控制菌检查方法验证解析
1106控制菌检查
方法适用性和供试品检查—沙门菌
检查方法 10g、10ml、 10cm2样品 方法适用性 10g、10ml、 10cm2样品
胰酪大豆胨液体培养基 30~35℃培养18~24小时 0.1ml RV沙门菌增菌液体培养 30~35℃培养18~24小时 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板 30~35℃培养18~48小时
相当于0.1g或ml、0.01g或ml、 0.001g或ml样品
耐胆盐革兰阴性菌的可能菌数（N）
各供试品量的检查结果 0.1g或 0.1ml + + + 0.01g或 0.01ml + + 0.001g或 0.001ml + 每1g（或1ml 或）供试品种 可能的菌数cfu N＞103 102 ＜N＜103 10 ＜N＜102 N＜10
Ch.P2015
肠道菌增菌液体培养基 紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基
大肠埃希菌
胰酪大豆胨液体培养基 麦康凯液体培养基 麦康凯琼脂培养基 胰酪大豆胨液体培养基 RV 沙门菌增菌液体培养基 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基 三糖铁琼脂培养基
培养基
沙门菌
铜绿假单胞菌
胰酪大豆胨液体培养基 溴化十六烷基三甲銨琼脂培养基 胰酪大豆胨液体培养基 甘露醇氯化钠琼脂培养基 梭菌增菌培养基 哥伦比亚琼脂培养基 沙氏葡萄糖液体培养基 沙氏葡萄糖琼脂培养基 念珠菌显色培养基
培养基适用性Biblioteka 控制菌检查 铜绿假单胞菌 培养基 溴化十六烷基三甲铵琼脂培 养基 特性 促生长能力 抑制能力 金黄色葡萄球菌 甘露醇氯化钠琼脂培养基 促生长能力+指示特 性 抑制能力 梭菌 梭菌增菌培养基 哥伦比亚琼脂培养基 白色念珠菌 沙氏葡萄糖液体培养基 沙氏葡萄糖琼脂培养基 念珠菌显色培养基 促生长能力 促生长能力 促生长能力 促生长能力+指示特 性 促生长能力+指示能 力 抑制能力 试验菌株 铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 生孢梭菌 生孢梭菌 白色念珠菌 白色念珠菌 白色念珠菌 大肠埃希菌
控制菌检查培养基适用性检查方案
控制菌检查培养基适用性检查方案一、研究背景和目的：菌检查是指通过检测和培养方法，对样品中的细菌进行分离鉴定和数量测定的过程。
菌检查培养基是进行菌检查的重要工具，其适用性直接影响到检测结果的准确性和可靠性。
因此，对菌检查培养基的适用性进行检查和验证，对于确保菌检查结果的准确性和可靠性具有重要意义。
本检查方案旨在对菌检查培养基的适用性进行系统检查，建立合理、可行的检查流程，以确保培养基的适用性符合相关标准和要求。
二、检查方法和步骤：1.收集样品：2.培养基准备：根据不同菌种和检测要求，选取合适的培养基进行准备。
培养基的准备需要按照相应的标准操作程序进行，以确保培养基的质量和规范性。
3.菌液接种：将收集的菌种，按照规定的菌液接种方法，接种于相应的培养基上。
4.培养条件控制：控制培养基的温度、湿度等条件，以及培养时间，以确保菌种在培养基上可以适应和生长。
5.菌落计数和观察：在培养时间结束后，观察培养基上的菌落形成情况，并进行菌落计数。
6.鉴定和比对：选择代表性的菌落进行鉴定和比对，以确认其和已知菌种的相似性和差异性。
7.结果评估：对所得的结果进行评估和统计分析，比对实验结果与对培养基适用性的要求是否一致。
8.结论和建议：根据实验结果，得出结论并提出相应的建议，包括是否适用、适用范围、注意事项等。
三、影响因素和处理措施：1.培养基成分：培养基中的成分可能对菌种的生长和繁殖产生影响，因此需要确保培养基中的成分符合菌种的需求和标准要求。
2.培养条件控制：地域、温度、湿度、pH等环境因素都会对菌种的生长和繁殖产生影响，因此在进行实验时需要控制这些因素的影响，以确保实验的可靠性和可重复性。
3.常见菌种筛选：针对不同食品、水等样品中的常见菌种，通过前期调查和研究，筛选出适用于相应样品的菌种进行实验。
4.对照组设定：在实验中设置对照组，以确保菌检查培养基的适用性与已知的标准相一致。
四、质量控制措施：1.培养基质量控制：对培养基的成分进行严格控制和质量评估，确保培养基的质量符合标准和要求。
微生物限度检查法(2).控制菌检查方法验证讲义
5.联合使用
适用于抑菌作用较强的中西药制剂。 如：①复方洗必泰栓（水溶性基质）金黄 色葡萄球菌的检验—用1%吐温-80稀释液制 备供试液＋膜法过滤＋滤膜置含5%吐温-80 的硫乙醇酸盐增菌液中→（+）；②生白安 片（含盐酸小檗胺）大肠杆菌检验—低速 离心＋薄膜过滤法→（+）。
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3.薄膜过滤法
本法适用于有抑菌作用的液体制剂。 如：葡萄糖酸洗必泰含漱剂，氯霉素滴眼 剂等。 注意：供试液应加入较多量的稀释液稀释 后，再注入滤器中。
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4.中和法
①磺胺类可加对氨基苯甲酸（100ml增菌培养基 中含1%对氨基苯甲酸0.5-1.0ml）如：复方新诺明 片 ②含重金属盐类可用含巯基化合物（硫乙醇酸钠， L-胱氨酸）的培养基作增菌培养液。如：磺胺嘧 啶银软膏-金黄色葡萄球菌与绿脓杆菌的检验 ③脂溶性药物用表面活性剂中和。如：复方痔疮 栓（含洗必泰）中的绿脓杆菌的检验，仅用吐温80制备供试液即可
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2.离心沉淀集菌法
低速离心（500转/分5分钟）取上清液（弃取抑菌 成分的固体微粒） 高速离心（3000-3500转/分30分钟）弃去上层抑 菌的液体部分，留管底2ml。 本法适用于抑菌作用不强的中西药品，如：平喘 胺片 、速效感冒片（先低速，后高速）；小儿惊 风散（低速离心）。本法操作较烦琐，药品中污 染的微生物有一定的损失。
方法:1.培养基稀释法 2.离心沉淀集菌法 3.薄膜过滤法 4.中和法 5.联合使用
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1.培养基稀释法
供试品加稀释剂稀释到一定倍数后进行检 验（虽然供试品中污染的菌也稀释，但由 于检验结果规定是不得检出，因而有些品 种用稀释法可检出目的菌）。 如百喘朋片[1：10 稀释液3ml 结果（＋） 试验菌28-96个] 。 本法适用于一般抑菌作 用不强的中西药品。
控制菌检查用培养基适用性验证方案
控制菌检查用培养基适用性验证方案1．试验目的控制菌检查用培养基应进行培养基的适用性检查。
本次验证的目的是为了确认麦康凯液体培养基、麦康凯琼脂培养基、RV沙门菌增菌液体培养基、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基、三糖铁琼脂培养基适合大肠埃希菌、沙门菌的控制菌检查。
2. 试验方法照中国药典2015版四部非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法（通则1106）进行试验。
3.试验材料3.1 培养基3.2 菌种3.3 仪器XXXXX水平流净化工作台/生物安全柜、XXXXX立式压力蒸汽灭菌器、XXXXX电热恒温培养箱(30～35℃)、XXXXX生化培养箱（20～25℃）、XXXXX气浴恒温振荡器3.4 稀释剂0.9%无菌氯化钠溶液4.试验过程4.1菌液制备用0.9%无菌氯化钠溶液制成每0.1ml含菌数为不大于100cfu的菌悬液，菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2〜8℃，可在24小时内使用。
4.2 适用性检查4.2.1 麦康凯液体培养基适用性检查取大肠埃希菌菌悬液各0.1 ml分别接种于被检培养基和对照培养基中，在35℃条件下培养24h，进行促生长能力检查。
取金黄色葡萄球菌菌悬液各0.1 ml接种于被检培养基和对照培养基中，在35℃条件下培养24h，进行抑制能力检查4.2.2 麦康凯琼脂培养基适用性检查取大肠埃希菌菌悬液各0.1 ml分别涂布被检培养基和对照培养基平板上，在35℃条件下培养24h，进行促生长能力和指示特性检查4.2.3 RV沙门菌增菌液体培养基适用性检查取乙副伤寒沙门氏菌菌悬液各0.1 ml接种于被检培养基和对照培养基中，35℃条件下培养24h，进行促生长能力检查。
取金黄色葡萄球菌菌悬液各0.1 ml接种于被检培养基和对照培养基中，35℃条件下培养24h，进行抑制能力检查。
4.2.4 木糖赖氨基酸脱氧胆酸盐琼脂培养基适用性检查取乙副伤寒沙门氏菌菌悬液各0.1 ml分别涂布被检培养基和对照培养基平板上，在35℃条件下培养24h，，进行促生长能力和指示特性检查。
2015版《中国药典》微生物检查法控制菌检查法修订解析
养18-24h。
• （4）结果判断：
• 若紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上有菌落生长，则对应培养管为 阳性，否则为阴性。根据各培养管检查结果，查表判断1g或1ml 供试品中含耐胆盐革兰阴性菌的最大可能数。
五、供试品检查
• “未检出试验”与“定量试验”结论
• 耐胆盐革兰阴性菌的可能菌数
各供试品量的检查结果 每1g（或1ml）供试 品种可能的菌数（N）
• 4、结果判断方式：在各控制菌项下，生化 实验和“应进行分离、纯化及适宜的鉴定试 验。”改为较少的生化实验或“采用其它适用要求
控制菌检查法适用于在规定的试验条件下，检查供试品中是否存在特定的微生 物。
当本法用于检查非无菌制剂及原、辅料是否符合相应的微生物标准时，应按下 列规定进行检验，包括样品取样量和结果判断等。
三、培养基适用性
1、对照培养基
（5）尽量临用现配，培养基灭菌后，尽快取出，切忌在 高压锅内过夜存留，固体培养基灭菌或融化后，融化状 态放置不得超过8h；一般预制培养基可置洁净环境
2～25℃保存，但不应超过21d；固体琼脂培养基熔化再
使用应不超过1次。 （6）干粉培养基或培养基原料变质再用；预制培养基储存
（铜绿+/大肠选-）1择8-72性h 増菌培养基培养，可以使受伤的细菌得到修复，提 高检出率。
三、培养基适用性
4、适用性检查
控制菌检查
耐胆盐革兰阴性菌
大肠埃希菌
沙门菌
铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌
梭菌 白色念珠菌
培养基
肠道菌増菌肉汤
紫红胆盐葡萄糖琼脂 麦康凯肉汤
麦康凯琼脂 RVS増菌肉汤
木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂
三、培养基适用性
4、适用性检查
（3）根据每个控制菌检查的培养基逐个说明，控制菌检查用培养 基适用性检查的过程。
控制菌检查——精选推荐
控制菌检查1 方法的验证在建立供试品的控制菌检查法或原检查法的检验条件发生改变可能影响检验结果的准确性时，应对供试品的抑菌活性及检查法的可靠性进行验证。
验证时，按各供试品微生物限度项下的规定（给药途径）选择相应的菌株，并按供试液的制备和控制菌检查法所规定的方法进行。
2 仪器、设备及用具见各控制菌检查项下。
3 试液、指示液见各控制菌检查项下。
5 验证用菌株及菌液制备5.1 菌种大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]。
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]。
乙型副伤寒沙门菌（Salmonellaparatyphi-B）[CMCC（B）50094]。
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10104]。
生孢梭菌（Clostridiumsporogenoes）[CMCC（B）64941]。
5.2 菌液制备分别取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的营养琼脂斜面培养物少许，各接种至5ml营养肉汤培养基内，置36℃±1℃培养18～24h，取均匀培养物1ml用0.9%无菌氯化钠溶液稀释制成每1ml含菌10～100cfu的菌悬液，其菌数在做对照试验的同时用营养琼脂注皿或平板涂布，经培养后计数确定。
生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，培养18～24小时。
用0.9%无菌氯化钠溶液制成1ml含10～100cfu的菌液。
6 供试液的制备[见细菌、霉菌和酵母菌计数7]。
7 验证方法7.1 试验组取规定量供试液及10～100cfu试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查。
验证大肠菌群检查法时，应采用大肠埃希菌作为试验菌。
当采用薄膜过滤法时，试验菌应加在最后一次冲洗液中，冲洗后，取出滤膜接种到增菌培养基中。
7.2 阴性对照组设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的特异性，方法同试验组，验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌检查法时的阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌：验证铜绿单胞菌、金黄色葡萄球菌检查法时的阴性对照菌采用大肠埃希菌。
控制菌检查法
控制菌检查控制菌检查用的培养基应进行培养基的适应性检查，成品培养基、由脱水培养基或按培养基处方配置的培养基均应检查。
菌种试验用菌种的传代次数不得超过5代(从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代)，并采用适宜的菌种保藏技术进行保存,以保证试验菌株的生物学特性。
大肠埃希菌（Escherichia coli）［CMCC(B）44102或CVCC1570]金黄色葡萄球菌（Staphyloccocusaureus）[CMCC（B)26003或CVCC1882]乙型副伤寒沙门菌（Salmonella paratyphiB）［CMCC（B)50094］铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B)10104］生孢梭菌(Clostridium sporogenes）［CMCC(B)64941］白色念珠球菌（canidia albicans）[CMCC（F)98001］菌液制备接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基上，生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，培养18～24小时；接种白色念珠球菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，培养18～24小时。
用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10～100cfu的菌悬液。
菌悬液在室温下放置应在2小时内使用,若保存在2~8℃可在24小时内使用。
适应性检查控制菌检查用培养基的适应性检查项目包括促生长能力、抑制能力及指示能力的检查。
表1 控制菌检查用培养基的促生长能力、抑制能力及指示能力检查液体培养基促生长能力检查分别接种不大于100cfu的试验菌(表1)于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养.与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌应生长良好。
固体培养基促生长能力检查取试验菌各0.1ml（含菌数50~100cfu)分别涂布于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。
微生物控制菌检查方法(薄膜过滤法)验证方案
微生物控制菌检查方法(薄膜过滤法)验证方案微生物控制菌检查方法(薄膜过滤法) 验证方案编码：表一、验证方案的起草与批准1.验证方案起草起草人：起草时期：年月日2.验证小组成员：3.验证方案审核4.验证方案批准批准人：批准日期：二、验证方案1.验证目的和原理1.1验证目的本实验是关于的微生物控制菌检查试验的验证。
验证结果应显示的微生物控制菌试验方法，对检品中可能存在的微生物没有抑制作用，符合验证要求。
1.2原理按照已建立的药品微生物控制菌检查方法，通过已知菌数试液的对照菌的培训对照，验证其操作方法适合该药品的微生物控制菌的检测的正确性。
2.验证方法步骤2.1验证前的准备：将所有的平皿和稀释剂都应该严格按照相关的灭菌程序消毒，以确保其对试验的结果没有影响。
试验菌应选择相应的阴性对照菌。
2.2验证试验的操作计划：用3个不同批号产品按照微生物控制菌检测方法进行平行试验，通过观测是否长菌来判断。
2.3试验结果可接受标准：用标准菌株评价方法“”的微生物控制菌检查试验对检品中微生物的抑菌性。
试验结果应显示；阴性菌对照组不得检出阴性对照菌，试验组应检出试验菌。
3.试验实施3.1试验前的准备3.1.1主要仪器设备：恒温培养箱、生化培养箱、电子天平、高压蒸汽灭菌器、净化工作台。
3.1.2操作环境：操作间应该安装空气除菌过滤层装置。
环境洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。
操作间或净化工作台的洁净空气应该保持对环境形成正压，不低于5pa。
3.1.3试验样品：批号：批号：批号：3.1.4培养基：3.1.5稀释液：PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液以上经115℃高压蒸汽灭菌30min。
3.1.6验证用微生物名称及其编号实验菌株的来源：编号由菌名首字母—传代代数—制备日期组成。
3.1.7器具：无菌薄膜过滤器：（孔径0.45um直径50mm）、无菌培养皿（直径90mm）、无菌移液管（5ml）4.验证方法4.1试验菌种的制备和稀释接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至相应的营养肉汤或BL增菌液10ml中,30～35℃培养18～24小时。
非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法
2020版药典非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法控制菌检查法系用于在规定的试验条件下，检查供试品中是否存在特定的微生物。
当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合相应的微生物限度标准时，应按下列规定进行检验，包括样品取样量和结果判断等。
供试品检出控制菌或其他致病菌时，按一次检出结果为准，不再复试。
供试液制备及实验环境要求同“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法（通则1105）”。
如果供试品具有抗菌活性，应尽可能去除或中和。
供试品检查时，若使用了中和剂或灭活剂，应确认有效性及对微生物无毒性。
供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。
培养基适用性检查和控制菌检查方法适用性试验供试品控制菌检查中所使用的培养基应进行适用性检查。
供试品的控制菌检查方法应进行方法适用性试验，以确认所釆用的方法适合于该产品的控制菌检查。
若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，控制菌检查方法应重新进行适用性试验。
菌种及菌液制备菌种试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）〔CMCC（B）26 003〕铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）〔CMCC（B）10 104〕大肠埃希菌（Escherichia coli）〔CMCC（B）44 102〕乙型副伤寒沙门菌（Salmonella paratyphi B）〔CMCC（B）50 094〕白色念珠菌（Candida albicans）〔CMCC（B）98 001〕生孢梭菌（Clostridium sporogenes）〔CMCC（B）64 941〕菌液制备将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、沙门菌分别接种于胰酪大豆胨液体培养基中或胰酪大豆胨琼脂培养基上，30～35℃培养18～24小时；将白色念珠菌接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上或沙氏葡萄糖液体培养基中，20～25℃培养2～3天；将生孢梭菌接种于梭菌增菌培养基中置厌氧条件下30～35℃培养24～48小时或接种于硫乙醇酸盐流体培养基中30～35℃培养18～24小时。
纯化水控制菌检查方法验证方案及验证报告
纯化水控制菌检查方法验证方案及报告文件编号：**VP*****-* 文件类别：验证***********公司验证方案批准验证小组人员名单目录1、引言 (5)2、验证参与部门及责任 (5)3、验证方法 (5)文件要求 (6)菌种 (6)菌液制备 (6)验证方法 (6)验证结果 (7)4、结果判断 (7)5、验证结论及评价 (8)6、验证报告批准书 (9)1.引言1.1概述微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及原料、辅料受微生物污染程度的方法。
检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。
当建立药品的微生物限度检查法时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证和控制菌检查方法的验证。
进行上述验证前，应首先对验证过程中使用的仪器、仪表及微生物限度检查的环境进行验证。
微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域进行。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。
除另有规定外，细菌培养温度为30-35℃；霉菌、酵母菌培养温度为23-28℃；控制菌培养温度为35-37℃。
1.2验证目的确认所采用的方法适合于纯化水的控制菌检查。
1.3验证执行的文件超净工作台标准操作规程微生物限度检查法培养箱标准操作规程热压灭菌锅标准操作规程2. 验证参与部门及责任3.验证方法：3.1文件要求所需文件检查人：日期：3．2菌种验证试验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。
确认人：日期：3．3菌液制备3．3．1分别取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物少许，各接种至5ml营养肉汤培养基中，在36℃±1℃培养18-24小时，取均匀培养物1ml用0.9%无菌氯化钠溶液按10倍递增稀释至1:107,制成每1ml含菌数为10~100cfu的菌悬液。
其菌数在做验证试验的同时用营养琼脂平板涂布，经培养后计数确定。
4 非无菌产品微生物检查：控制菌检查法
大肠埃希菌
麦康凯肉汤 麦康凯琼脂
大肠埃希菌
麦康凯肉汤
麦康凯琼脂
促生长能力 大肠埃希菌 抑制能力 金黄色葡萄球菌 促生长能力+指示 大肠埃希菌
培养基适用性检查
沙门菌 RV沙门菌增菌肉汤 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂 三糖铁琼脂培养基 铜绿假单胞菌 溴化十六烷基三甲铵琼脂 促生长能力 抑制能力 促生长能力 +指示特性 指示能力 促生长能力 抑制能力 促生长能力 +指示特性 抑制能力 促生长能 促生长能力 生孢梭菌 乙型副伤寒沙门菌 金黄色葡萄球菌 乙型副伤寒沙门菌 乙型副伤寒沙门菌 铜绿假单胞菌 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 生孢梭菌
培养基适用性试验
培养基是绝大多数微生物试验的基础其质量是微生物试验成功关键因素。 适宜的培养基制备方法、贮藏条件和质量控制试验是提供优质培养基的保 证。
培养基适用性试验
培养基的配制 可按处方制备也可使用按处方生产的符合规定的商品化成品培养基，脱水培 养基除附有处方和使用说明外还应注明有效期、贮存条件、适用性试验的质 控菌株和用途。配制时应按使用说明上的要求操作，受潮结块不能使用，确 保培养基的质量符合要求。
划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上，置 30～35℃，培养18～24小时。 平板上无菌落生长，判供试品未检出耐胆盐革兰阴性
耐胆盐革兰阴性菌检查 定量试验 1、取定量供试品的预培养物或其稀释液分别接种至肠道菌 增菌肉汤中。 30～35℃，培养24～48小时。 2、上述每一培养物分别划线接种于紫红胆盐葡萄 糖琼脂平板上。 30～35℃，培养18～24小时。 若紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上有菌落生长，则对应培养管为阳性，否则为阴 性。根据各培养管检查结果，从表2查对1g或1ml供试品中含有耐胆盐革兰阴 性菌的最大可能数。
控制菌检查用培养基适用性验证方案
控制菌检查用培养基适用性验证方案1．试验目的控制菌检查用培养基应进行培养基的适用性检查。
本次验证的目的是为了确认麦康凯液体培养基、麦康凯琼脂培养基、RV沙门菌增菌液体培养基、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基、三糖铁琼脂培养基适合大肠埃希菌、沙门菌的控制菌检查。
2. 试验方法照中国药典2015版四部非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法（通则1106）进行试验。
3.试验材料3.1 培养基3.2 菌种3.3 仪器XXXXX水平流净化工作台/生物安全柜、XXXXX立式压力蒸汽灭菌器、XXXXX电热恒温培养箱(30～35℃)、XXXXX生化培养箱（20～25℃）、XXXXX气浴恒温振荡器3.4 稀释剂0.9%无菌氯化钠溶液4.试验过程4.1菌液制备用0.9%无菌氯化钠溶液制成每0.1ml含菌数为不大于100cfu的菌悬液，菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2〜8℃，可在24小时内使用。
4.2 适用性检查4.2.1 麦康凯液体培养基适用性检查取大肠埃希菌菌悬液各0.1 ml分别接种于被检培养基和对照培养基中，在35℃条件下培养24h，进行促生长能力检查。
取金黄色葡萄球菌菌悬液各0.1 ml接种于被检培养基和对照培养基中，在35℃条件下培养24h，进行抑制能力检查4.2.2 麦康凯琼脂培养基适用性检查取大肠埃希菌菌悬液各0.1 ml分别涂布被检培养基和对照培养基平板上，在35℃条件下培养24h，进行促生长能力和指示特性检查4.2.3 RV沙门菌增菌液体培养基适用性检查取乙副伤寒沙门氏菌菌悬液各0.1 ml接种于被检培养基和对照培养基中，35℃条件下培养24h，进行促生长能力检查。
取金黄色葡萄球菌菌悬液各0.1 ml接种于被检培养基和对照培养基中，35℃条件下培养24h，进行抑制能力检查。
4.2.4 木糖赖氨基酸脱氧胆酸盐琼脂培养基适用性检查取乙副伤寒沙门氏菌菌悬液各0.1 ml分别涂布被检培养基和对照培养基平板上，在35℃条件下培养24h，，进行促生长能力和指示特性检查。
非无菌产品微生物限度检查中控制菌检查原理
非无菌药品微生物限度检查中控制菌检查及原理一、大肠埃希菌1.菌体特性大肠埃希菌属于肠杆菌科埃希菌属，菌体细胞两端钝圆，为革兰染色阴性无芽孢杆菌，细胞大小为1.1～1.5×2～6.0 µm。
周身鞭毛、运动或不运动。
能形成荚膜和微荚膜。
最适生长温度37℃，可在15～46℃生长。
最适pH为7.4～7.6。
在营养肉汤培养基中，37℃培养24小时后，形成菌膜，管底粘液状沉淀，培养物有粪臭味。
在伊红美兰琼脂（EMB）平板上，典型的菌落呈紫黑色，有金属光泽，菌落扁平，低度凸起，光滑湿润。
也有呈粉红色、无金属光泽、中心紫色的菌落。
在麦康凯琼脂（MaCC）平板上，菌落扁平、圆形、光滑湿润。
呈桃红色、微红色或菌落中心桃红色。
2. 生化实验原理（1）MUG试验97％的大肠埃希菌含有β—葡萄糖醛苷酶，可分解4—甲基伞形酮β－D－葡萄糖苷酸，生成的4—甲基伞形酮在366nm紫外灯下产生蓝白色荧光。
（2）靛基质试验（I实验)有些细菌具有色氨酸酶，在蛋白胨水培养基中生长时，能分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛基质（吲哚）。
靛基质无色，不能直接观察，加入靛基质试液（对二甲氨基苯甲醛试液），产成红色的玫瑰靛基质。
色氨酸酶活性的最适pH为7.4～7.8。
pH降低，靛基质产生减少，可能出现假阴性或弱阳性反应，故培养基pH应为7.4～7.6 。
因产生靛基质的细菌都能发酵糖类而产酸，增加培养基的酸度，不宜用含葡萄糖的培养基进行此试验。
（3）甲基红试验（M）肠杆菌科细菌均可发酵葡萄糖产生酸性代谢产物，使培养基pH值下降，最初可使甲基红指示液［变色域pH4.5－5.4（红→黄）］变色而呈现阳性反应。
但继续培养后，产气杆菌能将两分子的丙酮酸脱羧生成一分子的中性乙酰甲基甲醇而使培养基pH值上升至5.4以上，使甲基红指示液变为桔黄色（甲基红试验阴性）。
而大肠埃希菌则继续产生大量的酸，如甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸等，保持高氢离子浓度，故甲基红试验为阳性反应。
非无菌产品微生物检查：控制菌检查法
非无菌产品微生物检查：控制菌检查法控制菌检查法系用于在规定的试验条件下，检查供试品中是否存在特定的微生物。
当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料是否符合相应的微生物标准时，应按下列规定进行检验，包括样品取样量和结果判断等。
本检查法可采用替代的微生物检查法，包括自动检测方法，但必须证明替代方法等效于药典规定的检查方法。
供试液制备及实验环境要求同《非无菌产品微生物检查：微生物计数法》。
如果供试品具有抗菌活性，应尽可能去除或中和。
供试品检查时, 若使用了中和剂或灭活剂，应确认有效性及对微生物的无毒性。
供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用的中和剂或灭活剂的相容性。
培养基适用性检查和方法适用性试验供试品控制菌检查中所使用的培养基应进行适用性检查。
供试品的控制菌检查方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的控制菌检查。
若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，控制菌检查方法应重新进行适用性试验。
菌种及菌液制备菌种试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)〔CMCC（B）26 003〕铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)〔CMCC（B）10 104〕大肠埃希菌(Escherichia coli)〔CMCC（B）44 102〕乙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi B)〔CMCC（B）50 094〕白色念珠菌(Candida albicans)〔CMCC（F）98 001〕生孢梭菌（Clostridium sporogenes）〔CMCC（B）64 941〕菌液制备将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、沙门菌分别接种于胰酪大豆胨肉汤培养基中或在胰酪大豆胨琼脂培养基上，30～35℃培养18～24小时；将白色念珠菌接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上或沙氏葡萄糖肉汤培养基中，20～25℃培养2～3天；将生孢梭菌接种于梭菌增菌培养基中置厌氧条件下30～35℃培养24～48小时。
控制菌检查方法验证
控制菌检查方法验证方案控制菌检查方法验证方案目录1. 概述2. 目的3. 范围4. 职责5. 控制菌检查方法验证1概述我公司生产主要品种为药用碳酸钙，微生物主要控制项目为细菌总数、大肠挨希菌及霉菌，在建立微生物测试方法时，应进行控制菌检查方法的验证。
药用碳酸钙微生物限度检查中控制菌为大肠挨希菌，在验证时选择大肠埃希菌作为相应的验证菌株，阴性对照菌选择金黄色葡萄球菌。
，。
2. 目的：制定控制菌检查方法验证方案，以文件化的证据确认：采用的方法适合于该药品的控制菌检查。
3．范围本方案适用于药用碳酸钙控制菌检查方法的验证。
4．职责为了控制菌检查验证方法的有效执行，相关部门和人员职责分工见表1。
表1 职责分工5. 控制菌检查方法验证5.1 资料确认表2 资料确认5.2 仪器确认表3 仪器确认5.3 菌种确认表45.4 培养基的配置与灭菌表5-1表5-2表5-35.5 菌液制备接种大肠挨希菌、金黄色葡萄球菌新鲜培养物至营养肉汤培养基中。
用0.9%的无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌10~100cfu的菌悬液。
5.6 程序5.6.1 麦康凯琼脂培养基阳性对照试验5.6.1.1 将两种菌悬液各吸取1ml混合涂布于麦康凯琼脂培养基上，于35-37℃培养18～24小时。
5.6.1.2 结果记录表6-1试验人：日期：复核人：日期：表6-2试验人：日期：复核人：日期：表6-3试验人：日期：复核人：日期：5.6.1.3 培养结束后需观察到相应微生物的生长，对选择性培养基平板，菌落应表现出独有的明显的形态特征。
5.6.2 麦康凯琼脂培养基阴性菌对照试验5.6.2.1 将8.2.3中的增殖后未经稀释的金黄色葡萄球菌培养物划至麦康凯琼脂培养基上，于35-37℃培养18～24小时。
5.6.2.2 结果记录表7-1试验人：日期：复核人：日期：表7-2试验人：日期：复核人：日期：表7-3试验人：日期：复核人：日期：5.6.2.3 培养结束后应无生长或无对应阳性菌种的形态特征。
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控制菌检查方法验证方案
控制菌检查方法验证方案
目录
1. 概述
2. 目的
3. 范围
4. 职责
5. 控制菌检查方法验证
1概述
我公司生产主要品种为药用碳酸钙，微生物主要控制项目为细菌总数、大肠挨
希菌及霉菌，在建立微生物测试方法时，应进行控制菌检查方法的验证。
药用碳酸钙微生物限度检查中控制菌为大肠挨希菌，在验证时选择大肠埃希菌作为相应的验证菌株，阴性对照菌选择金黄色葡萄球菌。
，。
2. 目的：
制定控制菌检查方法验证方案，以文件化的证据确认：
采用的方法适合于该药品的控制菌检查。
3．范围
本方案适用于药用碳酸钙控制菌检查方法的验证。
4．职责
为了控制菌检查验证方法的有效执行，相关部门和人员职责分工见表1。
表1 职责分工
5. 控制菌检查方法验证
5.1 资料确认
表2 资料确认
5.2 仪器确认
表3 仪器确认
5.3 菌种确认
表4
5.4 培养基的配置与灭菌
表5-1
5-2
表
表
接种大肠挨希菌、金黄色葡萄球菌新鲜培养物至营养肉汤培养基中。
用0.9%的无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌10~100cfu的菌悬液。
5.6 程序
5.6.1 麦康凯琼脂培养基阳性对照试验
5.6.1.1 将两种菌悬液各吸取1ml混合涂布于麦康凯琼脂培养基上，于35-37℃培养18～
24小时。
5.6.1.2 结果记录
表6-1
试验人：日期：
复核人：日期：
表6-2
试验人：日期：
复核人：日期：
表6-3
试验人：日期：
复核人：日期：
5.6.1.3 培养结束后需观察到相应微生物的生长，对选择性培养基平板，菌落应表现出独
有的明显的形态特征。
5.6.2 麦康凯琼脂培养基阴性菌对照试验
5.6.2.1 将8.2.3中的增殖后未经稀释的金黄色葡萄球菌培养物划至麦康凯琼脂培养基
上，于35-37℃培养18～24小时。
5.6.2.2 结果记录
表7-1
试验人：日期：
复核人：日期：
表7-2
试验人：日期：
复核人：日期：
表7-3
试验人：日期：
复核人：日期：
5.6.2.3 培养结束后应无生长或无对应阳性菌种的形态特征。
5.6.3 麦康凯琼脂培养基阴性对照试验
5.6.3.1 吸取10ml0.9%的无菌氯化钠溶液至麦康凯琼脂培养基上，于30-35℃培养24小时。
5.6.3.2 结果记录
表8
试验人：日期：
复核人：日期：
5.6.3.3 培养结束后应无菌生长。