酶活性测定的主要影响因素及控制要点PPT课件
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酶活性测定的主要影响因素及控制
2.4 正向反应与逆向反应
LDH测定的选择目前尚有争议。 国内多采用正向反应（L→P），与IFCC在 2001年发表的操作手册一致。
正向反应有利于LD1的活性表达，同时试剂成本低 廉，稳定性好。
L 乳酸 NAD LD 丙酮酸 NADH H
国外常用方法曾是逆向反应（P→L），
EDTA、草酸盐和柠檬酸盐等抗凝剂，它们为金属 离子螯合剂； 在去除Ca2+同时也去除其中Mg2+、Mn2+等离子， Ca2+是AMY的激活剂，Mg2+是ALP、CK和5′-核苷 酸酶（5′-NA）的激活剂。
1.2 肝素
是一种粘多糖， 是对酶活性影响最小的抗凝剂， 对ALT、AST、CK、LD和ACP无影响， 适于急诊时迅速分离血浆进行测定。
酶的概念
酶活性浓度测定的主要影响因 素
1.
标本及标本采集和处理因素 2. 试剂及方法学因素 3. 仪器因素的影响 4. 测定条件与参数设置
1.标本及标本采集和处理因素 的影响及控制
1.标本及采集和处理的影响因素
1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7
溶血 抗凝剂 温度 空气与光线 标本副反应 酶蛋白浓度 其他
1.1 溶血
最重要的影响是RBC内酶的大量释出。
大部分酶在细胞内外浓度差异明显，且其活性 远高于血清； 如RBC内的LD、AST和ALT活性分别较血清中高 100、15和7倍左右。
RBC释放的Hb在300～500nm可见光波段能 使吸光度值明显升高，干扰分光光度计的 测定。
【资料】酶活性测定的主要影响因素及控制要点汇编
1.5 副反应
副反应是指酶促反应体系中，除待测酶反应 外，其他非待测酶和物质引起的干扰待测酶 测定的反应。
NAD（P）H是目前使用最多的指示反应物质。
体内存在数以百计的氧化还原酶，它们的辅酶 很多是一致的。
若存在内源性代谢物，必然会相互干扰。
1.5 副反应(酶偶联法测ALT)
由于反应体系中含有大量NADH和LD，可与血 液标本中所含丙酮酸反应，引起340nm波长处 吸光度下降，从而引起ALT活性测定误差。
费时间是最经济的方法。
1.6 酶蛋白浓度
酶蛋白在低浓度时易失活，可能是亚基易 解离、易吸附于容器上和易发生表面变性 之故。
酶蛋白在高浓度时较稳定，但活性过高超 过检测仪器的线性范围时，需将样品进行 稀释或减少样品用量后再行测定。
样品稀释后所测得的活性常偏高，可能与 抑制剂被稀释有关。
1.7 其他
室温（25℃） 1周 2d 2d 2d 3d 1周 1周 2～3d 4h※ 24h 1月 1周
冷藏（0～4℃） 冰冻（-25℃）
1～3d§
1～3d§
1周
1月
2d
不稳定*
5d
不稳定*
1周
1月
1周
1月
1周
1周
2～3d
1月
3d#
3d#
1周
3月
7月
2月
3周
3周
*酶不耐融化；§与同工酶类型有关；※标本未酸化；#标本加枸橼酸或醋酸至pH 5
2. 试剂及方法学的影响因素
酶的测定大多使用商品试剂盒
不同厂家酶试剂盒的测定原理、试剂配方（包 括缓冲液、底物、添加剂等）、产品质量、技 术含量等常有区别。
常见的影响因素
2.1 定时法与连续监测法 2.2 检测底物或检测产物 2.3 底物启动模式与样品启动模式 2.4 正向反应与逆向反应 2.5 试剂的干扰作用
酶活性测定的主要影响因素及控制PPT文档60页
▪
29、勇猛、大胆和坚定的决心能够抵得上武器的精良。——达·芬奇
▪
30、意志是一个强壮的盲人，倚靠要影响因素及控制
11、获得的成功越大，就越令人高兴 。野心 是使人 勤奋的 原因， 节制使 人枯萎 。 12、不问收获，只问耕耘。如同种树 ，先有 根茎， 再有枝 叶，尔 后花实 ，好好 劳动， 不要想 太多， 那样只 会使人 胆孝懒 惰，因 为不实 践，甚 至不接 触社会 ，难道 你是野 人。(名 言网) 13、不怕，不悔(虽然只有四个字，但 常看常 新。 14、我在心里默默地为每一个人祝福 。我爱 自己， 我用清 洁与节 制来珍 惜我的 身体， 我用智 慧和知 识充实 我的头 脑。 15、这世上的一切都借希望而完成。 农夫不 会播下 一粒玉 米，如 果他不 曾希望 它长成 种籽； 单身汉 不会娶 妻，如 果他不 曾希望 有小孩 ；商人 或手艺 人不会 工作， 如果他 不曾希 望因此 而有收 益。-- 马钉路 德。
▪
26、要使整个人生都过得舒适、愉快，这是不可能的，因为人类必须具备一种能应付逆境的态度。——卢梭
▪
27、只有把抱怨环境的心情，化为上进的力量，才是成功的保证。——罗曼·罗兰
▪
28、知之者不如好之者，好之者不如乐之者。——孔子
酶活性的影响因素
实验记录
项目 底物 （/ml） 加入的 纳氏试剂 实验现象 pH和蒸 （/ml） 馏水 （/ml）
试管1 试管2 试管3 试管4
2、酶的活性受底物的特异性的影响 、
• 步骤 • 1、向四支10ml试管，分别标号1，2，3，4 • 2、向四支试管中分别加入3ml的蒸馏水， 1%淀粉液，1%蔗糖液， 0.1%尿素液 • 3、向四支试管中加入等量的大豆尿素酶溶 液五滴，轻摇后静置3分钟 • 4、向四支试管中加入等量的纳氏试剂2ml， 摇匀。 • 5、观察并记录实验现象
实验材料：
器材： 控温水浴锅（每个实验室3个），制冰机， 电磁灶，不锈钢锅，白瓷板，试管、滴管、 移液管（1-2ml） 试剂： 蒸馏水，1%淀粉液，1%蔗糖液，0.1%尿素液， 大豆尿素酶溶液，0.1%CuSO4，0.1%HgCl2， 0.1%NaCl，1M NaOH，0.5M H2SO4，纳氏 试剂，班氏试剂，各种pH缓冲液：5.0；6.8； 8.0
实验原理：
• 尿素在酸、碱、酶作用下（酸、碱需加热）能水解成氨和 二氧化碳 • 新鲜大豆中含有较高活性的尿素酶，可以水解尿素生成 NH3 • CO(NH2)2 + H2O ------ 2NH3 + CO2 • 尿素养在尿素酶作用下，在中性或酸性环境下生成碳酸胺， 在NaOH环境下生成Na2CO3和NH3、NH3与纳氏试剂作 用，生成棕黄色碘化双汞胺 尿素酶 NaOH • CO(NH2)2 + H2O ------------ ( NH4 )2CO3 -----------NH3 • NH3 + 纳氏试剂(HgI2.2KI) -----------NH2.Hg2I3 (棕 黄色)
酶活性的影、紫外线、重金属盐、抑制剂、激活剂 等通过影响酶的活性来影响酶促反应的速率；酶 的浓度、底物的浓度等不会影响酶活性，但可以 影响酶促反应的速率。 • 纳氏试剂（Nessler）是指一种利用红外－可见分 Nessler 光光度法原理用于测定空气中、水体中氨氮含量 的试剂。 • 碘离子和汞离子在强碱性条件下，会与氨反应生 成红棕色胶态化合物，此颜色在波长420nm左右 会有强烈的吸收。而生成的这类红棕色胶态化合 物的量会与其溶液的吸收值成正比，可用测试反 应液的吸收值而测定氨氮的含量。
酶活性的测定
例: 反应时间短，最适温度高。 反应时间长，最适温度低。
低温酶学
五、pH 对酶反应的影响
最适pH时的酶 最适 时的酶 活力最大
•最适 因酶而异， 最适pH因酶而异 最适 因酶而异， 多数酶在7.0左右 多数酶在 左右 •是酶的特性之一 是酶的特性之一
连续监测法所需仪器
仪器 722s型分光光度计、电子分析天平、 高速冷冻离心机、微量移液器等
过氧化物酶活力的测定
操作步骤
一、酶液提取
分别精确 分别精确称取不同部位的植物样品0.2g左右，加入预冷的酶提取缓冲液约 精确 5ml，于研钵中研磨成匀浆（冰浴）,匀浆转入2支离心管，用少量(约1ml)缓 冲液冲洗研钵一并转入,托盘天平平衡后于8000转/分钟离心15分钟（低温）。 将上清液倒入刻度试管，定容至10ml，插入冰浴待测。
酶活性单位(U 酶活性单位 )
按照国际酶学会议 的规定，1个酶活 力单位是指在25℃ 、测量的最适条件 （指最适pH、温 度等）下，1分钟 内能引起1微摩尔 底物转化的酶量。
术语酶活力指的是 溶液或组织提取液 中总的酶单位数。
在酶的纯化过程中 常用到另一个术语 （specific activity） ）
比活
是指每毫克蛋白含有的酶单位数。 是指每毫克蛋白含有的酶单位数。随着 毫克蛋白含有的酶单位数 酶纯化的进行，比活会越来越高， 酶纯化的进行，比活会越来越高，当酶 已被纯化至纯酶时，比活是个恒定值。 已被纯化至纯酶时，比活是个恒定值。 所以比活是酶纯化程度的指标 指标。 所以比活是酶纯化程度的指标。
双分子反应、 双分子反应、一级反应
酶促反应的动力学方程式
1、米氏方程 、
1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底 年 和 提出反应速度与底 物浓度关系的数学方程式，即米－ 物浓度关系的数学方程式 ，即米 － 曼氏方程 简称米氏方程(Michaelis equation)。 式，简称米氏方程 。
低温酶学
五、pH 对酶反应的影响
最适pH时的酶 最适 时的酶 活力最大
•最适 因酶而异， 最适pH因酶而异 最适 因酶而异， 多数酶在7.0左右 多数酶在 左右 •是酶的特性之一 是酶的特性之一
连续监测法所需仪器
仪器 722s型分光光度计、电子分析天平、 高速冷冻离心机、微量移液器等
过氧化物酶活力的测定
操作步骤
一、酶液提取
分别精确 分别精确称取不同部位的植物样品0.2g左右，加入预冷的酶提取缓冲液约 精确 5ml，于研钵中研磨成匀浆（冰浴）,匀浆转入2支离心管，用少量(约1ml)缓 冲液冲洗研钵一并转入,托盘天平平衡后于8000转/分钟离心15分钟（低温）。 将上清液倒入刻度试管，定容至10ml，插入冰浴待测。
酶活性单位(U 酶活性单位 )
按照国际酶学会议 的规定，1个酶活 力单位是指在25℃ 、测量的最适条件 （指最适pH、温 度等）下，1分钟 内能引起1微摩尔 底物转化的酶量。
术语酶活力指的是 溶液或组织提取液 中总的酶单位数。
在酶的纯化过程中 常用到另一个术语 （specific activity） ）
比活
是指每毫克蛋白含有的酶单位数。 是指每毫克蛋白含有的酶单位数。随着 毫克蛋白含有的酶单位数 酶纯化的进行，比活会越来越高， 酶纯化的进行，比活会越来越高，当酶 已被纯化至纯酶时，比活是个恒定值。 已被纯化至纯酶时，比活是个恒定值。 所以比活是酶纯化程度的指标 指标。 所以比活是酶纯化程度的指标。
双分子反应、 双分子反应、一级反应
酶促反应的动力学方程式
1、米氏方程 、
1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底 年 和 提出反应速度与底 物浓度关系的数学方程式，即米－ 物浓度关系的数学方程式 ，即米 － 曼氏方程 简称米氏方程(Michaelis equation)。 式，简称米氏方程 。
酶活性的测定PPT课件
（1）样品对照：只加样品不加底物 （2）底物对照：不加样品只加底物 （3）时间对照：含有酶和底物但反应时间为零的对
照管；也可以先用蛋白沉淀剂或其他试剂停止反 应后，再加底物予以抵销。
11
酶的区域化分布
表7-3 诊断常用血清酶的来源
血清酶
符号
鸟氨酸氨基甲酰转移酶
OCT
卵磷脂胆固醇酰基转移酶 LCAT
谷氨酸脱氢酶
GLDHΒιβλιοθήκη 山梨醇脱氢酶SDH
丙氨酸氨基转移酶
ALT
异柠檬酸脱氢酶
ICD
-谷氨酰转肽酶
-GT
5ˊ-核苷酸酶
5ˊ-NT
单胺氧化酶
MAO
天门冬氨酸氨基转移酶
AST
肌酸激酶
CK
乳酸脱氢酶
LDH
碱性磷酸酶
ALP
酸性磷酸酶
ACP
淀粉酶
AMS
脂肪酶
LPS
来源
肝 肝 肝 肝 肝、肾、心 肝、胎盘、心 肝、胆、肾、小肠 肝、胆道 肝、肾、脑 心、肝、骨骼肌 骨骼肌、心、脑 心、肾、骨骼肌、肝、肺 小肠、胎盘、肝、肾 前列腺、红细胞、血小板 胰、唾液腺
5
6
米-曼氏方程：
Vmax〔S〕 v = —————
〔S〕+ Km
上式中v代表反应速度，Vmax代表最大反应速度， 〔S〕代表底物浓度，Km称为米氏常数。
7
由米-曼氏方程可以导出：
（Vmax-v）〔S〕 Km = ———————
v
当v = 1/2Vmax时，Km =〔S〕。因此Km值为反应速度相当于 最大反应速度一半时的底物浓度。Km值是酶的特征常数，具有重 要的应用价值。
应加入不抑制该酶活性的防腐剂并冰箱保存，以 防止底物被分解或变质 • 4、在测定过程中所用器材应绝对清洁，不应含有 酶的抑制物 • 5、使酶活性测定在线性期内进行
照管；也可以先用蛋白沉淀剂或其他试剂停止反 应后，再加底物予以抵销。
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酶的区域化分布
表7-3 诊断常用血清酶的来源
血清酶
符号
鸟氨酸氨基甲酰转移酶
OCT
卵磷脂胆固醇酰基转移酶 LCAT
谷氨酸脱氢酶
GLDHΒιβλιοθήκη 山梨醇脱氢酶SDH
丙氨酸氨基转移酶
ALT
异柠檬酸脱氢酶
ICD
-谷氨酰转肽酶
-GT
5ˊ-核苷酸酶
5ˊ-NT
单胺氧化酶
MAO
天门冬氨酸氨基转移酶
AST
肌酸激酶
CK
乳酸脱氢酶
LDH
碱性磷酸酶
ALP
酸性磷酸酶
ACP
淀粉酶
AMS
脂肪酶
LPS
来源
肝 肝 肝 肝 肝、肾、心 肝、胎盘、心 肝、胆、肾、小肠 肝、胆道 肝、肾、脑 心、肝、骨骼肌 骨骼肌、心、脑 心、肾、骨骼肌、肝、肺 小肠、胎盘、肝、肾 前列腺、红细胞、血小板 胰、唾液腺
5
6
米-曼氏方程：
Vmax〔S〕 v = —————
〔S〕+ Km
上式中v代表反应速度，Vmax代表最大反应速度， 〔S〕代表底物浓度，Km称为米氏常数。
7
由米-曼氏方程可以导出：
（Vmax-v）〔S〕 Km = ———————
v
当v = 1/2Vmax时，Km =〔S〕。因此Km值为反应速度相当于 最大反应速度一半时的底物浓度。Km值是酶的特征常数，具有重 要的应用价值。
应加入不抑制该酶活性的防腐剂并冰箱保存，以 防止底物被分解或变质 • 4、在测定过程中所用器材应绝对清洁，不应含有 酶的抑制物 • 5、使酶活性测定在线性期内进行
影响酶活性的因素实验
思考：测定人体内某些酶的活性时，反应体系中温 度、pH值应如何设定，为什么？
通过实验了解温度、pH值对酶作用的影响。
1、酶的活性受到温度、pH值的影响 2、淀粉酶可催化淀粉逐步水解生成糊精，糊 精分子的大小不同，遇碘时呈现的颜色也不 同。 3、可根据颜色判断淀粉被水解的程度，从而 判断温度、pH值对酶活性的影响。
图中物质的背景颜色表示该物质遇碘时所呈现的颜色，无 底色表示为无色透明。
试管号
1
2
3
pH3.0缓冲溶液（d） pH6.8缓冲溶液（d） pH8.0缓冲溶液（d）
1%淀粉溶液（d） 稀唾液（d） 稀碘液（d） 观察颜色
20 10 5 1
20 10 5 1
20
10 5 1
混匀，37℃水浴10分钟
1、加入稀唾液后应充分混匀。 2、滴加稀碘液时注意不可摇晃试管。 3、碘液不能滴加太多。
试管号
1
2
3
pH6.8缓冲溶液（d） 1%淀粉溶液（d） 水浴
稀唾液（d） 水浴 稀碘液（d） 观察现象（颜色）
20 10 0℃水浴5分钟
10 37℃水浴5分钟
5 混匀后37℃水浴10 分钟 1
20 10 100℃水浴5分钟
5 混匀后100℃水浴10 分钟 1
1、1％淀粉溶液 2、稀碘液 3、pH3.0、pH6.8、pH8三种缓冲溶液 4、实验器材 试管，试管夹，冰浴，沸水浴，恒温水浴锅 (37℃),吸管，滴管，试管架，记号笔，120ml烧 杯一个（或一次性纸杯）
1、制备稀释唾液 漱口后含约20ml蒸馏水在口中做咀嚼动作，3 分钟后吐入120ml烧杯或纸杯中，备用。
实验六酶活性影响因素的测定-温度、pH对酶活性的影响-精品文档
以1分钟的间隔,依次向第1至第8号试管 中加入稀释100倍的唾液2毫升,摇匀,并以1 分钟的间隔依次将8支试管放入37℃恒温水 浴中保温.然后,按照第9 号试管的保温时间, 依次将各管迅速取出,并立即加入碘化钾-碘 溶液2滴,充分摇匀.观察各管呈现的颜色,判 断在不同pH值下淀粉被水解的程度,可以看 出PH对唾液淀粉酶活性的影响,并确定其最 适pH.
本实验分别以不同温度及不同pH条件下让淀粉 酶作用于淀粉，并用碘液检查酶促淀粉的水解程度， 来说明温度及pH对酶活力的影响。 实验中以稀释的唾液作为淀粉酶液。唾液内的 淀粉酶可将淀粉逐步水解成各种不同大小的糊精分 子，最终产物为麦芽糖ห้องสมุดไป่ตู้少量的葡萄糖。它们遇碘 呈不同的颜色。直链淀粉（即可溶性淀粉）遇碘呈 蓝色；糊精按分子从大到小的顺序，遇碘可呈蓝色、 紫色、暗褐色和红色，最小的糊精和麦芽糖遇碘不 显颜色。由于在不同温度，不同pH条件下唾液淀粉 酶的活性高低不同，则淀粉被水解的程度不同，所 以，可由酶反应混合物遇碘所呈现的颜色来判断上 述诸因素对酶活性的影响。
操作步骤
1.稀释的新鲜唾液：
取唾液适量，量取 倍。 一定体积，用蒸馏水稀释20
2. 温度对酶活力的影响
取3支试管，编号后各加入淀粉溶液2毫升。将第 1，2号试管放入37℃恒温水浴中保温，第3号试管放 入冰水中冷却，5分钟后，向第1号试管中加入煮沸5 －15分钟的稀释唾液1毫升，向第2，3号试管加稀释 唾液各1毫升。摇匀，20分钟后取出3支试管，各加 碘化钾－碘溶液2滴，混匀，比较各管溶液的颜色。 判断淀粉被唾液酶水解的程度，并说明温度对唾液 酶活性的影响。
思考题：将乳清蛋白、淀粉、胃蛋白酶、唾液淀粉酶和适量 水混合装入一个容器内，调整pH至2.0 ，保存于37℃的水溶 锅中，过一段时间后，容器内剩余的物质是什么？为什么？
《影响酶活性的因素》PPT课件ppt课件
2ml
5min 1滴 试管1变蓝 试管2不变蓝 试管3变蓝
今天你学到了什么？ 1、温度和PH对酶的活性 有影响。温度过高或过 低,PH过酸或过碱，酶的 活性都会降低。 2、从低温到高温，酶可 复性，而高温使酶失活。
思考题
B
A
C
1.比较温度、PH对酶活性影响钟罩图的 不同点 2.除温度外还有哪些影响酶活性的因素
后面内容直接删除就行 资料可以编辑修改使用 资料可以编辑修改使用
资料仅供参考，实际情况实际分析
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酶的催化效率一般是无机催化剂的101013酶的专一性建立在酶结构的专一性上质量分数为3的淀粉溶液质量分数为5的盐酸质量分数为5的naoh溶液碘液蒸馏水烧杯试管及试管夹量筒滴管步骤顺序试管1试管1试管2试管2试管3试管33淀粉液2ml2ml温度预处理100反应混合摇匀恒温时间5分钟加碘37步骤顺序试管1试管2试管3唾液2ml调节ph5hcl2ml蒸馏水2ml5naoh2ml3淀粉液2ml反应5min预期实验现象试管1变蓝试管2不变蓝试管3变蓝ph对酶活性的影响今天你学到了什么
蛋白酶活性的测定方法及原理_图文
L-酪氨酸标准溶液按下表配制
试管0
100μg/mml ）
10
酪氨酸实际
浓度
O
（μg/ml ）
试管1 1 9 10
试管2 2 8 20
试管3 3 7 30
试管4 4 6 40
试管5 5 5 50
分别取上述溶液各1.00ml(须做平行试验)，各加入0.4mol/L碳酸钠溶液5.00ml。福林试剂使 用溶液1.00ml,置于40+0.2℃水浴中显色20min,取出用分光光度计于波长680nm,比色，以不 含酪氨酸的0管为空白管调零点，分别测定其吸光度值，以吸光度值为纵坐标，酪氨酸的浓度为 横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。计算出当OD为1时的酪氨酸的量（μg），即为吸光常 数K值，其K值应在95~100范围内。
蛋白酶活性的测定方法及原理_图文.pptx
考马斯亮蓝法 甲醛滴定法
DHT-酪蛋白法 DNA-溴乙锭荧光分析法
X-光胶片法 福林酚法
考甲马醛斯滴亮定蓝法法
考甲马醛斯滴亮定蓝法法
D考H马T-斯酪亮蛋蓝白法法
DNA-考溴马乙斯锭亮荧蓝光法分析法
考X马-光斯胶亮片蓝法法
考福马林斯酚亮法蓝法
重 本次实验就是采用福林酚 点 法测定蛋白酶活性
原理
福林酚法测定蛋白酶活性
仪器
• 分析天平：精度0.0001g • 恒温水浴：精度±0.2℃ • 计时表 • 分光光度计 • 沸水浴器 • 振荡混合器 • pH计: 精度0.01pH单位
试剂
• 乳酸缓冲液（pH=3.0）适用于酸性蛋白酶 • 磷酸缓冲液（pH=7.5）适用于中性蛋白酶 • 硼酸缓冲液 (pH=10.5) 适用于碱性蛋白酶 • 0.4mol/L碳酸钠溶液 • 0.4mol/L的三氯醋酸液 • 0.5mol/L的NaOH • 10.00mg/ml酪素溶液 • 100μg/ml酪氨酸标准溶液
《酶活性的影响因素》幻灯片
• 纳氏试剂〔Nessler〕是指一种利用红外－可见分 光光度法原理用于测定空气中、水体中氨氮含量 的试剂。
• 碘离子和汞离子在强碱性条件下，会与氨反响生 成红棕色胶态化合物，此颜色在波长420nm左右 会有强烈的吸收。而生成的这类红棕色胶态化合 物的量会与其溶液的吸收值成正比，可用测试反 响液的吸收值而测定氨氮的含量。
试剂： 蒸馏水，1%淀粉液，1%蔗糖液，0.1%尿素液， 大豆尿素酶溶液，0.1%CuSO4，0.1%HgCl2， 0.1%NaCl，1M NaOH，0.5M H2SO4，纳 氏试剂，班氏试剂，各种pH缓冲液：5.0；6.8； 8.0
酶活性的影响因素假设
• 1、酶的活性受pH的影响 • 2、酶的活性受底物特异性的影响 • 3、酶的活性受温度的影响 • 4、酶的活性受重金属离子的影响
《酶活性的影响因素》幻 灯片
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知识背景
• pH、温度、紫外线、重金属盐、抑制剂、激活 剂等通过影响酶的活性来影响酶促反响的速率； 酶的浓度、底物的浓度等不会影响酶活性，但可 以影响酶促反响的速率。
1、酶的活性受pH的影响
• 步骤 • 1、向四支10ml试管，分别标号1，2，3，4 • 2、将1%尿素液3ml分别倒入四支试管中 • 3、向前三支支试管中分别倒入1ml的pH为5.0，
6.8，8.0的缓冲液，四号试管参加1ml的蒸馏水 • 4、向四支试管中参加等量的大豆尿素酶溶液五滴，
轻摇后静置3分钟 • 5、向四支试管中参加等量的纳氏试剂 2ml，摇
实验原理：
• 尿素在酸、碱、酶作用下〔酸、碱需加热〕能水解成氨和 二氧化碳
• 新鲜大豆中含有较高活性的尿素酶，可以水解尿素生成 NH3
• 碘离子和汞离子在强碱性条件下，会与氨反响生 成红棕色胶态化合物，此颜色在波长420nm左右 会有强烈的吸收。而生成的这类红棕色胶态化合 物的量会与其溶液的吸收值成正比，可用测试反 响液的吸收值而测定氨氮的含量。
试剂： 蒸馏水，1%淀粉液，1%蔗糖液，0.1%尿素液， 大豆尿素酶溶液，0.1%CuSO4，0.1%HgCl2， 0.1%NaCl，1M NaOH，0.5M H2SO4，纳 氏试剂，班氏试剂，各种pH缓冲液：5.0；6.8； 8.0
酶活性的影响因素假设
• 1、酶的活性受pH的影响 • 2、酶的活性受底物特异性的影响 • 3、酶的活性受温度的影响 • 4、酶的活性受重金属离子的影响
《酶活性的影响因素》幻 灯片
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知识背景
• pH、温度、紫外线、重金属盐、抑制剂、激活 剂等通过影响酶的活性来影响酶促反响的速率； 酶的浓度、底物的浓度等不会影响酶活性，但可 以影响酶促反响的速率。
1、酶的活性受pH的影响
• 步骤 • 1、向四支10ml试管，分别标号1，2，3，4 • 2、将1%尿素液3ml分别倒入四支试管中 • 3、向前三支支试管中分别倒入1ml的pH为5.0，
6.8，8.0的缓冲液，四号试管参加1ml的蒸馏水 • 4、向四支试管中参加等量的大豆尿素酶溶液五滴，
轻摇后静置3分钟 • 5、向四支试管中参加等量的纳氏试剂 2ml，摇
实验原理：
• 尿素在酸、碱、酶作用下〔酸、碱需加热〕能水解成氨和 二氧化碳
• 新鲜大豆中含有较高活性的尿素酶，可以水解尿素生成 NH3
【实用】酶促反应的速率和影响因素PPT资料
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就整个生物界，植物和微生物 最适温度＝32度-60度
动物 最适温度＝35度-40度
少数酶特殊，如液化淀粉酶 的最适温度为90度
最适温度不是酶的特征常数，该值随着底物性质及浓度、介质的 离子强度、作用时间不同而不同。
意义：临床上，低温麻醉，减慢细胞的代谢速度，以利于治疗
低温保藏种子，降低酶的活性
酶促反应的速率和影响因素
酶作用的机制
1.酶催化作用的本质：降低反应活化能
在酶催化到反应中，第一步是酶与底物形成：酶——底物 中间复合物，当底物分子在酶的作用下发生化学变化后，中 间产物再分解成酶和目标产物
E-S复合物的形成的速率和酶与底物的性质有关。
底物浓度对酶促反应速率的影响——米氏方程
1931年，德国化学家Michaelist和Menten根据中间产物学说对酶 促反应的动力学进行研究，推导出了整个反应中的底物浓度和反 应速度关系著名公式，即米氏方程
Km——米氏常数
Vmax——最大反应速率
Leonor Michaelis (1875-1949) Maud Menten (1879-1960
3、当反应速率等于最大速率一半时，即V=0.5Vmax时。则
Km=【S】
米氏方程所规定动力学规律，是酶促反应的一项基本熟悉属性
米氏常数的求法，双倒数作图法
可以将米氏方程的形式加以改变，将方程两边同时取倒数，使方 程变成y=ax+b的直线方程
米氏常数K,m的意义
由米氏方程可知，当反应速度等于最大反应速度的一半时，即
V Vmax
[S] Ø当底物浓度较低时：
反应速率与底物浓度成正比；反应为一级反应。
V Vmax
[S] Ø当底物浓度高达一定程度：
就整个生物界，植物和微生物 最适温度＝32度-60度
动物 最适温度＝35度-40度
少数酶特殊，如液化淀粉酶 的最适温度为90度
最适温度不是酶的特征常数，该值随着底物性质及浓度、介质的 离子强度、作用时间不同而不同。
意义：临床上，低温麻醉，减慢细胞的代谢速度，以利于治疗
低温保藏种子，降低酶的活性
酶促反应的速率和影响因素
酶作用的机制
1.酶催化作用的本质：降低反应活化能
在酶催化到反应中，第一步是酶与底物形成：酶——底物 中间复合物，当底物分子在酶的作用下发生化学变化后，中 间产物再分解成酶和目标产物
E-S复合物的形成的速率和酶与底物的性质有关。
底物浓度对酶促反应速率的影响——米氏方程
1931年，德国化学家Michaelist和Menten根据中间产物学说对酶 促反应的动力学进行研究，推导出了整个反应中的底物浓度和反 应速度关系著名公式，即米氏方程
Km——米氏常数
Vmax——最大反应速率
Leonor Michaelis (1875-1949) Maud Menten (1879-1960
3、当反应速率等于最大速率一半时，即V=0.5Vmax时。则
Km=【S】
米氏方程所规定动力学规律，是酶促反应的一项基本熟悉属性
米氏常数的求法，双倒数作图法
可以将米氏方程的形式加以改变，将方程两边同时取倒数，使方 程变成y=ax+b的直线方程
米氏常数K,m的意义
由米氏方程可知，当反应速度等于最大反应速度的一半时，即
V Vmax
[S] Ø当底物浓度较低时：
反应速率与底物浓度成正比；反应为一级反应。
V Vmax
[S] Ø当底物浓度高达一定程度：
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选购试剂盒时
要仔细阅读试剂盒说明书；
了解试剂盒所用方法的原理、试剂配方等；
选择IFCC或中华医学会检验学会推荐的常规方 法，或选择公认的测定方法。
使用时
定期对试剂盒的质量进行监测；
准确性、重复性、稳定性好，线性范围宽；
正向型试剂空白吸光度低、反向型试剂空白吸 光度高、试剂空白速率低、瓶间差小等。
如RBC内的LD、AST和ALT活性分别较血清中高 100、15和7倍左右。
RBC释放的Hb在300～500nm可见光波段能 使吸光度值明显升高，干扰分光光度计的 测定。
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6
1.1 Hb的吸光度曲线
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7
1.1 溶血影响的控制
减少溶血
体外溶血可通过实施样品制备技术的标准化加 以克服；
分清体内溶血与体外溶血。
血清置于空气中时，
血中CO2丧失极快，pH可在15min内由 7.4增至8.0，从而使对碱性环境敏感 的ACP活性迅速下降。
某些酶易受光线破坏，
CK可因吸收蓝光而引起酶发生不可逆 地失活，其失活程度与暴光时间的长 短成正比。
.
15
1.5 副反应
副反应是指酶促反应体系中，除待测酶反应 外，其他非待测酶和物质引起的干扰待测酶 测定的反应。
ALT活性测定的反应式如下：
L 丙 2 氨 氧 酸 代 A 戊 L L T 谷 二 L 氨 丙 酸 酸
L 丙 N 酮 A H 酸 D L D H L 乳 N 酸 AD
.
17
1.5 副反应的控制
可通过加入副反应抑制剂， 或对样品进行预处理等方法给予排除。 双试剂底物启动模式因不增加成本、不耗
.
12
1.3 贮存不同室温体液酶的稳定性 （活性变化小于10%）
*酶不耐融化；§与同工酶类型有关；.※标本未酸化；#标本加枸橼酸或醋酸至pH 513
1.3 温度影响的控制
及时检测 低温贮存
大部分酶在低温中比较稳定，因此当天不能测 定时，应在血清分离后置冰箱中冷藏。
.
14
1.4 空气与光线
19
1.7 其他
样本器皿的质地和洁净度，采血部位，以 及血清中过量的胆红素、脂质，样品制备 过程中的振摇等，均可引起酶活性改变。
季节
冬季气温低，血液凝固慢，血清分离时间延长， 可引起血细胞内酶释至血清，加上血清与空气 长时间接触，可使某些抑制剂遭到破坏，故冬 季测定LD的活性较夏季高。
.
20
酶的测定方法分为绝对定量法和相对定量法两大类，以后者 为主。
酶催化化学反应的能力称为酶活性（activity）。 酶活性浓度的测定受许多因素的影响。
.
2
酶活性浓度测定的主要影响因素
1. 标本及标本采集和处理因素 2. 试剂及方法学因素 3. 仪器因素的影响 4. 测定条件与参数设置
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NAD（P）H是目前使用最多的指示反应物质。
体内存在数以百计的氧化还原酶，它们的辅酶 很多是一致的。
若存在内源性代谢物，必然会相互干扰。
.
16
1.5 副反应(酶偶联法测ALT)
由于反应体系中含有大量NADH和LD，可与血 液标本中所含丙酮酸反应，引起340nm波长处 吸光度下降，从而引起ALT活性测定误差。
酶活性浓度测定的 主要影响因素及控制
.
1
酶（enzyme）
酶的应用
临床诊断酶学产生至今已有100年的历史。 用于诊断的酶类已超过100多种，常用的数十种。 酶测定约占目前临床化学总工作量的1/4到1/2。
酶的概念
是一种由活细胞产生，具有高度专一性、高度催化活性的特 殊蛋白质，又称为生物催化剂。
2. 试剂及方法学因素 的影响及控制
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21
2. 试剂及方法学的影响因素
酶的测定大多使用商品试剂盒
不同厂家酶试剂盒的测定原理、试剂配方（包 括缓冲液、底物、添加剂等）、产品质量、技 术含量等常有区别。
常见的影响因素
2.1 定时法与连续监测法 2.2 检测底物或检测产物 2.3 底物启动模式与样品启动模式 2.4 正向反应与逆向反应 2.5 试剂的干扰作用
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10
1.2 肝素
是一种粘多糖， 是对酶活性影响最小的抗凝剂， 对ALT、AST、CK、LD和ACP无影响， 适于急诊时迅速分离血浆进行测定。
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1.3 温度
由于血清清蛋白对酶蛋白有稳定作用，如 无细菌污染，某些酶（如AST、-GT和ALP 等）可在室温保存1～3天活性不受影响。
有些酶极不稳定，如血清前列腺ACP，在 37℃放置1h，活性可下降50%。
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1.标本及标本采集和处理因素 的影响及控制
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1.标本及采集和处理的影响因素
1.1 溶血 1.2 抗凝剂 1.3 温度 1.4 空气与光线 1.5 标本副反应 1.6 酶蛋白浓度 1.7 其他
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1.1 溶血
最重要的影响是RBC内酶的大量释出。
大部分酶在细胞内外浓度差异明显，且其活性 远高于血清；
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2. 酶活性测定的原理
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1.2 抗凝剂
临床上除非测定与凝血或纤溶有关的酶，一 般都应以血清作为首选测定标本。
大多数抗凝剂都在一定程度上影响酶活性，
EDTA、草酸盐和柠檬酸盐等抗凝剂，它们为金属 离子螯合剂；
在去除Ca2+同时也去除其中Mg2+、Mn2+等离子， Ca2+是AMY的激活剂，Mg2+是ALP、CK和5′-核苷 酸酶（5′-NA）的激活剂。
减少溶血的干扰
可通过设置样品对照，或使用双波长比色、连 续监测法以及改进商品试剂等措施，克服对分 光光度分析的影响。
应用血清(溶血)指数直接判断溶血程度。
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8
1.1 注意: RBC中酶的干扰
不仅表现在溶血影响上，采血后如不及时 将血清和血凝块分离，血细胞中酶同样可 以透过细胞膜进入血清，
所以，静脉采血后，必须在1～2h内及时 离心，将血清与血细胞、血凝块分离，以 免引起误差。
费时间是最经济的方法。
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18
1.6 酶蛋白浓度
酶蛋白在低浓度时易失活，可能是亚基易 解离、易吸附于容器上和易发生表面变性 之故。
酶蛋白在高浓度时较稳定，但活性过高超 过检测仪器的线性范围时，需将样品进行 稀释或减少样品用量后再行测定。
样品稀释后所测得的活性常偏高，可能与 抑制剂被稀释有关。
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