G418原理及筛选方法
最全的G418筛选稳定表达细胞系总结1
最全的G418筛选稳定表达细胞系G418是一种广谱抗生素，可以选择性地杀死没有正确整合的质粒DNA转染的细胞，从而筛选出具有稳定表达的细胞系。
G418筛选是基因转染中常用的一种选择方法，通过对G418敏感性的筛选来选择转化基因。
本文将G418筛选步骤和优化方案。
G418筛选步骤细胞株选取首先需要选取稳定转染所需的细胞株。
需要保证选取的细胞株生长健康、分裂正常、易于培养以及不易死亡。
常用的细胞株有293T、CHO、HEK293。
转染在开始筛选之前，需要将目的基因转染进入所选细胞株。
目前常用的转染方法有磷酸钙共沉淀法、电转染法和脂质体转染法等，需要根据实际情况选择转染方法。
初步筛选完成转染后，需要在培养基中加入G418，通常的加药浓度不超过1mg/mL，推荐浓度为400μg/mL。
在转染后24-48小时内开始进行初步筛选，通过观察细胞的生长状态以及基因表达情况来判断筛选效果。
细分筛选初步筛选后，需要将G418的浓度逐步增加，通常第二轮加药浓度是初步筛选浓度的2倍，第三轮加药浓度是第二轮的2倍。
逐渐递增药物浓度，可以让敏感的细胞死亡，生存的细胞逐渐表达目的基因，从而得到稳定的细胞株。
稳定维持筛选到稳定的细胞后，需要对细胞进行定期维护。
通常可以在培养基中加入适当的G418浓度，维持稳定表达的转染细胞。
优化方案药物浓度G418的加药浓度直接影响到细胞死亡率和筛选效果。
在进行筛选前需要先进行剂量反应实验，通过不同浓度药物的处理，检测细胞生长状态和基因表达情况。
细胞密度传统细胞密度在98%时，死亡率是最高的。
因此，为了降低G418对细胞的毒性，可以将细胞密度控制在70-80%左右。
同时，过稀的细胞密度也会影响到筛选效果，因此需要根据实际情况进行调整。
培养时间筛选时间也直接影响到G418对细胞的毒性程度和筛选效果。
不同的细胞株和实验条件下，对筛选时间的选择有所不同。
通常初步筛选时间在24-48小时，细分筛选筛选时间需要根据实际情况进行判断。
最全的G418筛选稳定表达细胞系总结4
（一）筛选结果鉴定：（1）基因组DNA提取→PCR鉴定外源基因（2）SHG-44-重组pcDNA3阳性细胞、SHG-44-vect裂解→聚丙烯酰胺凝胶电泳→免疫印迹鉴定P16蛋白表达（Western-blot）。
（3）测定外源性基因对SHG-44细胞增殖的影响①流式细胞仪分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3→单细胞悬液→70%酒精固定→裂解细胞→核糖核酸酶消化→碘化丙啶染色→上机分析G1期和G2/M、S期比例。
②细胞生长曲线测定：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3→5×104/孔接种24孔培养板→24hr后各自用苔盼蓝染色计数细胞→计算细胞生长抑制百分率。
③软琼脂克隆形成率分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组pcDNA3→104 细胞→0.3%低熔点琼脂糖培养→1-2周后计数不可少于50个细胞的克隆数→计算克隆形成率抑制率。
三、注意事项1、优化转染条件（脂质体的用量、DNA密度、细胞密度、脂质体和DNA混合孵育时间）每种细胞和质粒均须进行。
用于转染的核酸应高度纯化。
为避免微生物污染，所用溶液滤过灭菌，以及随后的使用应在无菌条件下，这是细胞惯常的做法。
但是，脂质体以及脂质体/ DNA混合物无需滤过除菌。
2、预备脂质体/DNA混合物必须在无血清下进行。
但是在随后的脂质体/ DNA与被转染细胞共孵育的过程中，血清又是培养基的一部分。
3、在转染之前更换培养基，可提高转染效率，但所用培养基必须37℃预温。
4、脂质体/ DNA混合物应当逐滴加入，尽可能保持一致，从培养皿一边到另一边，边加入边轻摇培养皿，以确保均匀分布和避免局部高浓度。
常见问题和解答：Q：我觉得套环法操作不如96孔办法效率高。
A：也不一定.依据实验目的与要求而定. 如果克隆效率较低的细胞,套环可能更好.用96孔板法,如果不是每孔单个细胞,就不能保证是单克隆.即使是增加到每孔十几个细胞或上百个,一个96孔板也只能培养一万个细胞,十万个细胞就至少需要10个板,100万个细胞就需要100个板,对于转基因细胞筛选或基因打靶,工作量就太大了.且细胞在单独生长条件下,远远不如千万个细胞共同培养活力好. 因此还得看这位朋友使用的是什么细胞,有限细胞系还是无限细胞系,转基因还是非转基因,筛选还是不筛选,需要的单细胞克隆株数量多少?Q：请问一种细胞如果转染了稳定表达的，含neo抗性基因的质粒后，如何用G418筛选？我查看了国内、外50几篇文献后发现没有一个定论的说法。
G418的使用
G418是一种氨基糖苷类抗生素 ,在分子遗传试验中，是稳定转染最常用的抗性筛选试剂。
它通过抑制转座子Tn601，Tn5 的基因,干扰核糖体功能而阻断蛋白质合成，对原核和真核等细胞产生毒素 ,包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞 ,也包括原生动物和蠕虫。
当neo 基因被整合进真核细胞DNA后,则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA ,从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达,使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长。
G418的这一选择特性,已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。
418使用方法室温下运输, 干粉在室温下储存，溶于水、甲醇，溶液于-20℃储存由于各真核细胞系对G418敏感度不同,各新细胞系或株稳定转染时杀死非稳定转染细胞所需用量需要通过实验优化。
最适用量通过建立细胞死亡曲线获得。
将细胞稀释至1000cell/ml，每孔100ul加入有培养基的24孔板，将每孔中的G418浓度稀释至0,100,200,300,400,500,600,700,800,900,1000,1100ug/ml等12个级别, 培养10-14天，以细胞全部死亡最低浓度为基准，一般400-800左右，筛选时比该浓度再高一个级别，维持时使用筛选浓度的一半即可。
G418选择浓度范围细胞系或机体G418浓度（ug/ml）中国仓鼠卵巢细胞700～800Madin－Darby犬肾细胞500人上皮A431细胞400猿CV-1细胞500盘基网柄菌属10～35植物10酵母125～500加药时间由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。
随着细胞的代谢G418的浓度和活性都会下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。
G418筛选TZMBL
建立细胞系所用G418 浓度的确定将TZM-bl细胞以1×103个细胞/孔的密度接种到96孔板中。
24 h后，分别用含有100 μg/mL、200 μg/mL、300 μg/mL……1 000 μg/mL G418的DMEM培养细胞。
2~3天更换新鲜培养基，培养2周，选择细胞全部死亡的最低G418浓度作为细胞筛选的浓度。
最终确定筛选用G418浓度为800 μg/mL。
在做稳定克隆筛选之前，一定要做细胞的梯度敏感实验。
通常用100、200、300、400、500、800 ug/ml六种梯度筛选之前确定G418浓度：1，由于每种细胞对G418 的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2，G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素和G418。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3，汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验：3*106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h 后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。
G418筛选稳定表达细胞系PROTOCOL
1.G418的配制：取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒，4度保存。
2.细胞培养：取待测培养细胞，制备成细胞悬液，按等量接种入多孔培养板中，培养6小时左右开始加药。
3.制备筛选培养基：在100ug/ml～1000ug/ml范围内确定几个梯度，比如先做个100ug/ml、400ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml，按梯度浓度用培养基稀释G418制成筛选培养基。
4.加G418筛选: 吸除培养孔中培养基，PBS洗涤一次，每孔中加入不同浓度的筛选培养基。
5.换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。
方法同4。
6.确定最佳筛选浓度：在筛选10～14天内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选浓度。
在第一轮就筛选出最佳G418浓度的可能性不大，最有可能的是出现这种情况：用某一浓度G418的量在筛选14天后还不能杀死细胞，而用下一个梯度的G418的量在10天前就看不到活细胞了。
假如是400ug/ml不能杀死细胞，而800ug/ml在第5天就把所有细胞都杀死了，则可以再用500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml进一步筛选，以确定最佳筛选浓度！心得：由于特性明确的细胞系G418的最佳用量还是比较稳定的，所以有时候不需要在这么大范围内进行筛选。
比如说你要转染NIH3T3细胞，现在我告诉你我测试过NIH3T3细胞对G418的敏感性，我用的筛选浓度是200 ug/ml。
这时你就可以做150ug/ml、200ug/ml、300ug/ml三个浓度进行筛选。
通过预实验确定了最佳筛选浓度后，就可以做稳定转染了。
a 转染：转染后培养24小时或者更长，到细胞增长接近汇合时按1：4密度传代，继续培养，待细胞密度增至50％～70％汇合时；b 加G418:去掉培养液，PBS洗一次，加入按最佳筛选浓度配制好的G418筛选培养基。
c 换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。
G418说明书
G418G418是一种氨基糖苷类抗生素,产品来源：上海浩然生物技术有限公司。
这种氨基糖类抗生素的结构和新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似，在分子遗传试验中,是稳定转染最常用的抗性筛选试剂。
它通过抑制转座子Tn601，Tn5的基因,干扰核糖体功能而阻断蛋白质合成,对原核和真核等细胞产生毒素,包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞,也包括原生动物和蠕虫。
当neo基因被整合进真核细胞DNA后,则能启动neo基因编码的序列转录为ｍＲＮＡ,从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达,使细胞获得抗性而能在含有Ｇ418的选择性培养基中生长。
Ｇ418的这一选择特性,已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。
G418溶液配制时，一般溶于水配成50mg/ml的原液，使用时再稀释使用。
在筛选菌类和藻类时，一般用5mg/l 的浓度或者更低。
筛选哺乳动物细胞是最大可用40 0mg/l的浓度。
筛选筛选之前由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的相同浓度的G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/mL，在100ug/mL~1mg/mL的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
由于每种细胞对G418的敏感性不同，一般变动在100ug/ml～1000ug/ml范围。
而且不同的厂家生产的相同浓度的G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定细胞对这一批G418的最佳筛选浓度。
尽管如此，特性明确的细胞系G418的最佳用量还是稳定的。
《分子克隆》给出了几个常用细胞系所需G418的最佳用量。
加药时间由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染2 4小时之后才开始加G418筛选。
最全的G418筛选稳定表达细胞系总结2
最全的G418筛选稳定表达细胞系2前言在分子生物学领域中，稳定表达细胞系的制备是非常重要的。
而在制备稳定表达细胞系的过程中，G418耐受性筛选是最常用的一种方法。
本文就该方法进行细致的，希望对大家有所帮助。
G418的作用G418是一种广泛应用于细胞培养中的抗生素。
G418的主要作用是通过破坏靶细胞的核糖体的功能而发挥抗生素活性。
这依赖于靶细胞中的耐药性基因，通常经过转染或整体基因组编辑获得。
这些基因通常会转录RNA，并翻译成与蛋白质功能无关的药物代谢酶或其他抗性蛋白质。
筛选细胞系的基本流程G418的筛选过程是稳定表达细胞系的一部分。
经过瞬时转染或电穿孔后，与转染物质中的DNA共染色板并内化进入细胞。
在内化过程中，染色体或质粒DNA 可以在总体上被细胞机制视为异物并准备将其解除。
其中的一个解除机制是通过解除转录RNA，从而将它们从蛋白质生产途径中移除。
G418抑制暴露在表面的核糖体中的修饰基队的蛋白质的生产。
如果细胞体系不具有反抗力机制，则G418会破坏细胞并导致细胞死亡。
然而，通过特定酵母的CUP1锌指转录因子同源工程，使其对G418转化为一种有效的ATP结合剂，从而打开药物代谢酶表达。
可以在这些细胞中选择表达具有耐药性G418药物代谢酶的细胞，并在含有适量G418的培养基上进行培养和筛选。
筛选条件的优化G418抗性筛选过程具有一定的体系依赖性，因此筛选条件需要在洗脱和拍摄步骤之后进行优化。
根据选择的细胞线，典型的筛选条件是0.5mg/ml浓度的G418和2-4周的境况培养。
但是，这些条件可能需要优化以适应特定试验条件，例如在分子克隆中需要更强的选择并且可能需要更长的选育时间。
考虑到选择压连续存在的潜在影响，推荐根据具体情况进行测试并确定适当的药物添加量和持续时间。
稳定表达细胞系的优点与瞬时转染相比，生成稳定表达细胞系有很多优点。
首先，它们可以被保存和用于长期研究，免受数据库变化和反常的实验结果的影响。
G418原理及筛选方法
G418原理及筛选方法原理分析转化的功能和表达需要DNA稳定转染至宿主细胞染色体。
外源基因进入细胞后，部分能够通过细胞质进入细胞核内，根据细胞类型，至多80%的进入核内的外源DNA得到瞬时表达。
极少数情况下，进入细胞的外源DNA通过系列非同源性分子间重组核连接，最终整合进细胞染色体。
细胞基因组自由部分表达，所以整合并不一定意味着表达，只有整合到表达区的基因才会表达，而且整合到不同的染色体区段的外源基因的表达的量也是不同的。
由于摄取、整合、表达外源基因是小概率事件，通常根据新表型筛选稳定转染体。
一般情况下这种新表型由共转染的编码抗生素抗性基因提供。
细菌Tn5 转座子序列（neo抗性基因）携带的氨基糖苷磷酸转移酶可以将G418转变成无毒形式。
G418 是一种氨基糖类抗生素，其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似，它通过影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合成，对原核和真核等细胞都有毒性，包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞，也包括原生动物和蠕虫。
是稳定转染最常用的选择试剂。
当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后，则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA，从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达，使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长。
G418的这一选择特性，已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转染时不加其它抗生素。
其实G418本身有很好的杀菌效果，在用G418进行筛选的过程中很少会发生污染。
但有一点，其实我觉得问题也不是很大，那就是：在老外的一本实验手册中提到，在脂质体转染时所用培养基中最好不加任何抗生素。
我想他的想法可能是脂质体对细胞膜有影响，可能此时加抗生素对细胞损伤较大。
因为庆大霉素、链霉素、G418均是氨基糖甙类药物，其药理作用完全一样。
所以没有必要再用，而且由于另外抗生素的添加实际增加氨基糖甙类药物的浓度，剂量有误差，不利于各实验室之间的交流，在实际操作中，培养液中有抗生素对细胞培养与筛选影响不大。
G418筛选
从G418筛选，转染到单克隆化的总结筛选之前确定G418浓度：1.由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2.G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素和G418。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3.汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4.G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验：3*106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。
加药时间和维持浓度1.由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。
随着细胞的代谢G418的浓度和活性都回下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。
这时药物浓度可以降至200ug/ml。
2.加抗生素的时机，主要是考虑插入到细胞基因组的抗性基因是否已经得到表达。
g418筛选细胞原理
g418筛选细胞原理一、引言在生物学研究中，细胞是一个非常重要的研究对象。
为了更好地理解细胞的功能和特性，科学家们经常需要筛选出特定类型的细胞。
本文将重点介绍一种常用的细胞筛选方法，即使用g418进行筛选的原理。
二、g418的作用机制g418是一种广谱抗生素，属于氨基糖苷类抗生素，常用于细胞筛选和基因转染实验。
它能够抑制细菌和真菌的生长，同时对哺乳动物细胞具有选择性毒性。
g418的作用机制主要是通过抑制细胞内的蛋白质合成而起作用。
三、g418筛选细胞的原理g418筛选细胞的原理是利用细胞对g418的敏感性来筛选出特定类型的细胞。
在细胞培养基中加入一定浓度的g418，只有对g418敏感的细胞才能够存活下来，而对g418不敏感的细胞则会死亡。
因此，通过调整g418的浓度，可以选择性地杀死或保留特定类型的细胞。
四、g418筛选细胞的步骤1. 准备细胞培养基：在培养基中添加适量的g418，使其浓度达到所需浓度；2. 培养细胞：将待筛选的细胞加入带有g418的培养基中，进行培养；3. 观察细胞生长：观察细胞在带有g418的培养基中的生长情况。
对于对g418敏感的细胞，它们将在培养基中存活和繁殖；而对g418不敏感的细胞，则会死亡或生长缓慢；4. 筛选细胞：根据细胞的生长情况，筛选出对g418敏感的细胞。
五、g418筛选细胞的注意事项1. g418的浓度要根据具体实验目的进行调整，过低的浓度可能无法有效筛选出特定细胞，而过高的浓度可能对所有细胞都具有毒性；2. g418的作用时间也需要根据实验目的进行调整，通常需要持续培养一段时间才能筛选出对g418敏感的细胞；3. 在筛选细胞的过程中，需要定期观察细胞的生长情况，及时调整培养基中的g418浓度，以保证细胞的生长和筛选效果。
六、g418筛选细胞的应用g418筛选细胞的方法在生物学研究中得到了广泛应用。
例如，在基因转染实验中，可以利用g418筛选出成功转染的细胞，以便进行后续的功能研究；在细胞分离和纯化实验中，也可以利用g418筛选出特定类型的细胞，以便进一步研究其特性和功能。
最全的G418筛选稳定表达细胞系总结5
最全的G418筛选稳定表达细胞系总结5Q：G418怎么配制？A：我觉得不能用水配，因为这样ＰH会变化很大，至少要用PB Ｓ。
我是配在HEPＥS溶液中的,具体方法如下：1ｇ包装的G４18瓶子中，加入1０ml HＥPES 溶液，浓度为１00 mｇ/mｌ完全溶解后,0.2２uｍ过滤,－20度保存。
HEPEＳ缓冲液配方如下：90ml水中，0.8 g ＮaCl, 0.037g KCl, 0.0１3５gNa2HPO４.2Ｈ2O, ０．1 g葡萄糖,0．５g HＥＰES，溶解,NaO Ｈ调PH至7．05,定容至１00ｍｌ。
Gｏod ansｗｅｒ:推荐用HEPES。
特别是当细胞对G41８不敏感,Ｇ４18使用浓度高时，如果用水、PＢS配置，会极大的改变细胞培养基的pH值，影响细胞的生长。
1mｏl/L HEPE Ｓ的简单配置：HEPES 11.91g,溶解于40ml的ddＨ２Ｏ,用１0moｌ／Ｌ的NaO Ｈ调节ｐH至7.５-8.0，定容至５0ml,０.2２um小滤器过滤。
ＨＥPES最终使用浓度15-20mM。
Q:我想一步筛选出高拷贝整合的高表达的细胞克隆,如果我用很高浓度的G4１8直接加进培养瓶直接筛选，这样做可以吗？我做过Ｇ41８杀伤曲线,30０ｕg\ml就基本上可以杀死细胞,我想直接用1０00uｇ＼m ｌ来筛选,不知是否可行？会不会有什么问题?Ａ: G41８筛选要做预试验确定最佳浓度,将细胞稀释至100０cｅll/ml，每孔100ul加入有培养基的24孔板,将每孔中的G418浓度稀释至0，,１０0, 200,3０0，400,５０0,600,７00，800,9００, 1000，１1.0０ng/ml等１2个级别，培养10-１４天,以最低细胞全部死亡浓度为基准,一般400-8００左右,筛选时比该浓度再高一个级别，维持使用筛选浓度的一半。
G418浓度太高也不好，会对细胞的损伤太大，影响增殖。
我用过Zeｏcｉn，为了加速筛选，用了最低剂量的两倍浓度,结果一个阳性克隆都没筛到，欲速则不达。
G418筛选程序
G418筛选程序一、杀伤曲线1. 在24 孔板内接种细胞，约3x104/孔（只是参考值，根据细胞的体积和生长速度调整），共11孔，培养过夜。
2. 第二天，观察细胞密度为20%-30%（如果密度不合格，请重新进行细胞接种，不要勉强进行，浪费时间）。
稀释G418 (0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 µg/ml，如果G418储液浓度较高，进行稀释时，所取体积很小，有困难，请先把储液进行稀释（需要多少，稀释多少），以稀释的储液在进行稀释)至培养基, 每孔加入0.75m l培养基。
3. 每隔2天观察细胞的存活情况（贴壁细胞飘起即为死亡，悬浮细胞，可以通过观察细胞的膜情况来判断，死亡细胞的细胞膜较为粗糙，有皱褶，没光泽，准确应以取少量细胞进行台盼蓝染色为准），每隔3-4天更换0.75m l含相应浓度G418的培养基。
4. 筛选5-10天（早也不行，晚也不行）内使细胞全部死亡的最低G418浓度，即为杀伤浓度（筛选浓度）；二、细胞筛选1.转染（24孔板进行）或电转后培养24小时，按10%密度传代（传至35mm平皿），继续培养24小时，待细胞密度增至20％～25％汇合时；2.去掉培养液，PBS洗一次，加入按最佳筛选浓度（杀伤曲线实验确定）配制好的G418筛选培养基2-3ml。
3.根据培养基的颜色和细胞的存活情况，每隔3-4天更换一次筛选培养基(培养基用量为2-4ml，细胞多，多加培养基，细胞少，少加培养基), 一般在5-6天内出现细胞大量或少量死亡情况（如果转染效率或电转效率高，则死亡少；如果转染效率或电转效率低，则死亡多；如果筛选浓度偏低，筛选培养基用量少，细胞密度大于80%，会导致大量假阳性克隆）。
如果筛选第一周，出现细胞大量死亡，则在原培养皿中继续加入筛选培养基进行筛选一周；如果筛选第一周，出现细胞少量死亡，则把细胞按10%密度传代（传至35mm平皿，传一个皿即可，多余细胞丢弃），利用筛选培养基进行筛选一周；4.筛选第二周结束后，则把细胞消化下来，进行终点稀释（10ul培养基中含1个细胞，用筛选培养基稀释），把上述10ul细胞悬液加入96孔板中（提前加入40ul筛选培养基），一共加24孔，4小时后观察每个孔的情况，记录只含一个细胞的孔，含有一个细胞的孔用于继续筛选，其余孔舍弃；5.根据培养基的颜色和细胞生长情况换入新的筛选培养基，待细胞密度为80%时，将其传代至24孔板中增殖，待细胞密度为80%时，将其传代至6孔板中增殖，待细胞密度为80%时，将其传代至T25瓶（一传3）中增殖，每隔3天换液。
最新G418筛选稳定表达细胞系经验总结资料
G418筛选稳定表达细胞系经验总结我做了稳定转染，从G418浓度确定到最后的单克隆化鉴定。
有自己的体会也有其他战友遇到的情况, 和大家分享. 没有总结好的地方，大家补充。
筛选之前确定G418浓度：1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素G418。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3、汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验：3x106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。
加药时间和维持浓度1，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。
随着细胞的代谢G418的浓度和活性都会下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。
G418简介
G418简介是一种氨基糖苷类抗生素 ,在分子遗传试验中常被用作抗性筛选。
它通过抑制转座子Tn601，Tn5的基因对原核和真核等细胞产生毒素 ,包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞 ,也包括原生动物和蠕虫。
当neo基因被整合进真核细胞DNA后 ,则能启动neo基因编码的序列转录为ｍＲＮＡ ,从而获得抗性产物的高效表达 ,使细胞获得抗性而能在含有Ｇ41 8的选择性培养基中生长。
Ｇ41 8的这一选择特性 ,已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。
氨基糖苷类抗生素作用机制氨基糖苷类抗生素具有强大的杀细胞作用，主要作用于细胞的核糖体，抑制蛋白质的合成。
作用过程为：1、氨基糖苷类分子吸附于细胞表面，造成细胞膜轻度损伤；2、少数氨基糖苷类分子进入细胞，与核糖体结合，影响正在进行的肽链延长过程，造成遗传密码错读，全盛异常蛋白质；3、异常蛋白质结合进细胞膜，导致细胞膜渗漏；4、大量氨基糖苷类分子进入细胞，形成更多的异常蛋白质，加重了细胞膜渗漏和药物摄入量；5、进入菌体的氨基糖苷类分子显著超过核糖体数时，使核糖体内进行的蛋白质合成起始阶段全部停止，此作用系不可逆的，因此导致细菌迅速死亡。
由于氨基糖苷类抗生素作用的结果，细胞内钾离子、腺嘌吟、核苷酸等重要物质外漏，细胞呼吸抑制、DNA 和RNA的合成也受到抑制。
G418质量指标G418 ：白色粉末，融点138～144℃，溶于水、甲醇。
CAS No.：108321-42-2分子式： C２0H 40N4 O10·2H2 SO4分子量：692.71结构式：比旋： +104°― +121°水分：≤10%吸光值：≤0.015 (280nm,1mg/ml), ≤0.1 (570nm, 100mg/ml)效价： >700 ug/mg储运室温下运输, 干粉在室温下储存，溶于水、甲醇，溶液于-20℃储存。
G418使用方法由于各真核细胞系对G418敏感度不同,各新细胞系或株稳定转染时杀死非稳定转染细胞所需用量需要通过实验优化。
G418筛选稳定表达细胞系
G418筛选稳定表达细胞系分析转化的功能和表达需要DNA稳定转染至宿主细胞染色体。
外源基因进入细胞后，部分能够通过细胞质进入细胞核内，根据细胞类型，至多80％的进入核内的外源DNA得到瞬时表达。
极少数情况下，进入细胞的外源DNA通过系列非同源性分子间重组核连接，形成巨大的***结构最终整合进细胞染色体。
细胞基因组自由部分表达，所以整合并不一定意味着表达，只有整合到表达区的基因才会表达，而且整合到不同的染色体区段的外源基因的表达的量也是不同的。
由于摄取、整合、表达外源基因是小概率事件，通常根据新表型筛选稳定转染体。
一般情况下这种新表型由共转染的编码抗生素抗性基因提供。
细菌Tn5转座子序列（neo抗性基因）携带的氨基糖苷磷酸转移酶可以将G418转变成无毒形式。
G418是一种氨基糖类抗生素，其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似，它通过影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合成,对原核和真核等细胞都有毒性,包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞,也包括原生动物和蠕虫。
是稳定转染最常用的选择试剂。
当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后,则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA,从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达,使细胞获得抗性而能在含有Ｇ418的选择性培养基中生长。
Ｇ418的这一选择特性,已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转让时不加其它抗生素。
其实G418本身有很好的杀菌效果，在用G418进行筛选的过程中很少会发生污染。
但有一点，其实我觉得问题也不是很大，那就是：在老外的一本实验手册中提到，在脂质体转染时所用培养基中最好不加任何抗生素。
我想他的想法可能是脂质体对细胞膜有影响，可能此时加抗生素对细胞损伤较大。
因为庆大霉素、链霉素、G418均是氨基糖甙类药物，其药理作用完全一样。
最全的G418筛选稳定表达细胞系总结3
最全的G418筛选稳定表达细胞系G418是最常用的筛选剂之一，可用于筛选稳定表达的质粒载体含G418抗性基因的细胞系。
在这篇文档中，我们将介绍如何进行G418筛选，以及如何评估稳定表达的细胞系。
G418的使用G418是一种广谱抗生素，能够影响细胞内的核糖体功能。
在含有G418抗性基因的质粒载体中，这一基因将在细胞内表达，从而使细胞对G418具有抗性。
因此，通过加入G418到培养基中，可以筛选出含有G418抗性基因的细胞。
G418的浓度和作用时间很重要。
一般情况下，使用0.4 ~ 1 mg/mL的G418浓度，作用时间为72小时。
当G418加入到培养基中后，需要每两天换一次培养基，并检查细胞生长情况。
如何评估稳定表达的细胞系进行G418筛选后，需要评估哪些细胞系是确实稳定表达了目标基因。
以下是常用的评估方法：1. RT-PCRRT-PCR是常见的定量分析方法之一，可以用于测量目标基因在细胞中的表达水平。
通过提取RNA，用逆转录酶将RNA转录成cDNA，然后用PCR来放大目标区域。
在最后的荧光测量中，可以测量出目标基因的表达水平。
RT-PCR的优点是灵敏度高，且可以针对不同寡核苷酸的序列进行定量分析。
2. Western BlotWestern Blot是常见的蛋白质分析方法之一，可以用于测量目标蛋白在细胞中的表达水平。
通过提取蛋白质，将其分离成各种大小不同的片段，然后用抗体来特异地检测目标蛋白。
Western Blot的优点是能够定量分析特定蛋白，且具有较高的灵敏度。
3. 细胞功能实验在某些情况下，需要通过测量细胞的功能来评估细胞系的稳定表达水平。
例如，对于表达了RNA干扰分子的细胞系，可以通过测定下游基因的表达量或细胞增殖率来检验RNA干扰是否成功实现。
G418筛选稳定表达细胞系是一种常见的实验方法。
在筛选前，我们需要准备含有G418抗性基因的质粒载体，然后在适当的时间和浓度下进行G418筛选。
G418筛选稳定转染步骤
1.G418的配制：方案一：300mgG418加入3ml PBS溶液，浓度为100mg/ml，完全溶解后，0.22um过滤，-20℃保存。
方案二：（1）配制1M HEPES：23.8g HEPES（缓冲能力更强）粉末溶于100ml ddH2O，10NNaOH（加量较多）调节pH至7.3，过滤除菌（较难过滤），4℃保存，终浓度为1mol/L。
（2）5g G418溶于10ml 1M HEPES（pH7.3），终浓度为500mg/ml，-20℃保存。
注：实验中采用方案二时效果较好。
2.制备筛选培养基：用培养基将G418稀释为0 ug/ml、200 ug/ml、300 ug/ml、400 ug/ml、500 ug/ml、600 ug/ml、700 ug/ml、800 ug/ml、900ug/ml、1000ug/ml、1100ug/ml、1200ug/ml24孔板，每孔1ml培养基（含有G418的完全培养基），每个浓度4个重复，则每次换液需各个浓度培养基4ml，现用现配。
200ug/ml300ug/ml400ug/ml500ug/ml600ug/ml700ug/ml800ug/ml900ug/ml10 00ug/ml1100 ug/ml1200 ug/ml3ml完全培养基998.4997.6996..2994.4993.6992..2990.4G418(500mg/ml)1.6ul2.4ul3.2ul4.0ul4.8ul5.6ul6.4ul7.2ul8.0ul8.8ul9.6ul3.细胞培养：将冻存的细胞复苏培养，，传代3至4次使细胞达到良好的生长状态,铺24孔板（200/孔），12h换液，加筛选培养基培养。
4.确定G418最佳筛选浓度：将培养孔中培养基吸除，PBS洗涤一次，每孔加入不同浓度筛选培养基，隔天更换一次筛选培养基，培养10-14天，以最低细胞全部死亡浓度为基准。
注：实验中所确定的最佳筛选浓度为1200ug/ml。
G418筛选
G418筛选相关1.G418筛选要做预试验确定最佳浓度，将细胞稀释至1000cell/ml，每孔100ul加入有培养基的24孔板，将每孔中的G418浓度稀释至0,,100, 200,300, 400,500, 600,700, 800,900, 1000,11 .00ng/ml等１2个级别, 培养10-14天，以最低细胞全部死亡浓度为基准，一般400-８００左右，筛选时比该浓度再高一个级别，维持使用筛选浓度的一半。
2.我们掌握是传过10代以后用维持量，但不能不用，因为有时候抗性基因会丢失，如果没有G418，很快会形成优势的。
３.即是有G41抗性，也不一定有目的基因，单克隆化操作是很重要的。
2.转染后，每个细胞内目的基因与宿主染色体的整合状况是不同的，目的蛋白表达有的多，有的少，外源蛋白表达少的细胞由于代谢负荷较小，所以生长较快，在生长若干代之后，表达少的细胞会形成优势，长期之后，表达最弱的细胞会由于竞争优势占主要，转绿色荧光蛋白基因后，表达越来越暗就是这个道理。
所以，要进行单克隆化操作，使得到的均来自于同一祖先细胞，遗传性状尽量一致，也是对高表达细胞的保护。
操作用96孔板法，每代细胞长满后，大多数冻存，留２００cell左右就可以进行该操作了，该方法在很多关于单克隆抗体和细胞原代培养书中均有讲述，我就不赘述了。
必须指出，单克隆化要做几遍，一遍是不够的，我前十代都是这样的，结果绿色荧光蛋白不但没减弱，反而增强了很多。
现在很多代了，很稳定。
3. 1.可以肯定的是，外源基因与宿主染色体之间的整合是随机的而且不是单拷贝的，这点我们做过FISH验证过，表达量与整合数目，上游序列特性，特定部位DNA立体结构都是相关的，装入了SV40只是增加了表达了数目，但并不能掩盖其它因素对表达的影响。
按你的讲法，转染完GFP的细胞应该亮度一致，但实际上差别很大。
neo基因也是这样，而且，同一细胞中不同基因的拷贝数不会相同，不同细胞同一基因的数目也不会相同，这点可以用数学关于泊松分布的观点理解。
G418原理
1.原理分析转化的功能和表达需要DNA稳定转染至宿主细胞染色体。
外源基因进入细胞后，部分能够通过细胞质进入细胞核内，根据细胞类型，至多80％的进入核内的外源DNA得到瞬时表达。
极少数情况下，进入细胞的外源DNA通过系列非同源性分子间重组核连接，形成巨大的***结构最终整合进细胞染色体。
细胞基因组自由部分表达，所以整合并不一定意味着表达，只有整合到表达区的基因才会表达，而且整合到不同的染色体区段的外源基因的表达的量也是不同的。
由于摄取、整合、表达外源基因是小概率事件，通常根据新表型筛选稳定转染体。
一般情况下这种新表型由共转染的编码抗生素抗性基因提供。
细菌Tn5转座子序列（neo抗性基因）携带的氨基糖苷磷酸转移酶可以将G418转变成无毒形式。
G418是一种氨基糖类抗生素，其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似，它通过影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合成,对原核和真核等细胞都有毒性,包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞,也包括原生动物和蠕虫。
是稳定转染最常用的选择试剂。
当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后,则能启动neo 基因编码的序列转录为mRNA,从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达,使细胞获得抗性而能在含有Ｇ418的选择性培养基中生长。
Ｇ418的这一选择特性,已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转让时不加其它抗生素。
其实G418本身有很好的杀菌效果，在用G418进行筛选的过程中很少会发生污染。
但有一点，其实我觉得问题也不是很大，那就是：在老外的一本实验手册中提到，在脂质体转染时所用培养基中最好不加任何抗生素。
我想他的想法可能是脂质体对细胞膜有影响，可能此时加抗生素对细胞损伤较大。
因为庆大霉素、链霉素、G418均是氨基糖甙类药物，其药理作用完全一样。
所以没有必要再用，而且由于另外抗生素的添加实际增加氨基糖甙类药物的浓度，剂量有误差，不利于各实验室之间的交流，在实际操作中，培养液中有抗生素对细胞培养与筛选影响不大。
最全的G418筛选稳定表达细胞系总结4
最全的G418筛选稳定表达细胞系G418，又称为geneticin，是一种广谱抗生素，常用于筛选稳定转染的哺乳动物细胞系。
G418能够靶向细胞内的Neo基因表达，使转染后含有Neo基因的细胞能够存活。
在此，我们将详细介绍如何使用G418筛选稳定表达细胞系，并常见问题以及解决方法。
G418筛选实验步骤转染表达向量在进行G418筛选实验之前，首先需要将目标基因克隆到表达向量中，并将表达向量转染到细胞系中。
转染方法常见的转染方法有磷酸钙共沉淀法、聚乙烯醇法、脂质体转染法等，具体方法可参考相应文献或实验室内部标准操作规程进行操作。
添加G418将转染过的细胞在培养基中培养至80%～90%的密度后，加入G418。
加入G418前需进行药物浓度优化实验，确定最适合本实验所用细胞系及所选转染质粒的G418浓度。
筛选G418作用于Neo基因表达的细胞会死亡，而未表达Neo的细胞能够幸存下来。
因此通过逐渐增加G418浓度，筛选出稳定表达目标基因的细胞。
扩增筛选出稳定表达细胞后，需要扩大细胞数量以供后续实验使用。
可使用限稀稀释法或其他适合本实验的细胞扩增方法进行扩增。
常见问题及解决方法细胞死亡太多可能原因： - G418浓度过高； - 转染效率低。
解决方法： - 降低G418浓度； - 提高转染效率。
细胞生长太慢可能原因： - G418浓度不足； - 细胞密度过高。
解决方法： - 增加G418浓度； - 控制细胞密度。
稳定表达效果不理想可能原因： - Neo基因位点修饰造成表达低下； - 转染质粒与细胞系不匹配。
解决方法： - 检查Neo基因位点修饰； - 更换适合细胞系的转染质粒。
通过对G418筛选稳定表达细胞系的介绍，我们可以看出，G418筛选是一种快速、有效的细胞系稳定性筛选方法。
通过对常见问题及解决方法的，可以及时解决可能出现的问题，保证实验顺利进行。
祝大家在细胞实验中取得好的结果。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
G418原理及筛选方法
原理
分析转化的功能和表达需要DNA稳定转染至宿主细胞染色体。
外源基因进入细胞后，部分能够通过细胞质进入细胞核内，根据细胞类型，至多80%的进入核内的外源DNA得到瞬时表达。
极少数情况下，进入细胞的外源DNA通过系列非同源性分子间重组核连接，最终整合进细胞染色体。
细胞基因组自由部分表达，所以整合并不一定意味着表达，只有整合到表达区的基因才会表达，而且整合到不同的染色体区段的外源基因的表达的量也是不同的。
由于摄取、整合、表达外源基因是小概率事件，通常根据新表型筛选稳定转染体。
一般情况下这种新表型由共转染的编码抗生素抗性基因提供。
细菌T n5 转座子序列（neo抗性基因）携带的氨基糖苷磷酸转移酶可以将G418转变成无毒形式。
G418是一种氨基糖类抗生素，其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似，它通过影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合成，对原核和真核等细胞都有毒性，包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞，也包括原生动物和蠕虫。
是稳定转染最常用的选择试剂。
当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后，则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA，从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达，使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长。
G418的这一选择特性，已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转染时不加其它抗生素。
其实G418本身有很好的杀菌效果，在用G418进行筛选的过程中很少会发生污染。
但有一点，其实我觉得问题也不是很大，那就是：在老外的一本实验手册中提到，在脂质体转染时所用培养基中最好不加任何抗生素。
我想他的想法可能是脂质体对细胞膜有影响，可能此时加抗生素对细胞损伤较大。
因为庆大霉素、链霉素、G418均是氨基糖甙类药物，其药理作用完全一样。
所以没有必要再用，而且由于另外抗生素的添加实际增加氨基糖甙类药物的浓度，剂量有误差，不利于各实验室之间的交流，在实际操作中，培养液中有抗生素对细胞培养与筛选影响不大。
有人认为用磷酸钙共沉淀转染法筛选稳定整合子较好，但这种观点是很多年以前的观点了，而且只是少数人的观点。
我两种方法都用过，但没有特异的比较过，感觉都可以。
磷酸钙便宜，但对溶液配置和实验操作要求很高，尤其是溶液的pH值，要求精确到小数点后2位。
脂质体是现在主流的转染试剂，从没有人说这种方法做整合稳定表达不行。
非脂质体是这几年发展很快的技术，转染效率低，细胞毒性小，价格也不贵，Qiagen就有一个系列。
我个人觉得不必要花太多时间在这方面，自己实验室用得好的技术可以坚持，没有经验的可以选择一个较著名的公司的产品开始，购买之前先下载个说明书看看。
有精力就比较一下几种方法，一般的达到目的就行了。
关键是实验设计。
----------主要参考《细胞培养和分子细胞学技术》和《分子克隆》
G418筛选实验设计
筛选之前。
而且不同的厂家生产的相同浓度的G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定你的细胞对这一批G418的最佳筛选浓度。
尽管如此，特性明确的细胞系G418 的最佳用量还是稳定的。
《分子克隆》给出了几个常用细胞系所需G418 的最佳用量。
具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/mL，在100ug/mL~1mg/mL的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14d内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
看下面的一个试验：3×106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000孔内
应有4%的汇合度。
筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。
所以汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%！
加药时间
由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增殖较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。
随着细胞的代谢G418的浓度和活性都会下降，所以每3~5d都要更换一次含有G418的筛选液。
这时药物浓度可以降至200ug/ml。
培养液
加药筛选约6天左右，细胞会大量死亡，孔中只剩下的细胞寥寥无几。
这时会出现两个问题：1. 死亡的细胞会裂解释放出有害物质，导致那些有neo表达的阳性细胞死亡，即非选择性死亡。
2. 孔中细胞数目很少，细胞之间的信号会变得很弱，也会导致阳性细胞的状态不佳甚至死亡。
这个时候需要一种特殊的培养液：假如你要转染3T3细胞，在3T3细胞汇合度达到80%的时候，换液，培养过夜之后收集培养液，通过滤器消毒，和新鲜的培养液按1：1混合备用。
再转染后筛选过程中就可以应用这种培养基。
挑选单克隆的优化
为了尽量减少阴性克隆的死亡给阳性克隆造成的不利影响以及增加阳性克隆的得率，可以应用套环法或刮除法结合有限稀释法来筛选阳性克隆。
加药后，在高倍镜下，阳性克隆和阴性克隆很容易辨认，在阳性克隆下用记号笔做个标记。
然后刮除阴性克隆，消化阳性克隆后继续筛选培养；或者用套环套住阳性克隆，在套环内加胰蛋白酶或EDTA消化，把消化液吸到另外一个新的孔中培养。
最后再用有限稀释法把阳性克隆在96孔板中筛选。
鉴定之后
一般经过4周左右的筛选，得到的阳性克隆都比较稳定。
但是外源基因如果没有整合到基因组中的话，目的基因还是很容易丢失的。
但是外源基因整合到基因组中的概率太小了，而且是随机整合，会导致表达的目的蛋白的量产生很大差异。
随着培养时间的延续，那些丢失了外源基因的细胞和很少表达目的基因的细胞会占据优势，强表达目的蛋白的细胞会越来越少。
这样再次筛选是必不可少的。
只有经过2次以上的筛选之后才能找到那种我们想要的强分泌目的蛋白的，遗传稳定的细胞克隆。