 延伸时间 循环次数
1.
对 策
2. 3.
递度PCR 聚合酶的延伸速度 适当增加循环数
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PCR常见问题解答
第一部分核酸DNA和RNA提取常见问题分析1. RNAfixer的工作原理?浸入组织，抑制RNase的活性。
运输方便，是非液氮类的一种样品储存液。
2. 对于内源RNase丰富的组织和样品，如何消除RNase?可以在提取时候多加裂解液，比如4：1等。
3. TRIpure and RNApure区别?胍盐类的裂解液一样，RNApure附加有离心柱，和漂洗液，是Kit。
TRIpure只是裂解液。
4. 凝血的gDNA和RNA的提取与新鲜血的提取不同?需加一个分离柱(separate column)分开凝血。
5. MicroRNA提取和定量?过2次离心柱，得到200 bp一下的小RNA。
可以测定OD定量。
6. 血清，血浆，血液RNA提取的区别?以及Viral RNA提取的方法?液体类样品RNA提取用TRIpure LS。
一般血清、血浆是无细胞样品，含游离的RNA，量比较少，建议加Carrier RNA在提取时候。
病毒RNA提取最好加Carrier RNA在提取时候，BioTeke有专门的病毒RNA提取试剂盒。
7. 通用植物RNA提取常见问题：蛋白质污染?DNA污染-DNaseI消化(Kit does not provide it, please get it from other companies.)8. 真菌RNA提取可用RNApure 或者通用植物RNA提取Kit。
9. DNA cleanup from gel and PCR, 区别?胶回收含有一个溶胶液。
多功能胶回收可以用于胶回收和PCR产物回收。
10. 土壤DNA提取优点?无需要机械破碎样品和过柱的纯化方式，减少DNA的锻炼和得率，达到实验目的。
第二部分PCR/RT-PCR常见问题解答1. 二次PCR无目标产物，电泳孔道亮?Template稀释和重新设计引物2. microRNA的反转录问题?microRNA反转录和普通的mRNA的反转录不一样。
教你做RTPCR及保证RTPCR质量应该注意的问题!
教你做RT-PCR及保证RT-PCR质量应该注意的问题！RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。
要求：1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。
2. RT按要求做，一般不会出太大问题。
3. PCR，按常规。
但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。
1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特异的下游引物。
如果用a和b方法，是扩增的所有的cDNA（理论上），还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。
如果用c方法，那么要去那里查它的序列呢？问题：在做RT-PCR遇到一怪现象，即对同一动物不同组织扩增同一段基因，结果从一种组织中可以扩出我的目的基因，条带非常的好，而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带，尝试其他条件同样无法得到满意的结果，百思不得其解！（注：已肯定该基因在两种组织中都表达，且内参照在两种组织都可扩增出来）从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的，我测过吸光度，差异还很大，会不会和这有关呢？请高手指教！解答：有两种做法：条件具备的话可用kit进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。
但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行，当然也可能是我买的kit不太好。
（promega）。
应具备的条件高质量的RNA（保留后可做5‘，3’RACE）；引物的（最好产物短点）；若涉及粗略定量的话还应考虑RNA的浓度或是cDNA的浓度（如果由内标分子更好，但我发现其实很不容易将RNA的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样）；体系的均一性等。
我做过RACE（3’RACE是宝生物的Kit；5‘RACE是Gibico），但现在再进行另一个同源基因的3‘RACE时却怎么也P不出来，这两个基因是由同一对引物扩增出来的，其中一个已经获得了全序列（RACE的方法），而另一个基因的3’UTR却增么也扩不出来，我推测是不是该基因的3‘UTR太长的缘故，我都快绿了，有无RT-PCR的常用内标b－actin 和GAPDH的使用有选择性吗？比如不同的细胞，不同的刺激。
RT-PCR中遇到的问题及解决方法
RT-PCR中可能遇到的问题及处理方法摘要：本文就在RT-PCR实验中可能遇到的，包括在琼脂糖凝胶电泳分析中看到少量或没有RT-PCR产物、在琼脂糖凝胶分析中看到非预期条带、多聚糖同RNA共沉淀、cDNA第一链合成错误或数量少、RNA二级结构太多等问题进行分析，并提出了相应的可能的处理方法。
RT-PCR 为反转录RCR（reverse transcription PCR）和实时PCR（real time PCR）共同的缩写。
逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。
由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。
随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。
原先的RNA模板被RNA酶 H降解，留下互补DNA。
RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。
RT-PCR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。
RT-PCR的关键步骤在是RNA 的反转录，要求RNA模版为完整的且不含DNA、蛋白质等杂质。
1 材料与方法1.1材料1.1.1 RT-PCR技术相关试试剂:oligo: 多聚体，相当于mRNA引物AMV RT：禽类成髓细胞瘤病毒逆转录酶MMLV RT：莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶dNTPs：脱氧核苷酸RNase：RNA酶抑制剂PCR Buffer：RT-PCR缓冲液MgCl2：2价镁离子1.2 方法1.2.1 RNA提取组织剪碎加入1ml Trizol，冰上匀浆（边匀浆边暂停）。
转入一新EP管中（1.5ml），室温保存5min。
加氯仿0.2ml，振荡混合（手摇剧烈），室温放置5min。
10000 rpm 4℃离心15min。
转移上层水相（吸70%）到一新EP管中，加异丙醇0.5ml,振荡混合，室温保存10min。
pcr相关问答试题及答案
pcr相关问答试题及答案PCR（聚合酶链反应）是一种分子生物学中用于快速复制大量特定DNA 片段的技术。
以下是一份关于PCR的问答试题及答案：一、选择题1. PCR技术中，哪个组分负责合成新的DNA链？A. DNA聚合酶B. 引物C. 核苷酸D. Taq聚合酶答案：A2. 在PCR过程中，哪个阶段DNA双链会解开？A. 变性阶段B. 退火阶段C. 延伸阶段D. 稳定阶段答案：A3. PCR反应中，引物的作用是什么？A. 提供DNA合成的起始点B. 稳定DNA双螺旋结构C. 作为DNA聚合酶的催化剂D. 提供核苷酸答案：A二、填空题4. PCR反应通常包括三个主要阶段：________、________和________。
答案：变性、退火、延伸5. 在PCR反应中，________是用来识别和结合到目标DNA序列上的短片段。
答案：引物三、简答题6. 描述PCR反应中的变性阶段发生了什么？答案：在变性阶段，PCR反应管中的DNA双链被加热至高温，导致氢键断裂，从而使DNA双链解开成为单链。
7. 解释为什么PCR技术在分子生物学中如此重要？答案：PCR技术在分子生物学中非常重要，因为它能够在短时间内从极少量的DNA模板中快速复制出大量的特定DNA片段，这在基因克隆、遗传指纹分析、病原体检测和诊断等领域有着广泛的应用。
四、计算题8. 如果一个PCR反应的效率是100%，并且进行了30个循环，那么理论上起始DNA模板的数量将增加到多少倍？答案：理论上，每个循环都会使DNA数量翻倍，所以30个循环后，DNA的数量将增加到2^30倍。
五、论述题9. 讨论PCR技术在医学诊断中的应用，并举例说明。
答案：PCR技术在医学诊断中应用广泛，例如在传染病的诊断中，可以通过检测特定的病原体DNA来快速确诊。
再比如，在遗传疾病的筛查中，PCR可以用来检测特定的基因突变。
此外，PCR还可以用于肿瘤的早期诊断，通过检测肿瘤相关基因的表达情况，有助于早期发现和治疗。
RT-PCR常见问题
RT-PCR常见问题什么是RT-PCR？RT-PCR全称为反转录聚合酶链式反应（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction），是一种常用的分子生物学技术。
它通过先将RNA转录成cDNA，再进行聚合酶链式反应来扩增目标DNA序列，从而便于对目标基因的定性和定量分析。
RT-PCR的原理是什么？RT-PCR的基本原理是先通过逆转录酶（Reverse Transcriptase）将RNA转录成互补的cDNA，然后利用聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）对cDNA进行扩增。
逆转录酶根据RNA模板合成cDNA，聚合酶负责在不断升高的温度下合成新的DNA链。
RT-PCR常见的应用有哪些？RT-PCR技术在许多领域得到广泛应用，主要用于以下方面：1.基因表达分析：通过检测转录产物的浓度，了解特定基因在不同生理状态下的表达水平。
2.病原微生物检测：对病原微生物的核酸进行扩增和检测，用于诊断和监测传染病。
3.肿瘤检测和诊断：检测癌细胞中特定基因的表达水平，以辅助肿瘤的早期诊断和治疗选择。
4.病毒感染检测：通过检测病毒基因组的存在和复制水平，帮助诊断病毒感染。
5.遗传病诊断：通过检测患者DNA中的突变位点，早期发现和预防遗传病。
RT-PCR实验中常见的问题有哪些？在进行RT-PCR实验时，常见的问题包括：1.污染：实验室环境和试剂可能导致样品污染，影响实验结果。
因此，严格控制实验条件和采取相应的质量控制措施非常重要。
2.物质稀释和浓度计算：正确计算样品和试剂的稀释倍数以及逆转录反应液和扩增反应液的浓度对于得到准确结果至关重要。
3.阴性对照：包括模板对照和水对照，用于检测反应物的特异性和检测污染。
如果阴性对照出现阳性结果，可能是污染导致的。
4.温度控制：在逆转录和扩增过程中，保持恒定的温度是非常重要的。
温度的变化可能导致逆转录或扩增效率低下或产生非特异性产物。
RT-PCR问题问答 Microsoft Word 文档
问：两个平行管，前面所有步骤都一样的话，仅仅是最后上样量10ul和5ul,那这两个目的条带的光密度比值（减去阴性对照，阴性对照是用1μlDEPC水代替cDNA进行PCR）应该是多少？是2倍，还是别的值，我做出来的是1.3~1.4倍关系，请大家指教，谢谢~答：这样的问题我以前也曾遇到过,理论上应该是两倍,但是你的结果是1.3~1.4倍,帮你分析有以下原因:1.加样误差:两个平行管，即使所有步骤都一样,但是由于PCR前加样都是微量操作,比如Taq酶，dNTP，膜板量以及引物都可能存在加样误差．２.ＰＣＲ仪：ＰＣＲ仪不同槽之间总是存在微小差异，即使是同一槽的不同孔之间也有可能会存在细微差异，不过一般来说这种差异要比前者小一些，所以我建议同一批同一槽跑ＰＣＲ．３.跑胶的问题：即使是同一块胶，不同的孔之间也有可能会存在微小差异，所以最后测得的光密度值与预期值有一定出入．鉴于以上各种可能存在的原因，建议你ＰＣＲ前两管的量并作一管加样，加完后再分为两管，这样可以避免加样误差，同一批同一槽跑ＰＣＲ，再跑胶看看．祝你成功！问：那位可以告诉我PT-PCR最后电泳产物鉴定，只需和目的基因片断大小一致，同时内参，及阴性对照均正确即可证明实验成功，还是产物需基因测序，或尚需酶切鉴定方可证明，为什么，非常感谢！答：一般都是要测序的，产物大小一样，酶切正确（用片段内的酶切位点把片段切成两段）就可以基本确定正确了，然后就可以克隆测序（当然也可以PCR产物测序）了。
问：以前没有做过，所以不太知道，请各位行家给我介绍一点关于内参的选择方面的知识及经验，多谢！答：1.我们一般都用B-Actin,好用2. GAPDH也是比较好的内参，你可以考虑一下3. GAPDH不错的，各种片断长度基本都有，能满足大多数做内参的要求问：我有一批甲醛固定手术标本,现在想取点组织做ＰＣＲ，主要是研究目的基因是否有突变．现在不知道如何下手，如何取，取多少量，是否要用ＰＢＳ缓冲液冲洗然后放匀浆器中制成匀浆？答：是否为石蜡包埋组织？将组织制成7μm厚切片，取适量，3-5片即可，用镊子将其钳入1.5ml EP管中，分别用1mL二甲笨于65℃脱蜡两次，脱蜡时间为2h和12h。
PCR常见问题集锦
目的建议RT与PCR使用不同的引物或需要灵活选择PCR DNA聚合酶两步法RT-PCR系统高灵敏度一步法或两步法RT-PCR系统高特异性含有适当的DNA聚合酶的两步法RT-PCR系统或具有高保真Platinum Taq酶的一步法RT-PCR系统高保真度含有Pfx Taq酶的两步法RT-PCR系统长的反转录结果通常使用两步法RT-PCR系统可达到最佳结果含Elongase酶的一步法RT-PCR系统二、Generacer1. 如何针对Generacer试剂盒设计基因特异性引物（GSP）？使用5’或3’RACE试剂都需要至少一条基因特异性引物，您在设计引物时需要注意以下几点要求：*50-70％的GC含量，以提高引物熔点（Tm）*23-28个碱基长度，以提高引物特异性*降低3’端GC含量，将引物非特异性结合的可能性降至最低2. 为什么得不到RACE产物？*加入Hela对照*低质量的RNA模板*逆转录失败，SSII和SSIII非常适用于长模板cDNA的合成*目的基因丰度太低，可以通过提高PCR的循环次数来解决，建议使用巢式PCR*目的基因没有表达，可以通过使用两条GSPs来分析cDNA中是否含有目的基因*目的基因太长而不适合进行反转录，建议使用GeneRacer试剂盒中的Oligo dT来得到全长cDNA，使用随机引物或与模板的5’端尽可能近的GSP进行PCR。
*cDNA模板属于困难模板，可以通过以下方法解决：优化PCR反应参数及反应体系；降低退火温度；使用5-10％的DMSO帮助通过高GC含量区；使用高保真度和高延伸能力的酶进行PCR反应。
3. RACE的PCR结果有杂带RACE PCR杂带或非特异性PCR条带可能是由于以下原因：*GSP与其他cDNA的非特异性结合会导致在扩增目的产物时得到无关产物。
*GeneRacer引物和cDNA的非特异性结合会导致产生一端带有GeneRacer引物序列的PCR产物。
PCR、RT-PCR常见问题及分析
提高PCR、RT-PCR
04
实验成功率的建议
选择合适的引物
总结词
引物的选择是PCR和RT-PCR实验的关键步 骤，直接影响到实验的成功与否。
详细描述
选择引物时，应确保引物与目标序列的特异 性结合，避免引物二聚体和非特异性扩增的
产生。引物长度、GC含量和特异性等参数 需进行优化，以提高扩增效率和特异性。
试剂问题
总结词
试剂的质量和纯度对PCR实验结果具有重Biblioteka 要影响。VS详细描述
DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2等试剂的 质量和纯度都会影响PCR实验结果。低质 量的试剂可能导致PCR产物减少或非特异 性扩增。此外，试剂的储存和配制过程中 的问题，如试剂过期、污染等，也可能影 响PCR实验结果。
PCR、RT-PCR实验
总结词
假阳性是指PCR或RT-PCR结果中出 现的实际不存在的产物。
详细描述
假阳性可能是由于污染（如试剂、样 品或实验室环境的污染）或交叉污染 引起的。此外，不适当的引物设计或 使用过期的试剂也可能导致假阳性。
假阴性
总结词
假阴性是指PCR或RT-PCR结果中未检测到 实际存在的产物。
详细描述
假阴性可能是由于引物与模板的结合位点减 少或消失，或者由于反应条件不适当（如温 度、离子浓度等）导致的。此外，样品中存 在的抑制剂也可能影响PCR或RT-PCR的扩 增效率，导致假阴性。
PCR、RT-PCR常见问 题及分析
contents
目录
• PCR、RT-PCR基本原理 • PCR、RT-PCR实验操作中的常见问题 • PCR、RT-PCR实验结果分析中的常见问
题 • 提高PCR、RT-PCR实验成功率的建议
PCR实验室常见问题及经验分享
PCR实验室常见问题及经验分享一、没有ct值二、ct值过晚三、阴性对照扩增有信号四、标准曲线不佳五、熔解曲线峰不特异六、扩增曲线异常七、扩增效率低聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。
一、没有ct值检测结果遇到没有Ct值情况,排查是否有以下问题:1、循环数不够(一般不超过45循环,不仅背景值提高,定量也不准);2、PCR程序设置错误,检测荧光信号的步骤有误。
一般SG法采用72℃延伸时采集,TaqMan法则一般在退火结束时或延伸时采集信号,另外荧光采集是否选中;3、引物或探针降解。
可通过PAGE电泳检测引物和探针是否降解;4、模板量可能降解或上样量不足(不超过500ng,根据试剂盒说明书即可),对未知浓度的样本应从系列稀释样本的最高浓度做起;如果发生模板降解,应考虑样本准备中杂质的引入及反复冻融的情况,建议将模板样本小量分装储备,避免反复冻融;5、引物探针是否合适(尤其是引物跨越内含子,以确保扩增基因组DNA;上下游引物Tm值超过4℃以上也会影响扩增)。
二、ct值过晚在相对定量中,Ct值一般控制在15—25之间比较好,如果在绝对定量中,对低拷贝数的样品,Ct值会增大,但是一般不宜超过40循环,否则定量不准确。
因此,判断Ct值出现过晚是否属于非正常情况,需要根据具体实验设计和目的进行。
1、扩增效率低。
引物之间或者引物和探针的比例不合适,需要进行优化;引物或探针设计不合理,需要重新设计;2、PCR程序不合适,改用三步法进行反应,或者优化退火/延伸温度,可以适当降低退火温度;退火/延伸时间短(可以在推荐的时间条件下延长10s);3、MgCl2浓度不合适,增加镁离子浓度等。
PCR各种反应成分的降解或加样量的不足;4、PCR产物太长。
PCR产物设计超过500bp;5、模板存在抑制物。
用高纯度模板进行PCR检测或将模板进行稀释。
PCR常见问题解答
PCR常见问题解答Q：扩增效率低：条带较弱或无扩增?A：1、酶的原因：实验表明，PCR酶对DNA具有一定的偏好性。
如使用一种酶经过优化也难以获得理想扩增时，可以尝试别的PCR酶。
2、模板、引物的原因：确保模板、引物的品质，保证没有降解。
另外，如果模板含有较多的抑制物时(如植物基因组模板)，推荐使用抗抑制能力强的PCR酶，还可以对模板进行梯度稀释后扩增，摸索合适的模板用量。
3、反应体系与条件的原因：增加循环数、降低退火温度、适当升高Mg2+工作浓度，都可以提高扩增效率，但同时会导致特异性与保真性下降，需要根据具体的实验要求优化合适的条件。
Q：扩增特异性差：引物二聚体、杂带、拖尾等?A：1、选择热启动酶：与普通PCR酶相比，热启动酶具有更高的扩增效率与特异性。
2、优化反应体系与条件：升高退火温度可以有效提高特异性。
另外减少循环数、适当降低Mg2+工作浓度，也可以提高特异性，但都会导致扩增效率的下降，需要根据具体的实验要求优化合适的条件。
还可以尝试某些特殊的程序，如巢式PCR、Touch Down PCR等。
3、PCR产物需要进行后续实验时，如果确定有目的条带扩增，可以凝胶回收目的条带。
Q：扩增保真性差：突变、插入、缺失等?A：1、选择高保真酶：B型DNA聚合酶，如Pfu系列酶，具有3’→5’的外切酶活性，能够校正错配的碱基，具有高保真性。
另外，复合酶中由于有B型DNA聚合酶的存在，也具有较高的保真性，但保真性通常较B型DNA聚合酶要低。
2、优化PCR体系与条件：适当增加模板量，减少循环数，可以降低突变几率，提高保真性。
3、确认保真性低的原因：有时保真性低并非由PCR引起，PCR扩增通常只会导致数量很少的单碱基突变。
如果产物测序后，发现有大量的突变，或有明显的插入、缺失等，很可能来自其它实验步骤，如DNA在大肠杆菌中复制时发生重组，或是测序时的污染。
这种情况，可以重新挑若干克隆测序，或直接更换所用菌株。
PCR相关简介以及常见问题处理
一、降落PCR，设计多循环反应的程序，以使相连循环的退火温度越来越低。
由于开始时的退火温度选择为高于估计的Tm值，随着循环的进行，退火温度逐渐降到Tm值，并最终低于这个水平，用于确保第一个引物—模板杂交事件发生在最互补的反应物之间，即那些产生目的扩增产物的反应物之间。
尽管退火温度最终会降到非特异杂交的Tm值，但此时目的扩增产物已开始几何扩增，在剩下的循环中处于超过任何滞后（非特异）PCR产物的地位。
由于目标是在较早的循环中避免低Tm值配对，在TD—PCR中最好应用热启动技术。
设计时，退火温度的范围应跨越15℃左右，从高于估计Tm值至少几度到低于它10℃。
例：一对没有简并的引物—模板的计算Tm值为62℃。
则：从65℃—>50℃（每2cycles降退火温度1℃），再在50℃退火温度下做15个循环。
实验中如持续出现假象带（杂带），则是因为起始退火温度太低，或目的扩增产物和非目的产物的Tm值相差无几，或非目的扩增物以更高的扩增效率扩增，可把退火温度每降低1℃所需的循环数增加到3或4。
二、1、不同的机子、甚至同一台机子同样的程序还有可能出现不一样的结果；2、扩出的条带比较浅可以做一个降落pcr，再用自己之前延伸的温度扩25个循环，这样结果应该会好点。
也可以做梯度pcr摸索最佳延伸温度；3、LZ第二次扩基因的时候阴性对照都有条带了，有可能操作过程体系污染了。
模板量加多了也会出现杂带，或是条带不清晰的情况产物量少，可以用所得的PCR产物，为模板再进行一次PCR这样可以增加产物量。
有非特异性条带，我认为不是机子问题，而是PCR 本身就存在三、引物(PCR引物为DNA片段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链）、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。
引物有多种设计方法，由PCR在实验中的目的决定，但基本原则相同PCRY。
PCR所用的酶主要有两种来源：Taq和Pfu，分别来自两种不同的噬热菌。
其中Taq扩增效率高但易发生错配。
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1. 问题：RT-PCR灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。
可能原因：
1）RNA被降解
建议解决方法：
在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA使用良好的无污染技术分离RNA；
在将组织从动物体取出后立刻处理在100％甲酰胺中储存RNA；
如果使用胎盘RNase抑制剂，不要加热超过45℃或pH超过8.0，否则抑制剂或释放所有结合的RNase。
而且，在≥0.8mM DTT时加入RNase抑制剂，一定要存在DTT。
2）RNA中包含逆转录抑制剂
建议解决方法：
通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。
用70％（v/v）乙醇对RNA沉淀进行清洗。
可以加入糖元（0.25μg到0.4μg/μl）以帮助小量样品RNA的恢复。
逆转录抑制剂包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸钠，spermidine，甲酰胺和胍盐。
将对照RNA同样品混合，同对照RNA反应比较产量以检验抑制剂。
3）多糖同RNA共沉淀
建议解决方法：
使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。
4）用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火
建议解决方法：
确定退火温度适合您的引物。
对于随机六聚体，建议在反应温度保温之前先在25℃保温10分钟。
对于基因特异性引物（GSP），可以试一下其他GSP，或换用oligo(dT)或随机六聚体.
确定GSP是反义序列。
5）起始RNA量不够
建议解决方法：
增加RNA量。
对于＜50ng的RNA样品，可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。
6）RNA模板二级结构太多
建议解决方法：
将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火.
提高逆转录反应温度，对SuperScriptⅡ可以到50℃，对ThermoScript可以到65℃。
注意：不要在＞60℃时使用oligo(dT)引物，选择一个在反应温度可以退火的GSP。
对于＞1kb的RT-PCR产物，保持反应温度≤65℃。
注意：不要在高于37℃时使用M-MLV。
如果不需要全长cDNA，在第一链反应中使用随机引物。
7）引物或模板对残余的RNA模板敏感
建议解决方法：
在PCR前用RNaseH处理。
8）靶序列在分析的组织中不表达
建议解决方法：
尝试其他靶序列或组织
9）PCR没有起作用
建议解决方法：
对两步法RT-PCR，不要在PCR步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物。
2.问题：PCR灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。
可能原因：
1）PCR引物设计较差
建议解决方法：
避免在引物3'端含有互补序列。
避免可以形成内部发卡结构的序列。
设计Tm类似的引物。
2）DNA含有抑制剂
建议解决方法：
诸如DMSO，SDS和甲酰胺之类的试剂会抑制Taq DNA聚合酶。
如果怀疑污染了抑制剂，可以使用乙醇沉淀DNA。
3）富含GC的模板
建议解决方法：
对于GC含量＞50％的模板，使用PCRx Enhancer Solution。
4）模板浓度太低
建议解决方法：
使用104拷贝的靶序列，以在25到30个循环中获得信号。
5）镁离子浓度太低
建议解决方法：
从1mM到3mM，间隔0.5mM进行一系列反应，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。
注意：对实时定量PCR，使用3mM到5mM的镁离子浓度。
6＝退火温度太高
建议解决方法：
使用表4的公式估算Tm，把退火温度设定为低于Tm 5℃。
因为这些公式只是估算Tm值，所有真正的退火温度实际会高些或低些。
7＝引物浓度太低
建议解决方法：
最佳引物浓度介于0.1μM到0.5μM之间。
为了精确确定引物浓度，在260nm测量光密度，然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。
3.问题：RT-PCR特异性：在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带。
可能原因：
1＝物和模板非特异性退火
建议解决方法：
在第一链合成中使用GSP，而不是随机引物或oligo(dT)。
试用允许高温cDNA合成的GSP。
2＝GSP设计较差
建议解决方法：
遵循用于扩增引物设计的同样原则
3＝RNA中沾染了基因组DNA
建议解决方法：
使用扩增级DNaseⅠ处理RNA。
使用没有逆转录的对照反应检测DNA污染。
4.问题：PCR特异性：在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带。
可能原因：
1＝形成引物二聚体
建议解决方法：
设计在3'端没有互补序列的引物。
2＝引物和模板非特异性退火
建议解决方法：
以2℃到5℃间隔增加退火温度，减少退火时间。
在开始几个循环使用较高的退火温度，然后使用较低的退火温度。
使用Platinum Taq DNA进行自动热启动PCR。
避免在引物3'端含有2到3个dG或dC。
3＝镁离子浓度太高
建议解决方法：
对于每一个模板和引物组合优化镁离子浓度。
4＝因为扩增复杂模板导致引物错误起始
建议解决方法：
使用巢式PCR或递减PCR。
5＝沾染外源DNA
建议解决方法：
使用抗气雾剂的tip和UDG。
6＝因为二级结构导致引物结合位点无法接近
建议解决方法：
对于GC含量＞50％的模板，使用（1×-3×）PCRx Enhancer Solution。
5.问题：PCR忠实性：PCR在产物序列中引入了错误
可能原因：
1＝聚合酶忠实性低
建议解决方法：
使用带有校正活性的热稳定聚合酶，如Platinum Pfx DNA聚合酶。
2＝循环数太多
建议解决方法：
降低循环数。
3＝四种dNTP的浓度不同
建议解决方法：
制备新的dNTP混合物，保证四种核苷浓度相同。
使用预混合物。